马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途及提取方法

摘要

本发明公开了马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途和马尾松松针抗氧化活性成分的提取方法。马尾松松针抗氧化活性成分的提取方法按照以下步骤进行：步骤1：将新鲜松针去除枯叶与叶柄，在流水下冲洗干净，避光风干；步骤2：用陶瓷剪刀剪成1cm的小段，用超细粉碎机粉碎30s，制得松针渣，避光备用；步骤3：取10g松针渣，按料水:1:10～1:25(g:ml)加入超纯水；步骤4：置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中，以70～100℃浸提60～150min；步骤5：对浸提液减压过滤，得到含有抗氧化活性成分的滤液。本发明的有益效果是提供了一种新型天然抗氧化产品。

权利要求

1.马尾松松针抗氧化活性成分的提取分离纯化方法，其特征在于：按照以下步骤进行：取松针10g，加入其重量20倍的超纯水，置于索氏提取仪提取3次，浸提温度为90℃，每次2小时，合并提取液，经过旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩，得到浓缩为原液3倍的浓缩液，将浓缩液加入等体积的石油醚，振荡摇匀，静置，待溶液完全分层后保留上层的石油醚萃取液，下层水溶液用等体积的石油醚用同法再萃取2次，将3次的石油醚萃取液合并，在

45℃下减压回收石油醚，得到松针提取液石油醚部；萃取后的水层按相同的方法用等体积的乙酸乙酯提取3次，将上层的乙酸乙酯萃取液合并，在45℃减压回收乙酸乙酯，得到松针提取液乙酸乙酯部；萃取后的水层按同样的方法用等体积正丁醇萃取3次，把上层的正丁醇萃取液合并，在65℃减压回收正丁醇，得到松针提取液正丁醇部，正丁醇萃取后剩余的水溶液，在65℃减压浓缩，得到松针提取液水部；

使用AB-8大孔树脂对所述松针提取液水部进行分离纯化，分离纯化条件为：上样浓度为1:1，所述大孔树脂径高比为1:13，洗脱剂乙醇的浓度为50％。

说明书

马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途及提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于抗氧化化合物技术领域，涉及马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途及提取方法。

背景技术

[0002] 马尾松松针为松科植物针形叶，近年来研究发现其富含黄酮类物质、木脂类、维生素、多糖类和微量元素等天然抗氧化活性物质，且无毒，无副作用，可作为天然抗氧化剂和抗氧化功能食品的良好来源。

[0003] 目前对马尾松松针抗氧化活性的研究，主要集中在推测可能具有某种抗氧化活性组分的提取分离和功能评价等方面，而以“抗氧化活性”为质量控制目标，从马尾松松针物质中筛选出具有抗氧化活性成分的研究尚未见报道。因此，本研究拟以马尾松松针为原料，以总抗氧化能力为质量控制目标，深入研究马尾松松针抗氧化活性以及研制抗氧化功能饮料，为开发利用马尾松松针资源，以及研制新型天然抗氧化产品提供科学依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途。

[0005] 本发明的另一个目的是提供马尾松松针抗氧化活性成分的提取方法。

[0006] 本发明提供马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途。

[0007] 马尾松松针抗氧化活性成分的抗疲劳用途。

[0008] 马尾松松针抗氧化活性成分的提取方法，按照以下步骤进行：取松针10g，加入其重量20倍的超纯水，置于索氏提取仪提取3次，每次2小时，合并提取液，经过旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩，得到浓缩为原液3倍的浓缩液，将浓缩液加入等体积的石油醚，振荡摇匀，静置，待溶液完全分层后保留上层的石油醚萃取液，下层水溶液用等体积的石油醚用同法再萃取2次，将3次的石油醚萃取液合并，在45℃下减压回收石油醚，得到松针提取液石油醚部；萃取后的水层按相同的方法用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将上层的乙酸乙酯萃取液合并，在45℃减压回收乙酸乙酯，得到松针提取液乙酸乙酯部；萃取后的水层按同样的方法用等体积正丁醇萃取3次，把上层的正丁醇萃取液合并，在65℃减压回收正丁醇，得到松针提取液正丁醇部，正丁醇萃取后剩余的水溶液，在65℃减压浓缩，得到松针提取液水部。

[0009] 进一步，所述松针处理过程为将新鲜松针去除枯叶与叶柄，在流水下冲洗干净，避光风干，用陶瓷剪刀剪成1cm的小段，用超细粉碎机粉碎30s，制得松针渣，取10g松针渣，按料水比要求加入40、20和1倍超纯水，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中，温度为90℃提取120min，样品减压过滤，取滤液待用。

[0010] 进一步，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中，以70～100℃浸提60～150min。

附图说明

[0011] 图1是浸提时间对松针提取液总抗氧化能力的影响示意图；

[0012] 图2是浸提温度对松针提取液总抗氧化能力的影响示意图；

[0013] 图3是浸提料水比对松针提取液总抗氧化能力的影响示意图；

[0014] 图4是马尾松松针提取液萃取实验流程图；

[0015] 图5是松针提取液各萃取部的总抗氧化能力示意图；

[0016] 图6是两种树脂静态吸附动力学曲线示意图；

[0017] 图7是径高比(d/h)对吸附率的影响示意图；

[0018] 图8是上样稀释倍数对吸附效果的影响示意图；

[0019] 图9是洗脱剂对解吸率的影响示意图；

[0020] 图10是样品子负离子扫描图；

[0021] 图11保留时间为4.943分钟的离子峰的质谱图；

[0022] 图12保留时间为5.613分钟的离子峰的质谱图；

[0023] 图13保留时间为5.931分钟流出峰的质谱图；

[0024] 图14m/z288([M-H]-)离子流图；

[0025] 图15保留时间为7.908分钟流出峰的质谱图；

[0026] 图16保留时间为5.56分钟流出峰的质谱图；

[0027] 图17是各实验组小鼠负重游泳实验结果图；

[0028] 图18是各实验组小鼠肝糖原的含量测定结果图；

[0029] 图19是各实验组小鼠血尿素氮的含量测定结果图；

[0030] 图20是各实验组小鼠血乳酸含量测定结果图。

具体实施方式

[0031] 1.水浸提法提取马尾松松针抗氧化活性成分验证：

[0032] 本发明以水浸提法提取马尾松松针抗氧化活性成分。单因素试验中，除了考察料液比、时间和温度对提取效果的影响，并在单因素结果的基础上选取各因素较优的三个水平进行正交试验，优选出最佳提取工艺条件。

[0033] 马尾松松针提取液总抗氧化能力测定：机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系，该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S—转移酶(GST)等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如:VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、葡萄糖、铜兰蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径:

[0034] (1)消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；

[0035] (2)分解过氧化物，阻断过氧化链；

[0036] (3)除去起催化作用的金属离子。防御体系各成份之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用。

[0037] 本方法测定Fe3+→Fe2+的还原能力，通过光吸收值的变化来确定抗氧化物质的总抗氧化能力。光吸收值越大，总抗氧化能力越强。

[0038] 测定方法：按照总抗氧化能力测定试剂盒要求准备各工作液，各取0.1ml待测样品液和3.5ml检测试剂反应，以1cm光径，于520nm处测定各管吸光值(OD)，每一样品测定三个平行样。

[0039] 计算方法：在37℃时，每分钟每毫升松针提取样品液使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为一个抗氧能力单位。用U/ml表示。

[0040] 计算公式:总抗氧化能力＝(测定管OD—对照管OD)×反应液(ml)×样品测试前稀释倍数÷0.01÷30÷取样量(ml)。

[0041] 提取工艺参数的筛选：

[0042] 浸提的影响因素有很多，包括时间、温度、料水比、pH值、浸提溶剂等。本发明针对影响较大的料水比、时间、温度这几个因素进行考察。

[0043] 浸提时间的确定：取10g松针渣，按料水比1:10(g:ml)加入超纯水，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中以100℃浸提60、90、120、150min后，样品减压过滤，取滤液测定总抗氧化能力，确定最佳提取时间。

[0044] 浸提温度的确定：取10g松针渣，按料水比1:10(g:ml)加入超纯水，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中以70、80、90、100℃浸提60min后，样品减压过滤，取滤液测定总抗氧化能力，确定最佳提取温度。

[0045] 浸提料水比的确定：取10g松针渣，按料水比1:10、1:15、1:20、1:25(g:ml)加入超纯水，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中以70～100℃浸提60～150min后，样品减压过滤，取滤液测定总抗氧化能力，确定最佳提取料水比。

[0046] 最佳提取条件确定：单因素分析结果，选择料水比(W)、浸提温度(T)和浸提时间(M)三个因素各设两个水平设计正交试验，以总抗氧化能力为质量控制目标，确定松针提取液总抗氧化能力最高的提取条件。

[0047] 实验结果：单因素分析结果。

[0048] 1)浸提时间实验结果，松针抗氧化粗提液浸提时间确定的实验结果见图1。

[0049] 由图1可知，浸提时间60-150min的总抗氧化能力分别为164.77U/ml、157.87U/ml、172.17U/ml和147.82U/ml。因此本研究取总抗氧化能力较佳的提取时间60min和120min做下一步的正交试验。

[0050] 2)浸提温度实验结果，松针抗氧化粗提液浸提温度确定的实验结果见图2。

[0051] 由图2可知，浸提温度70-100℃的总抗氧化能力分别为152.88U/ml、167.12U/ml、182.16U/ml和164.77U/ml。因此本研究取总抗氧化能力较佳的提取温度80℃、90℃做进一步的正交试验。

[0052] 3)浸提料水比实验结果，松针抗氧化粗提液浸提料水比确定的实验结果见图3。

[0053] 由图3可知，浸提料水比从1：10至1:25的总抗氧化能力分别为164.77U/ml、175.50U/ml、179.20U/ml和116.98U/ml。因此本研究取总抗氧化能力较佳的浸提料水比
1:15和1:20进行下一步正交试验。

[0054] 正交试验结果及分析：松针提取液制备正交试验设计方案、结果及方差分析表分别见表1、2、3。

[0055] 表1 松针提取液制备L4(23)水平因素表

[0056]

[0057]

[0058] 表2 L4(23)正交试验设计及结果表

[0059]

[0060] 表3 正交试验方差分析表

[0061]

[0062] 注:F0.05(1,8)＝5.32，F0.01(1,8)＝11,26；**表示有极显著性差异，*表示有显著性差异。

[0063] 由表1、2、3可知，在试验范围内，各因素对马尾松松针抗氧化活性成分提取的影响效果为:温度>料水比>时间，且三种因素的影响都是极显著的。最优的浸提条件为A2B2C2，即料水比为1:20，浸提温度90℃，浸提时间120分钟。

[0064] 由于正交试验分析得到的最优工艺条件并未包括在已作的试验范围，因此对最优提取条件进行验证试验，平行进行3次，试验结果为松针提取液总抗氧化能力为191.78U/ml，比其他试验结果都高，说明最优提取条件合理。

[0065] 以总抗氧化能力为质量控制目标，通过单因素分析，得到马尾松松针抗氧化活性成分提取的因素范围如下:料水比为1:15和1:20，温度为80℃和90℃，时间为60min和120min。

[0066] 在单因素基础上应用正交试验，得到马尾松松针抗氧化活性成分提取的最优工艺条件为:料水比为1:20，浸提温度90℃，浸提时间120分钟。通过验证试验表明在最优工艺条件下提取液总抗氧化能力为191.78U/ml。

[0067] 马尾松松针抗氧化提取液分离纯化及组分分析：

[0068] 实验仪器与试剂；实验仪器：

[0069] 紫外分光光度仪:UV-3900，Hitachi Construction Machinery Co Ltd；

[0070] 电子天平:XR205SM-D，Precisa Gravimetrics AG；

[0071] 电子天平:BS224S，Sartorius AG；

[0072] 索氏提取仪:SXT-06，上海洪纪仪器设备有限公司；

[0073] 超细中药粉碎机:AK-98，温岭市奥力中药机械有限公司；

[0074] 旋转蒸发仪:RE-5200，上海亚荣生化仪器厂；

[0075] 空气恒温摇床：SI6-2，美国希尔顿制造股份有限公司；

[0076] 高效液相色谱仪：LC-20A，日本岛津制作所；

[0077] 液相工作站：系统控制器：CBM-20A；输液单元：LC-20AB；紫外可见检测器SPD-20A；自动进样器Prominence SIL-20A；柱温箱Prominence CTO-20A；

[0078] 三重四极杆串联质谱仪：API2000，美国应用生物系统公司；

[0079] 实验试剂：总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。大孔树脂:AB-8、D101、DM301、NKA-9，天律南开和成公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇，95％乙醇，均为分析纯；甲醇为色谱纯。

[0080] 马尾松松针抗氧化提取液萃取工艺：取松针10g，加入其重量20倍的超纯水，置于索氏提取仪提取3次，每次2小时，合并提取液，经过旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩，得到浓缩为原液3倍的浓缩液。将浓缩液加入等体积的石油醚，振荡摇匀，静置，待溶液完全分层后保留上层的石油醚萃取液，下层水溶液用等体积的石油醚用同法再萃取2次，将3次的石油醚萃取液合并，在45℃下减压回收石油醚，得到松针提取液石油醚部；萃取后的水层按相同的方法用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将上层的乙酸乙酯萃取液合并，在45℃减压回收乙酸乙酯，得到松针提取液乙酸乙酯部；萃取后的水层按同样的方法用等体积正丁醇萃取3次，把上层的正丁醇萃取液合并，在65℃减压回收正丁醇，得到松针提取液正丁醇部。正丁醇萃取后剩余的水溶液，在65℃减压浓缩，得到松针提取液水部。马尾松松针提取液萃取实验流程如图4所示。

[0081] 马尾松松针提取液各萃取部总抗氧化能力测定：马尾松松针抗氧化提取液萃取实验结果，松针提取液各萃取部位的总抗氧化能力见图5。由图5可知，松针提取液各萃取部位的总抗氧化能力分别为石油醚部为78.72U/ml，乙酸乙酯部为131.26U/ml，正丁醇部为54.14U/ml，水部为150.19U/ml。本研究选取抗氧化能力最强的萃取部位松针提取液的水部进行下一步的分离纯化研究。石油醚适用于提取叶绿素、脂肪油、挥发油等亲脂性强的活性成分，乙酸乙酯适用于提取黄酮苷类等中等极性活性成分，正丁醇适用于提取蒽醌苷和皂苷等中等偏大极性活性成分，而水相中的活性成分则为蛋白质、氨基酸、糖类、苷类、无机盐等亲水性强的物质。由图5可知松针提取液的水部和乙酸乙酯部的抗氧化能力强于石油醚部和正丁醇部。这主要是因为松针提取液的主要抗氧化成份为糖类或黄酮苷类等，因此本实验选择水相继续纯化和鉴定其含有的化合物。

[0082] 马尾松松针水相提取液的分离纯化：马尾松松针水相提取液的大孔树脂的筛选。

[0083] 本实验使用的大孔树脂包括AB-8和D101。他们的主要参数见表4。

[0084] 表4 大孔树脂的物理参数

[0085]

[0086] 大孔树脂的预处理：称取一定量大孔树脂，置于烧杯加入超过其高度10cm的95％乙醇浸泡24h，使其充分溶胀后,倒入布氏漏斗，用95％乙醇淋洗至流出液加水不出现白色沉淀为止,用去离子水洗尽乙醇,自然风干备用。

[0087] 大孔树脂吸附能力测定：称取一定量风干后的大孔树脂，将其放入已恒重的称量皿，置于真空干燥箱内80℃干燥至恒重，精确称取1.8g大孔树脂，放入三角烧瓶内，加入25ml稀释一倍的松针水部提取液(总抗氧化能力C1)，在恒温摇床振荡，转数为70r/min，振荡12小时后过滤，取滤液测定总抗氧化能力C2。按下列公式计算大孔树脂的吸附能力A。
A＝(C1-C2)×V÷W式中，A为吸附能力(u/g),C1为起始溶液总抗氧化能力(u/ml),C2为剩余溶液总抗氧化能力(u/ml),V为溶液体积(ml),W为树脂重量(g)。

[0088] 大孔树脂解吸能力测定：将饱和的大孔树脂滤干之后，置于三角烧瓶内，加入25ml50％乙醇作为解吸剂，在恒温摇床上振荡，转数为70r/min，振荡12小时后过滤，测定滤液总抗氧化能力C3。按下列公式计算大孔树脂解吸能力B。B(％)＝C3×V÷(A×W)×100％式中，B为解吸率，C3为滤液的总抗氧化能力(U/ml)，V为溶液体积(ml),A为吸附能力(u/g)，W为大孔树脂重量(g)。

[0089] 大孔树脂静态吸附动力学的测定：精确称取大孔树脂各2g，置于三角三瓶，准确加入稀释一倍松针水部提取液12ml，在恒温摇床上振荡，振荡速度为70r/min，每隔2h取0.5ml溶液测定，连续振荡12h，计算溶液的总抗氧化能力，确定吸附率和时间的关系，绘制吸附动力学曲线。

[0090] AB-8大孔树脂上样条件的确定：AB-8大孔树脂径高比(d/h)的确定，将松针提取液水部按1:1的比例稀释后，取10ml分别置于径高比为1:7、1:10、1:13、1:15的AB-8树脂柱，静止吸附1h后，按1ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，测定抗氧化活性，计算吸附液抗氧化活性。

[0091] 提取液上样浓度的确定：将松针提取液水部按2:1、1:1、1:2的比例稀释后，取10ml分别上样于3个径高比为1:13的AB-8树脂柱，静止吸附1h后，按1ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液抗氧化活性，计算吸附液抗氧化活性。

[0092] AB-8大孔树脂洗脱条件的确定：将松针提取液水部按1:1的比例稀释，取10ml分别上样于径高比为1:13的AB-8树脂柱，静止吸附1h后，分别用10ml去离子水、25％乙醇溶液、50％乙醇溶液、75％乙醇溶液和100％乙醇溶液以1ml/min的流速进行洗脱，分别收集洗脱液，测定洗脱液抗氧化活性。

[0093] 马尾松松针提取液水部的分离纯化实验结果，吸附树脂种类筛选结果：大孔树脂吸附和解吸能力：不同树脂对松针提取液水部的吸附和解吸能力，见表5。

[0094] 表5 不同树脂对松针提取液水部的吸附和解吸能力

[0095]

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[0097] 由表5可知，D101吸附树脂和AB-8吸附树脂对松针提取液水部的吸附率相差不大，而AB-8吸附树脂的解吸率明显高于D101吸附树脂解吸率。

[0098] 大孔树脂吸附动力学的测定：D101吸附树脂和AB-8吸附树脂静态吸附动力学曲线见图6。由图6中可知D101和AB-8吸附树脂在2h的时候，分别为92.34％和91.68％，并达到平衡状态。适合纯化分离的树脂，要求吸附能力和解吸能力都要好，而且吸附过程时间要短。从静态吸附和解吸实验，以及静态吸附动力学实验综合考察，AB-8在吸附率和吸附速率均与D101差不多，而解吸率明显优于D101，因此本研究选择AB-8作为分离纯化大孔吸附树脂。

[0099] AB-8纯化松针抗氧化水部洗脱条件的确定：各径高比(d/h)的吸附结果：大孔树脂不同径高比的吸附结果见图7。由图7可知，当径高比为1:7时，吸附率为99.30％，径高比为1:10时，吸附率为99.44％，径高比为1:13时，吸附率为99.58％，径高比为1:15时，吸附率为99.44％。因此，本研究选择1:13作为松针抗氧化粗提液水部分离纯化时吸附树脂的径高比。上样稀释倍数的吸附效果的影响：不同上样液浓度的吸附液总抗氧化能力结果见图8。由图8可知，当上样液稀释倍数为1:2、1:1和2:1(提取液：水)时，吸附液的总抗氧化能力为150.10U/ml、187.34U/ml和178.46U/ml。因此，本研究选择1:1作为松针抗氧化粗提液水部分离纯化时吸附树脂上样液的稀释倍数。

[0100] 洗脱剂浓度对解吸效果的影响：不同浓度洗脱剂洗脱的解吸率变化见图9。由图9可知，解吸率随着乙醇浓度的上升而增加，当以50％乙醇为洗脱剂，洗脱率最高，而继续增加乙醇浓度，松针提取液水部抗氧化物质的解吸率反而降低，因此本研究选择50％乙醇的洗脱液为纯化洗脱剂浓度。

[0101] 径高比(d/h)对吸附率的影响：随着大孔树脂柱的高度增加，吸附率也增加，当径高比为1:13时，AB-8吸附树脂对松针提取液水部的吸附率最高，而继续增加径高比，吸附率反而下降。这主要是因为径高比太小，柱效应降低，上样液未完全吸附即泄露，而径高比太大，管效应随着增加，吸附率也不理想。因此选择合适的径高比既能保证分离效果，同时也能提高分离的效率。

[0102] 上样稀释倍数对吸附效果的影响：吸附液的抗氧化活性随着上样液浓度升高而升高，当上样液稀释1倍的时候，吸附液的抗氧化活性最高，当浓度继续升高时时，抗氧化能力反而下降，这主要因为大孔树脂吸附量与上样液浓度的关系符合Frendich和Angmur经典吸附式，即吸附量随着上样液浓度增加而增加，但上样液浓度增加不能超过大孔树脂的吸附容量。上样浓度过低，则提纯时间增加，效率降低；上样浓度过高，导致泄露点提前，吸附率下降。

[0103] 马尾松松针水相提取液的初步组分分析：

[0104] 实验方法：色谱及质谱条件；

[0105] 色谱柱：Agilent C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)；

[0106] 等度洗脱程序：0-25min、30％B。体积流量0.3ml/min。进样体积20ul；柱温20℃。

[0107] 质谱条件：负离子方式扫描，扫描范围m/z100-1500。

[0108] 供试样品制备：取已纯化的样品稀释10倍，用0.45um滤膜过滤，取滤液。

[0109] LC-MS/MS分析：精密吸取20ul进样分析，记录时间为25min。

[0110] 实验结果：样品的负离子扫描图。通过LC-MS/MS对样品进行负离子全扫描，样品的总负离子流图见图10。由图10可知保留时间为4.99min、5.59min、6.00min和6.60min时，吸收峰较大，说明这几个峰中的物质是样品的主要物质。为进一步了解样品的组分，将对吸收峰进行Qtrap保留峰物质分析。

[0111] Qtrap保留峰物质分析：糖类物质保留时间为4.943分钟的扫描离子峰图见图11。

[0112] 由图11的扫描结果，经日本massbank(质谱银行数据库)和美国斯克利普斯学院数据库对比分析，m/z(核质比)341和m/z179为糖类物质，精确判断糖类的成分需进一步结合标准品的保留时间。

[0113] 黄酮类物质保留时间为5.613分钟的扫描离子峰图见图12。由图12的扫描结果，经日本massbank和美国斯克利普斯学院数据库对比分析，保留时间为5.613分钟流出峰的质谱特征峰m/z609([M-H]-)与槲皮素的一致，可认为5.613分钟的流出峰含有槲皮素。

[0114] 保留时间为5.931分钟流出峰的质谱图见图13。由图13扫描结果，经日本massbank和美国斯克利普斯学院数据库对比分析，保留时间为5.931分钟流出峰的质谱特征峰m/z593.3([M-H]-)与山柰酚(Kaempferol)的一致，可认为5.931分钟的流出峰含有山柰酚。

[0115] m/z288([M-H]-)提取离子流见图14。原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的是单体(儿茶素或表儿茶素)，其m/z为288([M-H]-)，由提取离子流图可知，提取液中广泛存在原花青素单体。

[0116] 保留时间为7.908分钟流出峰的质谱图见图15。图15的扫描结果，经日本massbank和美国斯克利普斯学院数据库对比分析，保留时间为7.908分钟流出峰的质谱特征峰m/z577([M-H]-)与原花青素二聚体的一致，可认为7.908分钟的流出峰含有原花青素二聚体。

[0117] 保留时间为5.56分钟流出峰的质谱图见图16。由图16的扫描结果，经日本massbank和美国斯克利普斯学院数据库对比分析，保留时间为5.56分钟流出峰的质谱特征峰m/z865([M-H]-)与原花青素三聚体的一致，且特征碎片峰m/z407([M-H]-)和m/z289([M-H]-)都存在，可认定5.56分钟的流出峰含有原花青素三聚体。

[0118] 实验结论：槲皮素、儿茶素和山柰酚(Kaempferol)是天然产物中的黄酮类物质,对自由基和超氧阴离子均有较好的清除作用。低聚原花青素(OPC)是一类由儿茶素或表儿茶素构成分二聚体到五聚体的生物类黄酮，是国际公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化物质。近年来研究表明松针提取液中富含黄酮类物质，包括槲皮素、儿茶素、山奈素等，同时通过功效评价试验表明了松针黄酮类物质具有抗氧化作用。本实验结果证明了抗氧化最强的纯化部位的主要作用物质为槲皮素、山柰酚、原花青素单体(儿茶素或表儿茶素)和低聚体(OPC)，与前人的研究结果相符。抗氧化组分的结构验证和精确含量测定将有待进一步的研究。马尾松松针抗氧化提取液通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取三次，获得的各萃取部位的总抗氧化能力分别为石油醚部78.72U/ml，乙酸乙酯部为131.26U/ml，正丁醇部为54.14U/ml，水部为150.19U/ml。松针抗氧化提取液水部为抗氧化能力最强的部位。通过静态吸附和解吸实验，以及静态吸附动力学实验综合考察，选择AB-8大孔吸附树脂为松针抗氧化提取液水部分离纯化的大孔吸附树脂。通过对上样浓度、径高比、洗脱剂浓度的考察，确定AB-8大孔树脂的分离纯化条件为上样浓度1:1，大孔树脂径高比为1:13，洗脱剂乙醇的浓度为50％。通过LC-MS/MS二级质谱打碎和Qtrap扫描保留峰分析，初步认定松针提取液最高总抗氧化能力的纯化液中主要为糖类物质、槲皮素、山柰酚、原花青素低聚体。

[0119] 2.马尾松松针抗氧化活性提取液的抗疲劳功效验证：

[0120] 马尾松松针抗氧化活性提取液的抗疲劳功效：“自由基学说”表明长时间或剧烈运动会破坏体内氧化和抗氧化系统的平衡，可致活性自由基堆积，从而限制持续运动的能力，造成机体疲劳。因此，抗氧化系统在疲劳的产生和发展中起到举足轻重的作用。本发明将前期实验所提取的总抗氧化能力最高的马尾松松针粗提液作用于小鼠运动性疲劳模型，评价马尾松松针粗提液的抗疲劳功效，为下一步以抗疲劳为功能，以松针抗氧化粗提液为原料的功能食品开发提供科学依据。

[0121] 实验仪器：

[0122] 紫外分光光度仪：UV-3900，Hitachi Construction Machinery Co Ltd；

[0123] 电子天平：XR205SM-D，Precisa Gravimetrics AG；

[0124] 电子天平：BS224S，Sartorius AG；

[0125] 恒温水浴锅：HWS－26，上海一恒科学仪器有限公司；

[0126] 游泳箱：80*50*80cm3；

[0127] 超声波细胞破碎仪：XO-400S，南京先欧仪器制造有限公司；

[0128] 多功能台式高速离心机：Allegra X-22R，美国贝克曼库尔特有限公司；

[0129] 实验试剂：乳酸(LD)测试盒、尿素氮(BUN)测试盒、肝/肌糖元测试盒均购自南京建成生物工程研究所；

[0130] 实验动物来源：

[0131] SPF级健康昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，由广东省实验动物中心提供。

[0132] 受试样品制备：将新鲜松针去除枯叶与叶柄，在流水下冲洗干净，避光风干，用陶瓷剪刀剪成1cm的小段，用超细粉碎机粉碎30s，制得松针渣。取10g松针渣，按料水比要求加入40、20和1倍超纯水，置于圆底烧瓶内于索氏提取仪中，温度为90℃提取120min，样品减压过滤，取滤液待用。

[0133] 马尾松松针提取液抗疲劳功效评价实验方法：

[0134] 参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)；

[0135] 动物饲养与受试方法；

[0136] 实验小鼠按随机分组原则，分为三个剂量组、一个阴性对照组和一个阳性对照组。每组32只，分笼饲养。动物房饲养温度为23±1℃，相对湿度维持40-60％，每天保持12h(早上7点到晚上7点)灯照和黑暗条件。每天灌胃时间为11:00-13:00。每天灌胃一次，三个剂量组按0.5mg/g体重、1mg/g体重和20mg/g体重灌松针提取液。空白组以相同体积的超纯水灌胃，阳性对照组以1mg/g体重灌乳清蛋白粉。受试时间30天。各组在饲养期间自由饮水和进食。

[0137] 负重游泳实验方法：末次给予受试样品30min后，将尾根部负荷5％体重铅皮的小鼠至于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温为25±1℃，记录小鼠自由泳开始至沉入箱底10s不能浮上水面的时间，即小鼠负重游泳时间。

[0138] 血尿素氮和肝糖原测定实验方法：末次给受试样品30min后，在水温为30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后采血。小鼠拔眼球采全血约0.5ml。置4℃冰箱约3h，血凝固后2000prn/min离心15min,取血清备用。用二乙酰-肟法测定。具体步骤按照南京建成尿素氮测定试剂盒说明测定血尿素氮含量。

[0139] 小鼠取血后处死，解剖取出肝脏，按南京建成肝糖原试剂盒说明测定肝糖原含量。

[0140] 血乳酸测定实验方法：

[0141] 末次给样30min后用毛细管从内眦采血，然后不负重在水温为30℃水中游泳10min后停止。在游泳结束后和休息20min后各用毛细管从内眦采血。血被肝素抗凝后，按南京建成血乳酸测定试剂盒说明测定血乳酸含量。

[0142] 实验结果与分析：

[0143] 小鼠负重游泳实验结果与分析，各实验组小鼠负重游泳实验结果见图17。

[0144] 注：*与空白组比P<0.05#与阳性组比P<0.05；图17松针提取液对小鼠负重游泳时间的影响，由图17可知，空白组负重游泳时间为431.5±108.18s，乳清蛋白组负重游泳时间为490.3±149.25s，低剂量组负重游泳时间为488.3±63.92s,中剂量组负重游泳时间为606.2±140.59s，高剂量组负重游泳时间为637.7±169.39s。松针提取液各剂量组及乳清蛋白组与空白组比较，均提高了小鼠的负重游泳时间。中剂量组和高剂量组与空白组比较均具有显著性差异(P<0.05)；且高剂量组与阳性组比较有显著性差异(P<0.05)。运动耐力是反映机体疲劳程度最直接、最客观的指标。小鼠负重游泳时间越长，表明其运动耐受力越强。由结果可以知，松针提取液可延长小鼠的负重游泳时间，提高小鼠的运动耐受力，说明松针提取液有一定的抗疲劳能力。

[0145] 小鼠肝糖原含量测定结果及分析：各实验组小鼠肝糖原的含量测定结果见图18。

[0146] 注：*与空白组比P<0.05；图18松针提取液对小鼠肝糖原含量的影响，由图18可知，空白组、乳清蛋白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠肝糖原含量分 别 为 6.96±4.35mg/g、11.42±3.45mg/g、9.06±2.61mg/g、12.87±3.08mg/g 和14.41±3.41mg/g。松针提取液各剂量组及乳清蛋白组与空白组比较，均可增加小鼠肝糖原的含量。与空白组比较，乳清蛋白组、中剂量组和高剂量组与均有显著性差异(P<0.05)。糖原是机体活动时能源的主要来源物质，在长时间紧张运动中，肌糖原近于消耗，而为了维持血糖的水平，肝糖原的储备量也会相应的减少。实验结果说明松针提取液中、高剂量能提高肝糖原的储备或减少运动时肝糖原的消耗，从而提供更多能量，以达到缓解疲劳的目的。

[0147] 小鼠血尿素氮含量测定结果及分析：各实验组小鼠血尿素氮的含量测定结果见图19。注：*与空白组比P<0.05#与阳性组比P<0.05；图19松针提取液对小鼠血尿素氮的影响，由图19可知，空白组、乳清蛋白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠血尿素氮含量分别209.01±22.02mg/L、205.50±29.60mg/L、175.51±17.43mg/L、170.63±10.49mg/L和184.51±21.55mg/L。松针各剂量组和乳清蛋白组均可减少小鼠血尿素氮的含量。与空白组比较，乳清蛋白组、松针剂量组均有显著性差异(P<0.05)，与乳清蛋白性组比较，松针三个剂量组均有显著性差异(P<0.05)。机体在长时间运动后，无法通过糖和脂肪分解代谢获得足够能量，此时机体就会消耗体内蛋白质参与供能，血尿素氮含量会随之明显的增加。
血尿素是蛋白质和氨基酸的分解代谢的产物，血尿素氮含量随着体力负荷增加而增加。实验结果表明松针提取液能够显著性减少血尿素氮的产生，增加机体对运动负荷的适应性，加快消除疲劳，显示出松针提取液较强的抗疲劳作用。

[0148] 小鼠血乳酸含量测定结果及分析：各实验组小鼠血乳酸含量测定结果见图20。

[0149] 注：*与空白组比P<0.05，图20松针提取液对小鼠血乳酸的影响：空白组、乳清蛋白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠血乳酸含量分别211.35±50.62mmol/L、200.43±49.49mmol/L、169.58±44.34mmol/L、204.82±22.32mmol/L 和200.52±29.07mmol/L。松针各剂量组和乳清蛋白组均可减少小鼠血乳酸的含量。与空白组比较，松针低剂量组有显著性差异(P<0.05)。乳酸含量是反映有氧代谢能力、产生和消除疲劳速度的重要依据。当机体进行长时间剧烈运动时，机体处于相对缺氧状态，糖酵解加快，使体内产生大量乳酸。乳酸的堆积是导致机体疲劳的重要因素。减少乳酸的产生或加快消除乳酸，都可以缓解疲劳或加速疲劳消除。实验结果表明松针各剂量组均可减少小鼠血乳酸的含量，特别是松针低剂量组可显著性减少小鼠乳酸含量，说明松针提取液可减少小鼠运动时乳酸的产生或者加快消除乳酸，从而在一定程度上缓解小鼠疲劳。

[0150] 实验结论：目前研究表明富含维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、B族维生素、氨基酸、活性多糖、黄酮苷、皂甙等抗氧化成分的食物具有抗疲劳作用。1977年Porsolt等首次通过游泳试验证明了具有抗氧化能力的膳食成分可延缓机体疲劳的产生。Evans等人发现抗氧化草药(Trichopus zeylanicus)可使小鼠在被迫游泳的测试中延长游泳时间。韦金亮等人的研究也表明有较强抗氧化能力草药红景天具有良好的抗疲劳功能。马尾松松针的抗氧化作用在前期实验中已被验证，但其疲劳功效还有待验证，这将为马尾松松针抗疲劳功能因子研究及马尾松松针抗疲劳功能食品研发提供科学依据。本实验通过动物运动模型实验表明马尾松松针抗氧化粗提液(中剂量提取液)具有抗疲劳作用。这与在本课题组前期已证明的马尾松松针抗氧化粗提液主要含有槲皮素、山奈醇、原花青素等黄酮类化合物的存在有关。该结果在Porsolt[50]等人的研究中也得到证实，这也为抗疲劳产生机理中的自由基学说提供了支持。抗氧化成分与抗疲劳功能之间的量效关系及作用机制有待深入研究。

[0151] 马尾松松针提取液对抗疲劳功效评价结果显示，各剂量松针提取液均能延长小鼠负重游泳时间、降低尿素氮含量、降低血乳酸含量及提高肝糖原含量。其中中、高剂量松针提取液能显著延长小鼠负重游泳时间、降低尿素氮含量及提高肝糖原含量。由此可以认为马尾松松针抗氧化粗提液具有缓解体力疲劳的作用。

[0152] 以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。