一种焦糖色素中副产物4‑甲基咪唑和2‑乙酰基‑4‑羟基‑丁基咪唑的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析。该方法具有快速检测，高灵敏度、准确度高等优点。
1.一种焦糖色素中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析，其特征在于，其中步骤(1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：(a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1g，准确至0.001g，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，取0.1mL上述样品溶液，加入0.02moL/L的盐酸溶液0.1mL，加入1.0μg/mL的D6-4-MEI内标溶液0.2mL，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化；
(b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg、3mL，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化；
(c)固相萃取：将(a)制备好的样品溶液加入(b)中刚活化好的小柱中，控制流速小于
0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液2mL洗脱收集，所述洗脱液为氨水+甲醇＝5+95，v/v，控制流速小于0.5mL/min，抽干，将收集液在低于50℃条件下，氮气吹干，残渣用0.5mL溶液定容，所述溶液为氨水+乙腈+水＝0.05+5+
94.95，v/v，涡旋混合1min，过0.22μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量；
(a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)、2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)和D6-4-甲基咪唑(D6-4-Methylimidazole，D6-4-MEI)标准品，用水溶解，分别配成0.5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液；
(b)用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源(ESI)测定待测样品溶液和标准品溶液，仪器参考条件如下：液相色谱条件
色谱柱：Polaris C18-A柱，2.1mm×150mm，3μm；
流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈；梯度洗脱条件为：0～5.0min，95％A，5％B，流速
0.4mL/min；5.1min，95％A，5％B，流速0.4mL/min；10.0min，60％A，40％B，流速0.4mL/min；
10.1～12.0min，95％A，5％B，流速0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；
质谱检测器条件：电离方式：H-ESI电离，正离子；离子喷雾电压：正离子4000v；挥发气温度：400℃；毛细管温度：270℃；鞘气：60Arb；辅助气：15Arb；碰撞气：氩气；扫描模式：多反应监测(MRM)，各离子参数如下：；
测定定量子离子峰面积，D6-4-MEI为内标，然后作4-MEI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值同4-MEI浓度的标准曲线，THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值同THI浓度的标准曲线，曲线方程见式(1)：y＝ax+b·········(1)
式中：x——4-MEI或THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值；
y——4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
(a)试样溶液的测定：待测试样溶液中4-MEI或THI的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析；
(b)定性判定：按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液变化范围在±2.5％之内；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过定性离子相对丰度的最大允许偏差，则可判断样品中存在目标化合物4-MEI或THI；所述定性离子相对丰度的最大允许偏差为：(c)分析结果的表述：
X＝(C-C0)*V*10/m/10……………………………………(2)式中：
X——试样中4-MEI或THI的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
C——由标准曲线查得试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
C0——由标准曲线查得空白试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
焦糖色素中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑
的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种焦糖色素中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，属于食品安全检测的检验方法。
背景技术
[0002] 4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)是III和IV类焦糖色素生产加工过程中美拉德反应(Maillard browning model systems)产生的一种副产物,有研究显示，其能够诱发肿瘤。欧洲食品安全局(EFSA)报道称，III类焦糖色素在生产加工过程中还会产生2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)，该物质具有免疫毒性。
[0003] 目前，对焦糖色素中4-MEI含量的测定，我国唯有食品添加剂焦糖色素国家标准GB 8817-2001，焦糖色素中THI的测定没有国家标准。国际上，世界粮农组织/WTO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)焦糖色素质量规格JECFA-2011中4-MEI和THI分别采用气相色谱和液相色谱的衍生化方法分别检测。根据文献检索，现有的焦糖色素中副产物4-MEI和THI的测定方法大约有以下几种：薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、气-质联用技术、液-质联用技术。其中前几种技术大都需要较复杂的前处理技术，这对于大量的样品分析是十分不利的。液相色谱法紫外检测器可同时检测两种物质，由于灵敏度的限制，如此复杂的样品基质相对较大的取样量对前处理技术的要求非常高。因此，当前迫切需要建立能够快速准确测定焦糖色素中副产物4-MEI和THI的检测方法。
发明内容
[0004] 1.本发明的目的在于提供一种焦糖色素中副产物4-MEI和THI同时检测的方法，该方法包括如下步骤：
[0005] (1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析。
[0006] (1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：
[0007] (a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1g(准确至0.001g)，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.1mL上述样品溶液，加入0.1mL盐酸溶液(0.02moL/L)，加入0.2mL内标溶液D6-4-甲基咪唑(D6-4-Methylimidazole，D6-4-MEI，1.0μg/mL)，加水定容至
2mL，混匀后待固相萃取净化。
[0008] (b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg、3mL，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
[0009] (c)固相萃取：将(a)制备好的样品溶液加入(b)中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液(氨水+甲醇＝5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0.5mL/min，抽干。将收集液在低于50℃条件下，氮气吹干，残渣用0.5mL溶液(氨水+乙腈+水＝0.05+5+94.95(v/v))定容，涡旋混合1min，过0.22μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。
[0010] 本发明的实施方案中，步骤(a)中称量1g样品定容到100mL水中，取0.1～0.2mL样品溶液准备固相萃取，优选0.1mL，上样溶液加水定容至2～3mL，优选2mL。
[0011] 本发明的实施方案中，步骤(c)中1～2mL水和1～2mL甲醇淋洗，优选1mL水和1mL甲醇淋洗，优选2mL洗脱液洗脱。收集液可以在低于50℃条件下吹干或者旋转浓缩挥干，残渣加入定容溶液后需要涡旋1min或者超声波30秒溶解并过0.22μm水系微孔滤膜。
[0012] (2)样品检测包括如下具体步骤：
[0013] (a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-MEI、THI和D6-4-MEI标准品，用水溶解，分别配成0.5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。
[0014] (b)用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源(ESI)测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：
[0015] 液相色谱条件
[0016] 色谱柱：Polaris C18-A柱(2.1mm×150mm,3μm)。
[0017] 流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈。梯度洗脱条件见表1
[0018] 柱温：30℃
[0019] 进样量：10μL
[0020] 流速：0.4mL/min
[0021] 表1液相梯度洗脱条件
[0022]
[0023] 质谱检测器条件：
[0024] 电离方式：H-ESI电离，正离子
[0025] 离子喷雾电压：正离子4000v
[0026] 挥发气温度：400℃
[0027] 毛细管温度：270℃
[0028] 鞘气：60Arb
[0029] 辅助气：15Arb
[0030] 碰撞气：氩气
[0031] 扫描模式：多反应监测(MRM)，各离子参数详见表2
[0032] 表2多反应监测(MRM)
[0033]
[0034] 测定各化合物定量子离子峰面积，D6-4-MEI为内标，然后分别作4-MEI(THI)与内标的峰面积比—4-MEI(THI)浓度(ng/mL)标准曲线，曲线方程见式(1)：
[0035] y＝ax+b·········(1)
[0036] 式中：x——4-MEI或THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值；
[0037] y——4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。
[0038] (3)结果分析包括如下具体步骤：
[0039] (a)试样溶液的测定：待测试样溶液中4-MEI或THI的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
[0040] (b)定性判定：按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在目标化合物4-MEI或THI。
[0041] 表3定性离子相对丰度的最大允许偏差
[0042]
[0043] (c)分析结果的表述：
[0044] 试样中4-MEI(THI)含量按公式(2)计算：
[0045] X＝(C-C0)×V×103/m/106……………………………………(2)
[0046] 式中：
[0047] X——试样中4-MEI或THI的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
[0048] C——由标准曲线查得试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
[0049] C0——由标准曲线查得空白试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
[0050] V——试样制备液总体积，单位为毫升(mL)；
[0051] m——试样质量，单位为克(g)；
[0052] 结果保留三位有效数字。
[0053] 本发明检测方法的可行性证实：
[0054] 配制浓度分别为0.010μg/mL、0.020μg/mL、0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL和1.0μg/mL的4-MEI和THI标准工作液，在优化的前处理方法和分离检测条件下进行线性范围试验，4-MEI和THI线性相关系数可达到0.9994和0.999以上。
[0055] 方法的检出限和定量限是衡量方法灵敏度的指标。本方法检出限以3倍信号与噪声之比所对应的浓度为理论检出限，以10倍信号与噪声之比所对应的浓度为理论定量限。根据计算得到的理论检出限浓度和理论定量限浓度，配制成一系列的标准工作溶液上机，以实际情况确定实际检出限浓度和实际定量限浓度。
[0056] 此方法4-MEI和THI理论检出限和理论定量限浓度分别为0.001μg/mL、0.003μg/mL。配制成实际的标准工作溶液上机，根据实际情况确定可接受的检出限和定量限浓度分别为0.003μg/mL、0.010μg/mL。所以当取样为1mg时，经前处理后最终定容到1.0mL，得到的检出限为3mg/kg，定量限为10mg/kg。
[0057] 样品加标回收率测定：
[0058] 采用本发明的焦糖色素中副产物4-MEI和THI的检测方法，在焦糖色素中添加三个浓度水平(见表4，10mg/kg、20mg/kg、200mg/kg)4-MEI和THI的混合标准溶液进行加标回收率实验，实验步骤同样品检测步骤，每个浓度重复6次，结果见表4，4-MEI和THI的加标回收率分别在88.3～103.5％和85.3～101.7％之间。
[0059] 表4方法的准确度实验
[0060]
[0061] 本发明检测焦糖色素中副产物4-MEI和THI的方法对于焦糖色素能够有效的分离净化，测定结果准确可靠。
附图说明
[0062] 图1为加THI和4-MEI标准溶液的LC-MS/MS多反应监测质量色谱图
[0063] 图2为焦糖色素样品的LC-MS/MS多反应监测质量色谱图
[0064] 在附图中，横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为相对丰度。
[0065] 其中图1、图2中
[0066] 1.4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)；2.D6-4-甲基咪唑(D6-4-Methylimidazole，D6-4-MEI)；3.2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)
具体实施方式
[0067] 实施例
[0068] (1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：
[0069] (a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1g(准确至0.001g)，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.1mL上述样品溶液，加入0.1mL盐酸溶液(0.02moL/L)，加入0.2mL内标溶液(D6-4-MEI，1.0μg/mL)，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。
[0070] (b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg、3mL，或相当者。使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
[0071] (c)固相萃取：将(a)制备好的样品溶液加入(b)中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液(氨水+甲醇＝5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0.5mL/min，抽干。将收集液在低于50℃条件下，氮气吹干，残渣用0.5mL溶液(氨水+乙腈+水＝0.05+5+94.5(v/v))定容，涡旋混合1min，过0.22μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。
[0072] (2)样品检测包括如下具体步骤：
[0073] (a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-MEI、THI和D6-4-MEI标准品，用水溶解，分别配成0.5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。
[0074] (b)用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源(ESI)测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：
[0075] 液相色谱条件
[0076] 色谱柱：Polaris C18-A柱(2.1mm×150mm,3μm)。
[0077] 流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈。梯度洗脱条件见表1
[0078] 柱温：30℃
[0079] 进样量：10μL
[0080] 流速：0.4mL/min
[0081] 质谱检测器条件：
[0082] 电离方式：H-ESI电离，正离子
[0083] 离子喷雾电压：正离子4000v
[0084] 挥发气温度：400℃
[0085] 毛细管温度：270℃
[0086] 鞘气：60Arb
[0087] 辅助气：15Arb
[0088] 碰撞气：氩气
[0089] 扫描模式：多反应监测(MRM)，各离子参数详见表2
[0090] 测定各化合物定量子离子峰面积，D6-4-MEI为内标，然后分别作4-MEI(THI)与内标的峰面积比—4-MEI(THI)浓度(ng/mL)标准曲线，曲线方程见式(1)：
[0091] y＝ax+b·········(1)
[0092] 式中：x——4-MEI或THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值；
[0093] y——4-MEI或THI的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。
[0094] 用上述方法对任意焦糖色素样品进行检测，检测结果如下表5。
[0095] 表5样品检测结果
[0096]
