产松二糖菌株及其用途

摘要

本发明涉及一种能够产生松二糖的普城沙雷菌菌株并且涉及其用途。

权利要求

1.一种普城沙雷菌(Serratia plymuthica)菌株，在2012年3月7日在编号I-4604下存放于CNCM[法国国家微生物菌种保藏中心]中。

2.如在权利要求1中所述的菌株，其特征在于它能够以至少20％、30％、40％或50％的松二糖/蔗糖重量收率产生松二糖。

3.在权利要求1至2中任一项所述的菌株用于生产松二糖的用途。

4.一种用于生产松二糖的方法，该方法包括培养如在权利要求1至2中任一项所述的菌株并且回收松二糖，以及任选地纯化松二糖。

5.如在权利要求4中所述的方法，其特征在于将该菌株在5.5与7之间的pH下，从0.5至

1.5vvm的曝气下，在250与700rpm之间的搅拌条件下，并且在从25℃至38℃的温度下进行培养。

6.如在权利要求4中所述的方法，其特征在于将该菌株在维持为6的pH，从27℃至30℃的温度，250与350rpm之间的搅拌条件，以及1vvm的曝气下进行培养。

7.如在权利要求4中所述的方法，其中在该生产培养基中的起始蔗糖浓度在100与

300g/l之间。

8.如在权利要求4中所述的方法，其中在该生产培养基中的起始蔗糖浓度为200g/l。

9.如在权利要求4中所述的方法，其中该生产培养基包括2至6g/l的酵母提取物或10至

30g/l的索罗斯(Solulys)048E。

10.如在权利要求4中所述的方法，其中该生产培养基包括4g/l的酵母提取物。

11.如在权利要求4中所述的方法，其中松二糖的纯化包括一个发酵果汁离心步骤，用粉末状炭黑处理和上清液的过滤的步骤，一个除盐步骤，一个用1kD的截留阈值进行超滤的步骤，以及然后的一个滤液结晶步骤。

12.一种借助如在权利要求4中所述的方法获得的富松二糖组合物，该组合物包括按DP2的总重量计至少80％的松二糖、按DP2的总重量计0.01％至10％的海藻酮糖以及按DP2的总重量计0.01％至5％的异麦芽酮糖。

13.一种用于制备食品组合物的方法，该方法包括提供一种借助如在权利要求4中所述的方法获得的富松二糖组合物并且将所获得的组合物掺入进该食品组合物中，所述富松二糖组合物包括按DP2的总重量计至少80％的松二糖、按DP2的总重量计0.01％至10％的海藻酮糖以及按DP2的总重量计0.01％至5％的异麦芽酮糖。

14.一种用于制备借助如在权利要求4中所述的方法获得的富松二糖组合物的方法，目的在于食品、化妆品、药物、诊断及植物检疫领域，所述富松二糖组合物包括按DP2的总重量计至少80％的松二糖、按DP2的总重量计0.01％至10％的海藻酮糖以及按DP2的总重量计

0.01％至5％的异麦芽酮糖。

说明书

产松二糖菌株及其用途

发明领域

[0001] 本发明涉及一种产松二糖菌株并且涉及其用途。

[0002] 发明的技术背景

[0003] 松二糖是一种蔗糖同分异构体，包括经由一个α(1→3)键连接的一个葡萄糖单元和一个果糖单元。它是蜂蜜的一种典型糖，在蜂蜜中它以通常在0与3％之间的低量存在。

[0004] 例如，它可以通过松三糖的部分水解产生，从而产生葡萄糖和松二糖的等摩尔混合物(CS240545)。另外，它还可以通过嗜热脂肪芽孢杆菌的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶对淀粉与果糖的混合物的作用而产生(JP 5252974/93；Shibuya(涉谷)等人，2004，J.Appl.Glycosci.(应用糖类科学杂志)，51，223-227)。收率仅为45％并且该方法包括两个酶步骤。

[0005] 最终，提议使用来源于多糖奈瑟球菌(NpAS)的重组淀粉蔗糖酶将蔗糖转化为松二糖(Wang(王)等人，2012，Food Chemistry(食品化学)，132，773-779)。收率为56％并且该方法需要一种重组酶。

[0006] 本领域的普通技术人员已知松二糖：

[0007] -具有0.5的相对较弱的甜化能力(将蔗糖值指定为1)和低的致龋性，[0008] -可以容易地结晶，

[0009] -是高度可溶的。

[0010] 另外，松二糖是一种α-葡糖苷酶抑制剂，在蓬普氏病(Pomp’s disease)的诊断中是有用的。

[0011] 它在食品、化妆品、药物和诊断领域中也是引人关注的。

[0012] 松二糖还是一种信息分子。与其他单糖一起，松二糖因此已经被用于模拟光合作用中的不同蔗糖信号传导途径。

[0013] 松二糖还可能涉及在植物防御机制中，经由MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)的活化产生防御性物质。

[0014] 因此，用于产生松二糖的替代性方法是有用且令人希望的，特别是在工业水平具竞争性的方法。

[0015] 发明概述

[0016] 急于研发一种比现有技术中描述的那些有效得多且便宜得多的生产方法，在其研究过程中，本申请公司已经鉴定了一种具有产松二糖能力的新颖菌株。

[0017] 本发明因此涉及一种能够产生松二糖的普城沙雷菌细菌菌株。这一菌株在2012年3月7日在编号I-4604下存放于CNCM[法国国家微生物菌种保藏中心(National Collection of Microorganism Cultures)]中。

[0018] 它还涉及一种普城沙雷菌菌株，其特征在于它能够产生松二糖，并且其特征还在于它通过I-4604菌株的培养、诱变或遗传修饰获得自所述菌株。

[0019] 优选地，根据本发明的普城沙雷菌菌株能够以至少20％、30％、40％或50％的松二糖/蔗糖重量收率产生松二糖。

[0020] 本发明涉及一种用于生产松二糖的方法，该方法包括培养根据本发明的菌株并且回收松二糖，以及任选地纯化松二糖。

[0021] 优选地，将该菌株在5.5与7之间的pH下，从0.5至1.5vvm的曝气下，在250与700rpm之间的搅拌条件下，并且在从25℃至38℃的温度下进行培养。以另外优选的方式，将该菌株在维持为6的pH，从27℃至30℃的温度，250与350rpm之间的搅拌条件，以及1vvm的曝气下进行培养。

[0022] 优选地，在生产培养基中的起始蔗糖浓度在100与300g/l之间，优选是200g/l。

[0023] 在一个具体实施例中，该生产培养基包括2至6g/l的酵母提取物或10至30g/l的玉米浆(例如由本申请公司出售的 ( 048E)，优选是大约4g/l的酵母提取物。优选地，松二糖的纯化包括一个发酵果汁离心(fermentation must centrifugation)步骤，用粉末状炭黑处理和上清液的过滤的步骤，一个除盐步骤，一个用1kD的截留阈值进行超滤的步骤，以及然后的一个滤液结晶步骤。

[0024] 本发明还涉及一种能够获得或借助根据本发明的方法获得的富松二糖组合物。优选地，它包括按DP2的总重量计至少80％的松二糖、按DP2的总重量计0.01％至10％的海藻糖以及按DP2的总重量计0.01％至5％的异麦芽酮糖。

[0025] 本发明涉及一种用于制备食品组合物的方法，该方法包括提供借助根据本发明的方法获得的松二糖并且将获得的松二糖掺入进食品组合物中。本发明还涉及一种用于制备食品组合物的方法，该方法包括提供借助根据本发明的方法获得的富松二糖组合物并且将获得的组合物掺入进食品组合物中。

[0026] 最终，本发明涉及一种用于制备能够获得或借助根据本发明的方法获得的富松二糖组合物的方法，目的在于食品、化妆品、药物、诊断及植物检疫领域。

[0027] 发明详细说明

[0028] 完全出人意料地，本申请人已经成功地在来源于土壤采样活动的非常大量的微生物中鉴定并分离了一种能够有效地产生松二糖的菌株。

[0029] 被鉴定的菌株是一种普城沙雷菌细菌并且在此被叫做I-4604。它在编号I-4604下于2012年3月7体提交于CNCM。随后可以将这一菌株在本申请中指定为“I-4604”。

[0030] 这一菌株具有大量产生松二糖的有利特性。的确，它使得以超过35％的松二糖/蔗糖重量收率获得松二糖成为可能。更确切地说，当使用糖蜜基质时，观察到大约38％的平均松二糖/蔗糖收率。当使用蔗糖基质时，这一收率增加至超过50％。

[0031] 相对于其产松二糖能力，这一菌株绝对是独创的。的确，诸位发明人还已经测试了同一属的三种菌株，即普城沙雷菌ATCC 15928、无花果沙雷菌GRIMONT 4024、以及无花果沙雷菌DSM 4569。通过比较测试的这些菌株都没有显示出产生松二糖的丝毫能力。

[0032] 因此，本发明涉及该I-4604菌株并且涉及例如通过其培养、基因工程化或诱变来源于这一菌株的细菌，该细菌保留产松二糖特性。诱变可以是位点定向的和/或随机的。具体地说，根据本发明的普城沙雷菌菌株具有以至少20％、30％、40％或50％的松二糖/蔗糖重量收率产生松二糖的能力。优选地，收率是至少30％。

[0033] 本发明涉及一种组合物，该组合物包括一种根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)以及任选地一种培养基。优选地，该培养基适于由根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)生产松二糖。具体地说，这一培养基包括蔗糖。理想地，它包括大约100至300g/l、大约100至200g/l或大约200g/l的蔗糖。更确切地说，该培养基可以包括蔗糖并且还有酵母提取物和/或玉米浆(例如由本申请公司出售的 048E)。

[0034] 在本文件中应该理解的是，术语“大约”意指±10％，优选是±5％。例如，对于100的值，“大约100”意指在90与110之间，优选在95与105之间。

[0035] 本发明涉及根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)在发酵反应中的用途。具体地说，本发明涉及根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)用于生产松二糖的用途。

[0036] 本发明还涉及一种用于生产松二糖的方法，该方法包括培养根据本发明的菌株并且回收松二糖，以及任选地纯化松二糖。具体地说，该菌株的培养在蔗糖的存在下，在适于生产松二糖的发酵条件下进行。

[0037] 优选地，在生产或发酵步骤之前，该菌株已经经受预培养和传代培养步骤。预培养和传代培养基包括蔗糖，例如从大约50至150g/l的蔗糖，优选大约100g/l。这些培养基还包括营养素。具体地说，它们可以包括酵母提取物和/或玉米浆(例如由本申请公司出售的048E)。

[0038] 例如，它们可以包括5-15g/l的酵母提取物和/或5至30g/l的 048E。具体地说，它们可以包括大约10-15g/l的酵母提取物，或大约10-15g/l的酵母提取物和大约5g/l的 048E，或大约30g/l的 048E。在一个优选实施例中，它们包括大约10-15g/l的酵母提取物。预培养和传代培养步骤在从25℃至38°，优选从27℃至30℃，并且特别是在大约30℃的温度下进行。预培养步骤可以持续从10至30h，优选大约15至25h。传代培养步骤可以持续从5至25h，优选大约10至20h。起始pH可以在大约5.5与大约7之间。在一个优选实施例中，起始pH是大约7。搅拌可以在大约100与200rpm(每分钟转数)之间。它优选是大约150和170rpm。

[0039] 优选地，蔗糖以大约100与大约300g/l之间的初始浓度存在于生产培养基中。优选地，它以大约100至200g/l的初始浓度存在。在一个优选实施例中，它以大约200g/l的初始浓度存在。可以将蔗糖以纯化形式或以糖蜜的形式添加。可以在生产或发酵的开始，在生产或发酵过程中若干次，或在生产或发酵过程中连续地将其添加至培养基中。在一个优选实施例中，在生产或发酵的开始将其添加至培养基中。

[0040] 关于pH条件，在松二糖生产的优化过程中，已经确定pH可以在大约5.5与7之间，优选在大约5.5与大约6.5之间，甚至更优选在大约6处。优选地，在生产步骤中维持pH。在一个实施例中，在生产步骤过程中，将pH维持在大约pH 6处。

[0041] 关于搅拌条件，伴随搅拌，特别是伴随在大约250与大约700rpm之间，优选在300与500rpm之间的搅拌进行培养。可以使用磁力棒或本领域的普通技术人员已知的任何其他手段进行搅拌。在一个实施例中，伴随大约300rpm的搅拌进行培养。

[0042] 关于曝气条件，伴随从0.5至1.5vvm(每分钟每体积的空气量)的曝气进行培养。在一个实施例中，伴随大约1vvm的曝气进行培养。

[0043] 关于温度条件，在大约25℃与大约38℃之间的温度下进行培养。在一个实施例中，在27℃与30℃之间的温度下进行培养。

[0044] 在一个具体实施例中，该生产培养基包括2至6g/l的酵母提取物或10至30g/l的048E，优选是大约4g/l的酵母提取物。

[0045] 可以通过受限于蔗糖的总消耗的最大时间段确定培养时间段。优选地，生产培养持续至少20h，典型地超过30h。在一个优选实施例中，生产培养持续在30与50h之间，优选是大约40h。

[0046] 优选地，在观察如以上详细描述的一个或多个发酵条件的同时进行生产步骤。优选地，观察所有条件。

[0047] 发酵步骤后，可以通过本领域的普通技术人员本身已知的任何方法从发酵培养基中回收生物质；例如，可以通过微过滤或离心，或经由用水溶液的连续浓度-稀释物洗涤来从发酵罐中提取生物质并简单浓缩。

[0048] 松二糖收获步骤后，该方法可以包括一个松二糖纯化步骤。这一纯化步骤可以包括一个发酵果汁离心步骤，回收上清液。这一上清液可以经受另外的纯化步骤。这些纯化步骤可以选自炭黑处理步骤、过滤步骤、超滤步骤、除盐步骤、结晶步骤及其组合。在一个具体实施例中，纯化包括一个炭黑处理步骤、一个过滤步骤、一个除盐步骤、一个用1kD的截留阈值进行超滤的步骤以及一个结晶步骤。在一个优选实施例中，它包括这些以其出现在列表中的顺序进行的步骤。

[0049] 本发明还涉及一种能够获得或通过根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)的发酵获得的发酵性来源的松二糖。因此，本发明涉及能够获得或借助根据本发明的生产方法获得的松二糖。

[0050] 本发明还涉及一种富松二糖组合物，该松二糖能够获得或通过根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)的发酵，或换言之，借助根据本发明的生产方法获得。这一组合物包括按DP2的总重量计至少80％的松二糖，优选至少85％、90％或95％。术语“DP2”旨在意指“二糖”。该组合物还可以包括海藻糖和/或异麦芽酮糖。海藻糖优选以按DP2的总重量计在0.01％与10％之间的比例存在于该组合物中。异麦芽酮糖优选以按DP2的总重量计在0.01％与5％之间的比例存在于该组合物中。优选地，该组合物包括海藻糖和异麦芽酮糖。其他杂质也可以存在，例如葡糖化甘油酸、果糖、2-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸和/或葡糖化乳酸。

[0051] 松二糖在食品工业中是特别有用的。具体地说，可以将其掺入进饮料、糖果产品、谷物棒、巧克力味产品等中。因此，本发明涉及一种食品组合物，该食品组合物包括一种富松二糖组合物，该松二糖能够获得或通过根据本发明的普城沙雷菌菌株(特别是I-4604菌株)的发酵获得。

[0052] 最终，本发明涉及一种用于制备食品组合物的方法，该方法包括提供借助根据本发明的方法获得的松二糖并且将获得的松二糖掺入进食品组合物中。优选地，该食品组合物是一种饮料、糖果产品、谷物棒或巧克力味产品。

[0053] 在食品、化妆品、药物、诊断及植物检疫领域中利用这一组合物也是可能的。

[0054] 借助以下意在示意性的且非限制性的实例将更加清楚地理解本发明。

[0055] 实例

[0056] 实例1-通过I-4604菌株从蔗糖生产松二糖以及与同一属和种的菌株的比较[0057] 用在本发明中鉴定的I-4604菌株并且用同一属和种的其他菌株测试从蔗糖发酵松二糖，特别是以下菌株：

[0058] 普城沙雷菌ATCC 15928

[0059] 无花果沙雷菌GRIMONT 4024

[0060] 无花果沙雷菌DSM 4569

[0061] 1.结果

[0062] 1.1.用I-4604菌株进行发酵

[0063]

[0064] c＝消耗的；p＝产生的

[0065] 基于两个甜菜糖蜜基质发酵的平均重量收率是37.9±0.2％。其生产力是1.4±0.05g/l/h。

[0066] 在最好的三个蔗糖基质发酵(表1中的粗体)的基础上获得的性能水平如下：

[0067] -重量收率：48.2±1.5％

[0068] -松二糖效价：99.3±3.5g/l(对于200g/l的蔗糖基质)

[0069] -生产力：2.55±0.1g/l/h

[0070] 在39h的发酵中消耗了所有蔗糖。在分析过程中应该注意的是，I-4604菌株不产生葡糖酸。

[0071] 当在开始时未调节pH的情况下培养I-4604菌株时，重量收率似乎更大(在14h的发酵后，pH降至5)。

[0072] 1.2.用ATCC 15928参比菌株进行发酵

[0073]

[0074] c＝消耗的；p＝产生的

[0075] 在与I-4604相同的条件下，这一菌株完全不产生任何松二糖。在另一方面，如文献中表明，它产生异麦芽酮糖和少量的海藻糖(Kawaguti(川口)等人，Food chemistry(食品化学)，2010 120，第3期)。

[0076] 1.3.用其他测试的无花果沙雷菌菌株GRIMONT 4024和DSM 4569进行发酵[0077] 它们显示出类似于普城沙雷菌的生长，但是既不产生松二糖也不产生异麦芽酮糖。

[0078] 2.结论

[0079] 在相同的发酵条件下，一式三份地测试这些菌株。获得的结果如下：

[0080]

[0081] 将I-4604菌株与若干沙雷氏菌菌株比较，在相同的生产条件下，在蔗糖基质上测试所有菌株。只有I-4604菌株产生松二糖。

[0082] 3.材料与方法

[0083] 程序

[0084] 样品制备包括三个步骤：一个复苏步骤，一个预培养步骤以及一个传代培养步骤。复苏包括该菌株在琼脂培养基上的三个连续的传代培养。在160rpm和30℃下，在预培养培养基中将预培养进行16h。在160rpm和30℃下，在传代培养培养基中将传代培养进行9h。

[0085] 接下来，在DASGIP生物反应器中以1500ml的起始体积进行发酵步骤。在用5N氢氧化钠将pH维持在6的同时，发酵在300rpm下，在1vvm(每分钟每体积的空气量)(90l/h)下持续39h。

[0086] 培养基的组成

[0087] 琼脂培养基

[0088] 蔗糖：_________________________________________40g/l

[0089] 048E：__________________________________20g/l

[0090] 蛋白胨(碧迪公司(Becton Dickinson))：___________10g/l

[0091] 琼脂(百奥卡诊断公司(Biokar Diagnostics))：____20g/l

[0092] 渗透水(Osmosed water)：_____________________qs_1000ml

[0093] 用NaOH将pH校正至7

[0094] 在120℃下，灭菌20min

[0095] 预培养培养基

[0096] 蔗糖：_____________________100g/l

[0097] 在0.22μm下，过滤灭菌

[0098] 酵母提取物：______________________9.7g/l

[0099] 将pH校正至7.0(用NaOH)/在120℃下，灭菌20min

[0100] 1滴消泡剂

[0101] 接种物：起始自第3次传代培养的一个10μl环

[0102] 传代培养培养基

[0103] 同预培养培养基

[0104] 接种物：10％的预培养物(15ml)

[0105] 生产培养基

[0106] 1.蔗糖基质

[0107] 蔗糖______________________200g/l

[0108] 在0.22μm下，过滤灭菌

[0109] 酵母提取物：___________________4.2g/l

[0110] 将pH校正至7.0(用NaOH)/在120℃下，灭菌20min

[0111] 10滴消泡剂

[0112] 2.甜菜糖蜜基质(84.1％DP2)

[0113] 甜菜糖蜜____________________357g

[0114] 在0.22μm下，过滤灭菌

[0115] 酵母提取物：________________4.2g/l

[0116] 将pH校正至7.0(用NaOH)/在120℃下，灭菌20min

[0117] 10滴消泡剂

[0118] 接种物：6％传代培养物(90ml)

[0119] 实例2-用I-4604菌株生产松二糖条件优化蔗糖基质

[0120] 在生产步骤过程中，分开测试若干搅拌、曝气和pH条件。预培养、传代培养及生产培养基与实例1中相同。在2l发酵罐中进行优化。

[0121] 搅拌的影响

[0122] 在300、500及700rpm下对搅拌进行测试，其他参数是30℃、1vvm以及调节在6处的pH。结果如下。

[0123] 300rpm

[0124]时间(h) 0 15 22.5 39.5
蔗糖(g/l) 198.1 74.2 33.9 2.3
松二糖(g/l) 3 76 98.3 113.8
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.26 5.37 1.86

[0125]产生的松二糖(g/l/h) - 4.87 2.97 0.91
松二糖收率(％) - - 58.04 -

[0126] 500rpm

[0127]时间(h) 0 15 22.5 39.5
蔗糖(g/l) 193.2 68.5 32.1 4.7
松二糖(g/l) 2.8 70.8 90.7 103.1
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.31 4.85 1.61
产生的松二糖(g/l/h) - 4.53 2.65 0.73
松二糖收率(％) - - 54.56 -

[0128] 700rpm

[0129]时间(h) 0 15 22.5 39.5
蔗糖(g/l) 202.2 67.3 31.9 4.6
松二糖(g/l) 2.8 72.8 93.1 107.7
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.99 4.72 1.61
产生的松二糖(g/l/h) - 4.67 2.71 0.86
松二糖收率(％) - - 53.02 -

[0130] 曝气的影响

[0131] 在0.5、1及1.5vvm下对曝气进行测试，其他参数是30℃、300rpm以及调节在6处的pH。结果如下。

[0132] 0.5vvm

[0133]时间(h) 0 14.25 22.75
蔗糖(g/l) 196.2 64.1 19.7
松二糖(g/l) 3.3 74.4 100
消耗的蔗糖(g/l/h) - 9.27 5.22
产生的松二糖(g/l/h) - 4.99 3.01
松二糖收率(％) - - 54.79

[0134] 1vvm

[0135]时间(h) 0 14.25 22.75
蔗糖(g/l) 189.6 74.3 26.8
松二糖(g/l) 2.9 71.3 98.9
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.09 5.59
产生的松二糖(g/l/h) - 4.80 3.25
松二糖收率(％) - - 58.97

[0136] 1.5vvm

[0137]时间(h) 0 14.25 22.75
蔗糖(g/l) 201.6 74.7 26.3
松二糖(g/l) 3.5 76.3 104.4
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.91 5.69
产生的松二糖(g/l/h) - 5.11 3.31
松二糖收率(％) - - 57.56

[0138] pH的影响

[0139] 在5.5、6及6.5下对pH进行测试，其他参数是30℃、300rpm及1vvm。结果如下。

[0140] 调节在5.5处的pH

[0141]时间(h) 0 15 23
蔗糖(g/l) 194.3 74.7 32.8
松二糖(g/l) 3.7 69.4 89.9
消耗的蔗糖(g/l/h) - 7.97 5.24
产生的松二糖(g/l/h) - 4.38 2.56
松二糖收率(％) - - 53.37

[0142] 调节在6处的pH

[0143]时间(h) 0 15 23
蔗糖(g/l) 198.1 62.2 24.3
松二糖(g/l) 3.4 82.5 105
消耗的蔗糖(g/l/h) - 9.06 4.74
产生的松二糖(g/l/h) - 5.27 2.81
松二糖收率(％) - - 58.46

[0144] 调节在6.5处的pH

[0145]时间(h) 0 15 23
蔗糖(g/l) 197.9 64.2 27.2
松二糖(g/l) 3.5 77.1 99.7
消耗的蔗糖(g/l/h) - 8.91 4.63
产生的松二糖(g/l/h) - 4.91 2.83
松二糖收率(％) - - 56.36

[0146] 将最适当的条件定义为300rpm的搅拌、1vvm的曝气及调节在6.0处的pH。

[0147] 另外，在发酵步骤过程中使用的蔗糖的量以及还有使用的培养基也经受优化。

[0148] 起始蔗糖浓度的影响

[0149] 对蔗糖的两个起始浓度进行测试，即100和200g/l。

[0150] 在30℃，160rpm下，在一个培养基中，在7的pH下，将预培养进行23小时30分钟，该培养基包括在120℃下分开灭菌20min的30g/l的蔗糖和30g/l的 048E以及1滴消泡剂。在30℃，300rpm，1vvm下，在一个培养基中，在7的pH下，将生产进行25h，该培养基包括在120℃下分开灭菌20min的100或200g/l的蔗糖和30g/l的 048E以及10滴消泡剂。
在发酵6h时注意到pH为5.8并且自9h开始将其调节在5.5处。

[0151] 100g/l的起始蔗糖

[0152]时间(h) 0 6 9 25
蔗糖(g/l) 101.6 45.3 16.9 <0.5
松二糖(g/l) 2.1 28.1 40.7 35.1

[0153] 200g/l的起始蔗糖

[0154]时间(h) 0 6 9 25
蔗糖(g/l) 190.3 150.6 117.7 11
松二糖(g/l) 1.9 26.2 44.8 92.9

[0155] 200g/l的起始蔗糖浓度给出更好的结果。

[0156] 培养基的影响

[0157] 对三个组的培养基进行测试。

[0158]

[0159] 获得的结果如下。

[0160]

[0161] 培养基2似乎是最适当的，由于它节约时间。

[0162] 实例3-使用I-4604菌株生产松二糖

[0163] 在20l发酵罐中使用I-4604菌株生产松二糖。

[0164] 自蔗糖和自糖蜜开始进行发酵。实验方案如下。

[0165] 预培养

[0166] 蔗糖             100g/l

[0167] 048E    15g/l

[0168] Erol 18          1滴

[0169] 将整个混合物在120℃下灭菌20min并且调节至pH 7。

[0170] 在30℃和120rpm下，在三个500ml锥形瓶中将预培养进行24h。

[0171] 传代培养

[0172] 蔗糖             100g/l

[0173] 048E    30g/l

[0174] Erol 18          0.5ml/l

[0175] 将整个混合物在120℃下灭菌20min并且调节至pH 7。

[0176] 在30℃，300rpm及1vvm下，在15l体积的发酵罐中将传代培养进行19h。

[0177] 生产

[0178] 蔗糖          100g/l)在120℃下灭菌10min

[0179] Erol 18       0.5ml/l)同上

[0180] 048E 30g/l在120℃下灭菌20min

[0181] 将pH调节至pH 6。在30℃，300rpm及1vvm下，在15l体积的发酵罐中进行培养。

[0182] 结果

[0183]

[0184] 4个测试的平均结果如下：

[0185] -收率(松二糖/蔗糖)：53％

[0186] -持续时间：45至50h

[0187] -最终糖组成：

[0188] ■松二糖：106g/l(即糖的86％)

[0189] ■海藻糖：12g/l

[0190] ■异麦芽酮糖：5g/l

[0191] 因为最初提议的培养基简单且低廉，所以随后研究温度的影响、pH的影响、充氧水平的影响以及蔗糖提供模式的影响。

[0192] 下表概括了进行的所有测试的结果：

[0193]

[0194] 没有改性具有显著积极的影响，但是然而可以得出以下结论：

[0195] -应该将pH维持在6.0处；

[0196] -应该将温度维持低于30℃。最适温度甚至出现在接近27℃。

[0197] -过高的充氧水平(400或500rpm的搅拌)减缓蔗糖的消耗并且导致2-酮葡糖酸的强产生。

[0198] -添加一个第二预培养步骤不提供任何优势。

[0199] -逐渐引入蔗糖(FB＝分批补料)不具有优势。

[0200] 实例4-从I-4604菌株发酵果汁中纯化松二糖

[0201] 1.发酵果汁纯化步骤

[0202] 通过在12000g处离心分离生物质。上清液仍是混浊的。为了除去这一浊度，用粉末状炭黑(1％的SX+)进行处理并且在Cofram EKS板式过滤器上进行过滤。获得的滤液更澄清，但是未脱色。

[0203] 经强阳离子(C150)和弱阴离子(4228)除盐。除盐前产物的装载量是170meq/l。纯化产物的电阻率小于5kOhm，由于它包含若干种有机酸。在下表中表明了有机酸组成。

[0204] 为了在结晶之前改善丰度，在1kD处进行超滤。这一步骤使得保留色泽并且产物具有大于1kD的分子量成为可能。

[0205] 2.结晶

[0206] 在将100g的70bx的产物和200ml的96％乙醇的混合物煮沸后，在环境温度下进行结晶。考虑到混合物的低粘度，在布氏漏斗上进行晶体与母液的分离。在这些条件下，对于所使用的2升的发酵罐，回收70g的晶体(松二糖丰度为98％-99％)，即30％的重量收率。