肿瘤抗原环肽

摘要

本发明涉及一种肿瘤抗原环肽，目的在于提供一种环肽及其衍生物，能够诱发免疫应答，攻击肿瘤细胞。本发明的式(I)多肽可单独使用或以药物组合物形式使用。使用方法可为口服或非肠道途径。口服途径给药制剂可为片剂，胶囊或颗粒剂等。非肠道给药制剂可为注射剂、喷雾剂、贴剂等。本发明组合物也可制成缓释制剂，如微球等。优选注射剂。

权利要求

1.一种肿瘤抗原环肽或其可药用盐，其环肽的特征在于：由以下通式(I)表示：其中X为下式(Xa)、(Xb)或(Xc)；

AA为D型或L型的天然或非天然氨基酸；

n为1-3。

2.根据权利要求1的肿瘤抗原环肽或其可药用盐，其特征在于，其中AA为亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸或精氨酸。

3.根据权利要求2的肿瘤抗原环肽或其可药用盐，其特征在于，其中AA为亮氨酸或赖氨酸。

4.根据权利要求1的肿瘤抗原环肽或其可药用盐，其特征在于，所述环肽选自下面的肽：

5.制备权利要求1的肿瘤抗原环肽或其可药用盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：i)采用固相或液相合成法制备满足权利要求1所述序列的线性肽；

ii)采用碘氧化法、空气氧化法或其它合适的氧化反应，进行二硫键环化反应，得到下式的化合物或其盐：其中X和AA各自如权利要求1定义。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤抗原环肽或其可药用盐，其特征在于，药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐或酒石酸盐。

7.根据权利要求6的肿瘤抗原环肽，其特征在于，药学上可接受的盐是醋酸盐。

8.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1-4中任一项所述的肿瘤抗原环肽或其可药用盐，和药学可接受的载体或赋形剂。

9.根据权利要求1的肿瘤抗原环肽或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌和肺癌。

说明书

肿瘤抗原环肽

技术领域

[0001] 本发明涉及环肽化合物或其盐，其对包括前列腺癌、淋巴癌、肺癌、特别是乳腺癌具有抑制作用。

[0002] 其制备方法、包含所述环肽化合物或其盐的药物组合物、以及治疗人类前列腺癌、淋巴癌、肺癌、特别是乳腺癌的方法。

背景技术

[0003] HER2/neu是表皮生长因子受体家族的成员并且编码185kd参与调节细胞生长及繁殖的酪氨酸激酶受体。在很多类型的肿瘤细胞中发现了HER/neu的过表达和/或扩增。

[0004] 通过临床研究，发现可以靶向HER2/neu的肿瘤相关抗原上的表位，进行细胞免疫应答的接种疫苗和有效免疫治疗。因为机体的免疫细胞并不是一一对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位，蛋白质抗原通过其表位来体现其免疫特异性。基于抗原分子的免疫干预手段已前进到表位水平。作为研究最为充分的HER2/neu原癌基因家族，已在其上发现了众多能够诱导免疫应答的表位序列，其中在其369-377位置的肽序列Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu(又名E75)能够刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来破坏癌细胞，用作预防和治疗肿瘤的疫苗，特别适用于乳腺癌。但是E75属于线性肽，在体内稳定性不够，容易被血浆中蛋白酶降解，并不能很有效地刺激免疫系统诱导诱导免疫反应。因此有必要对肽进行改造。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种环肽及其衍生物，能够诱发免疫应答，攻击肿瘤细胞。

[0006] 环状闭合或环化可降低体内肽的降解速率，从而大大改善它们的药物动力学性能。

[0007] 本发明的技术方案是：

[0008] 一种肿瘤抗原环肽，由以下通式(I)表示：

[0009]

[0010] 其中X为下式(Xa)、(Xb)或(Xc)；

[0011]

[0012] AA可为D型或L型的天然或非天然氨基酸。

[0013] n为同系物，优先1-3，在同一个分子中，n可以不同。

[0014] 在本发明中，具体地，

[0015] AA为亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸或精氨酸(其它带双胺的)。

[0016] 其中，优选氨基酸为亮氨酸和赖氨酸。

[0017] 根据本发明的优选实施方案，本发明环肽选自下面的肽或其药用盐：

[0018]

[0019] 本发明涉及包含至少一种式(I)多肽或其药用盐和可药用载体或赋形剂的药物组合物。

[0020] 本发明还涉及式(I)多肽或其立体异构体或其药用盐在制备治疗人类前列腺癌、淋巴癌、肺癌、特别是乳腺癌疾病药物中的用途。

[0021] 本发明线性肽的制备采用固相或液相合成方法，其中固相合成法优选Fmoc保护策略，根据所制备化合物的氨基酸序列，从C端到N端，按标准方法合成线性肽。

[0022] 本发明环肽的制备采用氧化法形成二硫键制备，可采用碘氧化法、空气氧化法或其它理论可见的氧化剂及操作。

[0023] 本发明所用术语“可药用盐”包括：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐，以及醋酸盐、草酸盐、酒石酸盐等。

[0024] 根据本发明，本发明的药物组合物可按本领域常规方法制备，例如将式(I)多肽与药用载体或赋形剂混合。本发明中所用药用载体或赋形剂通常为制药领域常用的药用载体或赋形剂。这里“常用的药物赋形剂”包括任一种或所有溶剂，分散介质，包衣，抗菌剂或抗真菌剂，等渗及缓释试剂，以及类似的生理配伍制剂，以适合静脉注射，肌肉注射，皮下注射，或其它给药方式，如口服给药。根据给药的方式，可将活性化合物包衣以保护化合物免受酸或其它自然条件的影响而失活。关于载体的例子，如盐水基及各种缓冲水溶液、乙醇或其它多元醇、脂质体、聚乳酸、乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟乙酸、胶原、聚原酸酯等。

[0025] 本发明的式(I)多肽可单独使用或以药物组合物形式使用。使用方法可为口服或非肠道途径。口服途径给药制剂可为片剂，胶囊或颗粒剂等。非肠道给药制剂可为注射剂、喷雾剂、贴剂等。本发明组合物也可制成缓释制剂，如微球等。优选注射剂。

附图说明

[0026] 图1是本发明环肽1、2、3能有效释放IFN-γ的示意图一；

[0027] 图2是本发明环肽1、2、3能有效释放IFN-γ的示意图二；

[0028] 图3是本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应示意图；

[0029] 图4是本发明线性肽和环肽1、2、3、4的消除半衰期示意图。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0031] 实施例1

[0032] S1线性肽的合成

[0033] S11取Rink Amide树脂1mmol(s＝0.6mmol NH2/g，100目，交联度为1.0％)，放入多肽合成反应器中，用DMF溶涨30min，加20％哌啶(PIP/DMF)去保护，洗涤。

[0034] S12将Fmoc保护的Cys(Trt)、HOBT用DMF完全溶解,加入DIC混合均匀，加入到反应器内进行反应。整个反应搅拌充氮，室温下进行0.5-2h。Kaiser检测偶联反应完全后，DMF洗去反应溶剂。保护氨基酸、HOBT、DIC的投料摩尔比为1:1:1。树脂和保护氨基酸的投料摩尔比为1:3。

[0035] S13依次接入Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Leu、Fmoc-Phe、Fmoc-Ala、Fmoc-Leu、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-Ile、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)。

[0036] S14抽干反应完毕后的肽树脂，称重约得5g。将肽树脂置反应器中，按1g肽树脂:10ml裂解液的比例加入裂解液(裂解液：TFA:EDT:H2O:TIS＝95:2:2:1)，室温反应2小时，砂芯过滤，收集滤液，按1:20(v/v)的比例缓慢加入到冰乙醚，沉淀30min，过滤，收集沉淀，此为线性肽1并通过质谱确认：

[0037] Cys-Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-Cys

[0038] 实施例2

[0039] S2肽的环化

[0040] S21用水溶解线性肽，使线性肽浓度至0.5mg/ml左右，搅拌下滴加I2液至氧化完全，此即得环化肽粗品溶液。

[0041] S22用低压纯化系统对环肽粗品进行初步纯化。根据各批次粗肽的含量和体积，按1g肽/50g树脂比例上样，梯度洗脱，收集目的峰，将收集溶液过0.22μm有机相滤膜、旋蒸浓缩、低温放置备用。

[0042] S23用制备液相对低压纯化液进行精制。条件如下：

[0043] 流动相A：H2O+0.1％TFA；流动相B：ACN+0.1％TFA

[0044] 流速：50ml/min；检测波长：214nm

[0045] 梯度：0～8min：5％B；

[0046] 8～33min：22％B～30％B

[0047] 33～35min：30％B～50％B

[0048] 35～43min：50％B

[0049] 分段收集组分，检测合格后，旋蒸，低温避光放置，备用。

[0050] S24精制液脱去TFA或转盐、冻干，得到所需环肽，MS鉴定产物。

[0051] S25按上述标准程序，获得环肽1：

[0052]

[0053] S26在S13基础上，最后一个接肽反应在Fmoc-Lys(Boc)后，改为引入MPR基团。将300ml DCM置于圆底烧瓶内冰浴，搅拌加入Mpr 150ml反应5min，再加入DIC 200ml搅拌反应
25min，然后将反应液加到上述连完保护氨基酸的反应器中，搅拌反应，直至茚三酮检测反应完全，停止反应，洗涤，抽干，完成后续裂解、沉淀、环化、纯化过程。获得环肽2：

[0054]

[0055] S27在S26基础上，C端氨基酸为Lys，连接Mpr，合成线性肽并制备环肽3：

[0056]

[0057] S28不通过首尾二硫键成环，首尾Lys与Leu直接通过肽键成环，合成对照肽(环肽4):

[0058]

[0059] 实施例3

[0060] S3CTL激活实验

[0061] S31为了证实合成的肿瘤抗原肽环肽在肿瘤细胞系响应中的激活,利用酶联免疫斑点法测量IFN-γ的生成,用作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活的读数。

[0062] S32靶细胞的准备

[0063] S33MCF-7乳腺癌和SBC-5小细胞肺癌，购自ATCC。

[0064] S34效应细胞的制备

[0065] S35利用商购的CD4和CD8阴性分离试剂盒(Dynal)获得1：1混合的CD4+和CD8+T细胞。将实施例1和2获得的线性肽和环肽1、2、3、4分别加入混合细胞中培养5天后，获得本发明的效应细胞。

[0066] S36酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

[0067] S37取100μl抗IFN-γ捕获抗体稀释于10ml无菌PBS中，将100μl稀释的捕获抗体等份加入PVDF板的每个孔内。4℃过夜。然后以洗涤缓冲液洗涤平板以除去捕获抗体。每孔加入100μl含2％脱脂牛奶的无菌PBS以封闭平板，将平板于室温孵育2小时，倾去平板上的脱脂牛奶。然后按照如下顺序将试验物质加入到ELISPOT平板中：

[0068] 50μl 106个细胞/ml的靶细胞(计约50,000个靶细胞/孔)。

[0069] 50μl效应细胞(计约5，000个混合的导入短肽的CD4/8+细胞/孔)。

[0070] S38平板孵育过夜。第二天将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，用纸巾轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。然后向每个孔中加入100μl初级检测抗体(人IFN-γELISPOT PVDF酶促试剂盒，Diaclone公司生产，取100μl该溶液稀释于10ml PBS和1％牛血清白蛋白中)，平板室温孵育2小时后，用洗涤缓冲液洗涤三次，用纸巾轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。向每个孔加入100μl稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶，然后将平板室温孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤三次，用纸巾轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。然后向每个孔加入100μl BCIP/NBT溶液。反应过程中用箔片覆盖平板，静置5-15分钟。在此期间定期检查平板斑点，确定终止反应的最佳时间。将平板在盛满自来水的水槽中洗涤以终止反应，将平板置于50℃干燥1小时后用免疫斑点读板机计数膜上生成的斑点，获得本发明的线性肽和环肽。

[0071] 结果如图1、2，环肽1、2、3均能有效释放IFN-γ，具备免疫反应诱导性。

[0072] 实施例4

[0073] S4表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测。

[0074] S41分组：效应细胞分为5个样品大组(环肽1、2、3、4、线性肽1)，分别以各表位肽诱导的特异性CTL为效应细胞。靶细胞：MCF-7乳腺癌和SBC-5小细胞肺癌，293细胞作为对照细胞系，购自ATCC。

[0075] S42效应细胞制备：按前述方法制备TCL表位肽诱导的特异性CTL，用含5％胎牛血清的RMPI-1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

[0076] S43LDH检测：使用Cytotox 96Non-Radioactive Cytotoxicicy Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH实验检测细胞毒活性，主要步骤如下。

[0077] S44检测板设立：

[0078] 实验组以MCF-7和SBC-5作为靶细胞(最优靶细胞数为5*103/孔)，按不同的效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效应细胞CTL，各种浓度细胞以50μl/孔接种于96孔培养板中至终体积100μl。效应细胞自发释放组：各组效应细胞以50μl/孔板，补充50μl含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μl。靶细胞自发释放组：各组靶细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μl含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μl。靶细胞最大释放组，同靶细胞自发释放组。背景对照组：加入含5％胎牛血清的RPMI-160培养基100μl；体积校正对照组：
加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μl。

[0079] S45细胞裂解及收获上清：细胞铺板后，250g离心4min，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下孵育4h。分别于靶细胞最大释放组和体积校正对照组加入裂解液(10X)，10μl/孔，45min后，250g离心4min，收获上清。

[0080] S46LDH检测：转移上清至另一96孔板，50μl/孔；迅速添加稀释的底物混合液，50μl/孔，室温避光反应30min；添加终止液终止显色反应，50μl/孔；取出孔中气泡，1h内于酶标仪检测490nm吸光值OD490。

[0081] S47计算细胞杀伤率

[0082] 杀伤率(％)＝[(实验组0D值-效应细胞自发释放组0D值-靶细胞自发释放组0D值)/(靶细胞最大释放组0D-靶细胞自发释放组0D)]X100％

[0083] 结果：如图3所示，环肽1、2、3激活的CTL对于Her2/neu表达阳性的MCF-7和SBC-5细胞均具有特异杀伤作用，而对Her2/neu表达阴性的293细胞则没有明显的杀伤作用，同时环肽1、2、3对于MCF-7细胞的杀伤作用明显优于SBC-5。

[0084] 基于上述实验结果，可知：与线性肽相比，环肽1、2、3更能明显得诱导的特异性CTL分泌IFN-γ，并对MCF-7细胞和SBC-5细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应；且对MCF-7细胞的杀伤作用明显优于SBC-5细胞，表明该肿瘤疫苗更适用于乳腺癌。

[0085] 实施例5

[0086] S5血浆消除半衰期测定。

[0087] 为了证实合成的肿瘤抗原环肽具有较长的半衰期,利用LC/MS/MS法检测实施例1和2获得的线性肽和环肽1、2、3、4在图上的消除半衰期数据。

[0088] LC/MS/MS方法学建立，Finnigan TSQ Discovery Max液质联用仪，配以Surveyor HPLC系统，检测限为1-1000ng/mL，回收率大于70％。

[0089] S51取新西兰兔，静脉注射0.5mg/kg实施例1和2获得的线性肽和环肽。分别在5、10、15、30、60、120、180、240、300分钟分别取血样1.0mL于抗凝管，10000rpm离心，分离出血浆，-20℃冷冻保存直至测定。

[0090] S52利用LC/MS/MS法测定线性肽和环肽的血药浓度。取血浆(空白血浆、含药血浆或给药后血浆)100μl,加入含IS 2000ng/ml乙腈：甲醇(70:30)的混合溶剂500μl，振荡，12000rpm离心10min，上清液转移到试管中，40℃以下N2吹干，残留物加100μl MP复溶，
12000rpm离心5min，上清液进样20μl。进行LC/MS/MS分析。用3p97药代动力学计算程序计算出主要药代动力学参数。

[0091] 测定结果显示，实施例1获得的线性肽，消除半衰期为44±8min左右，实施例1获得的环肽1、2、3、4，消除半衰期分别为123±15min、113±18min、105±10min、89±9min左右，环肽1、2、3较之文献报道的E75大鼠消除半衰期小于1h有明显改善。环肽形成的封闭结构，能较好地抵抗血浆中蛋白酶的作用，可维持原药形式，使之更好地传送到靶点产生效应。

[0092] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。