GI基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增方法

摘要

本发明涉及一种I型诺如病毒逆转录滚环扩增的检测方法。该基因芯片包括固相载体和寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种：1)从霍利斯弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、弗尼斯弧菌、拟态弧菌和海鱼弧菌基因中选取的DNA序列；2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。所述试剂盒包含上述的基因芯片。利用本发明的基因芯片及试剂盒检测海产品中九种致病性弧菌，操作简便，灵敏度好，重复性强。

权利要求

1.一种用于检测I型诺如病毒的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组包括逆转录扩增引物和锁式扩增的引物；其中逆转录引物的核酸序列为SEQ ID NO:1-2；检测I型诺如病毒的锁式扩增的引物和探针，其核酸序列分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；探针的核酸序列为SEQ ID NO:7。

2.如权利要求1所述的用于检测I型诺如病毒的引物组和探针，其特征在于，还包括有提高逆转录产物浓度的引物，其核酸序列为SEQ ID NO:3-4。

3.一种检测I型诺如病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组和探针。

4.如权利要求3所述的检测I型诺如病毒的试剂盒，其特征在于，还包含有权利要求2所述的提高逆转录产物浓度的引物。

5.权利要求3或4所述的试剂盒在非疾病诊断、治疗目的的检测I型诺如病毒中的应用。

说明书

GI基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学病毒检测技术领域，具体涉及一种GI基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增法。

背景技术

[0002] 浙江省是海洋大省，海产品种类及其丰富，海鲜产品深受当地民众喜爱，且很多居民有生食海鲜的习惯。海产食品，尤其是贝类，因为其滤食性的特点，成为食源性病毒如甲肝病毒、诺如病毒等的载体，有可能导致人类疾病的流行。海产品病毒的污染一般是指贝类的病毒富集污染，通常由于水体遭遇病毒污染而后经贝类富集后，将病毒传染给人类。迄今人类病毒病尚无特效药治疗，对病毒的监测成为预防和控制的有效手段。另一方面，由于近几年国外对我出口贝类频频施检诺如病毒，筑起了事实上的一道“绿色壁垒”，在很长一段时间内我们只能被动地应付国外的检查。

[0003] 诺如病毒(Norovirus,Nov)归属于杯状病毒科，1972年Kapikian等人通过应用免疫电镜检测技术首次在该地区腹泻者的粪便悬液中发现了该病毒颗粒，后经证实为诺如病毒。诺如病毒是急性胃肠炎的主要病原，可以感染各年龄组的人群。根据基因组分型，该病毒分为三个不同的属：基因I组，代表株为诺如病毒；基因II组，代表株为Snow Mountain Virus(SMV)；以及札幌病毒。对多次疾病暴发流行的分析已经确认了GI基因组型(以下简称I型诺如病毒)和GII基因组型的诺如病毒是世界范围内感染人的最常见的病毒株。然而，I型诺如病毒由于其阳性样本很难取得，国内相关报道也不多，无形中增加了研究的难度。

[0004] RT-PCR技术是目前研究食品中诺如病毒检测的主要方法。但PCR法由于假阳性影响及检测成本昂贵而在应用中受到限制；同时PCR法也存在血多影响灵敏度和特异性的因素，包括被检测样品本身、病毒核酸的纯化、PCR扩增的DNA片段少于1kb不能用于全基因组扩增等。因此，有必要建立一套I型诺如病毒的检测方法，提高我国食源性疾病的检测和控制能力。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供给一种I型诺如病毒的检测方法，从而更灵敏、特异性的来检测水产品中的I型诺如病毒。

[0006] 本发明首先提供一种用于检测I型诺如病毒的引物组，包括逆转录扩增引物和锁式扩增的引物和连接片段；引物信息如下：

[0007] 逆转录引物NVGI-F1：AGTTGGTACCGGAGGTTAATG(SEQ ID NO:1)

[0008] 逆转录引物NVGI-R1：GGGATTAAGATGAGGGCCTAAA(SEQ ID NO:2)

[0009] 另外，本发明还提供用于提高逆转录产物浓度的引物，其信息如下：

[0010] NVGI-F2：CAGTTGGTACCGGAGGTTAATG(SEQ ID NO:3)

[0011] NVGI-R2：GGGCCTAAACTCAAATCAAACAA(SEQ ID NO:4)

[0012] 本发明还提供用于检测I型诺如病毒的引物和探针，其序列信息如下：

[0013] 引物NVGI-RCAF：CCTCTTGCAATGGATCCTGTAG(SEQ ID NO:5)

[0014] 引物NVGI-RCAR：CCAAGGGTCAATAGGGTTAACTT(SEQ ID NO:6)

[0015] 连接片段NVGI-RCAP：

[0016] CAACTGCTGGGCAAGTTAACTCTGACCCTCTTGCAATGGATCCTGTAGCGGGCTCTTCAACAGCAGTTGCAACTGCTGGGCAAGTTAACCCTATTGACCCTTGGGGGCTCTTCAACAGCAGTTG(SEQ ID NO:7)。

[0017] 本发明还提供一种利用上述的引物组制备的试剂盒。

[0018] 本发明还提供一种利用上述引物组检测I型诺如病毒的方法，包括有如下步骤：

[0019] 1)待检测病毒RNA的提取：

[0020] 用病毒RNA提取试剂盒提取待检测样品的病毒RNA；

[0021] 2)用逆转录引物NVGI-F1、NVGI-R1逆转录扩增样品的病毒RNA得到逆转录产物；

[0022] 为了增加浓度，用NVGI-F2和NVGI-R2再次扩增NVGI-F1、NVGI-R1的逆转录产物；

[0023] 3)滚环扩增步骤：用步骤2)的逆转录产物为模板，用引物组NVGI-RCAF、NVGI-RCAR和NVGI-RCAP进行扩增，扩增温度为60℃，恒温水浴反应60min，80℃加热2min，终止反应；

[0024] 4)结果检测：扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳后在琼脂糖凝胶上形成阶梯状的条带为阳性样品。

[0025] 本发明引物组及方法的有点如下：

[0026] 1.特异性强：本发明提供的方法，首先将一条探针(又称锁式探针)结合到模板上，使模板形成环状结构，而后采用一对特异性引物，识别环状模板上的2个位点，特异地扩增I型诺如病毒，而对其他病毒基因不能发生扩增反应；2.等温：反应是在连续等温的条件下进行，不用花费时间来改变温度；3.操作简便：只需在反应管中加入各种反应试剂就能进行反应，不需要复杂的操作步骤；4.检测简单：只需通过琼脂糖凝胶电泳鉴定即可。

附图说明

[0027] 图1：本发明引物组的灵敏性检测电泳图，

[0028] 其中：M:DL 2000DNA Marker；泳道1、2、3、4、5、6的模板浓度(初始浓度为-1 -2 -3 -4 -5 -627.2ng/μL)分别为10 、10 、10 、10 、10 、10 ；泳道7为以无菌RNase Free dH2O作的空白对照；

[0029] 图2：本发明引物组的特异性检测电泳图；

[0030] 其中：M:DL 2000DNA Marker；泳道1:I型诺如病毒；泳道2:II型诺如病毒；泳道3:新布尼亚病毒；泳道4:小圆病毒；泳道5:甲肝病毒；泳道6:轮状病毒；泳道7:以无菌RNase Free dH2O作额空白对照。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

[0032] 一、用于检测I型诺如病毒引物组的设计

[0033] 本发明根据GeneBank中公布的I型诺如病毒的基因序列，通过同源性比较后，从高度保守序列序列中设计锁式探针两端的特异识别序列，使两端的特异识别序列与单链模板结合后紧密相邻，在从模板中选取一段序列作为锁式探针的连接段部分；RT-PCR扩增的引物和滚环扩增的引物通过NCBI网站上引物设计功能设计，引物如表1所示：

[0034] 表1：I型诺如病毒的RT-PCR引物及RCA引物

[0035]

[0036]

[0037] 二、I型诺如病毒引物组的效果检测

[0038] 1.1实验材料

[0039] 病毒株：I型诺如病毒、II型诺如病毒、新布尼亚病毒

[0040] 1.2病毒RNA提取

[0041] 取200μL粪便液于1.5mL无菌EP管中，用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN)提取病毒RNA，冻存于-70℃，备用，作为RT-PCR扩增的模板。

[0042] 1.3RT-PCR扩增病毒RNA

[0043] 采用一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa)结合引物对NVGI-F1/NVGI-R1扩增病毒RNA。若一次扩增产物浓度较低，可采用NVGI-F2/NVGI-R2引物对以一次扩增产物为模板，进行二次扩增。超微量核酸蛋白测定仪测定产物浓度为27.2ng/μL，冻存于-20℃，备用，作为滚环扩增的模板。

[0044] 1.4滚环扩增反应条件及体系

[0045] 1.4.1连接反应

[0046] 10μL连 接 反应 体 系：10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，NVGI-RCAP0.1μM，RT-PCR产物2μL，dH2O 5.5μL，94℃5min，冰浴2min，而后立即加入T4DNA Ligase 1U，37℃60min。

[0047] 25μL滚环扩增反应体系：dNTPs 0.4μM，NVGI-RCAF/NVGI-RCAR各0.4μM，Bst DNA polymerase(New England BioLabs)8U，10×反应缓冲液2.5μL，上述连接产物2μL，dH2O补足至25μL，扩增温度为60℃，恒温水浴锅中反应60min，80℃加热2min，终止反应。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以无菌dH2O代替模板作为阴性对照。

[0048] 1.5RCA方法的灵敏度评价

[0049] 经超微量核酸蛋白测定仪测得RT-PCR产物浓度为27.2ng/μL。首先将浓度为27.2ng/μL的产物进行10倍系列梯度稀释，再依次取2μL作模板，进行RCA扩增。以无菌RNase Free dH2O代替模板作为阴性对照。取3μLRCA扩增产物，经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

[0050] 1.6RCA方法的特异性评价

[0051] 分别以I型诺如病毒、II型诺如病毒、新布尼亚病毒、小圆病毒、甲肝病毒、轮状病毒核酸为模板，用所建立的I型诺如病毒RCA检测体系进行特异性试验。以无菌RNase Free dH2O代替模板作为阴性对照。

[0052] 2结果与分析

[0053] 2.1以I型诺如病毒核酸为模板，电泳后在琼脂糖凝胶上形成阶梯状的条带；而已无菌水代替的阴性对照，电泳后在凝胶上没有条带。

[0054] 2.2灵敏度检测结果

[0055] 图1的电泳结果显示这个方法的最低检出限为2.72×10-5ng/μL。

[0056] 2.3特异性检测结果

[0057] 用本试验中建立的I型诺如病毒RCA检测体系，可以检测出I型诺如病毒，而检测不到非I型诺如病毒，如图2所示。说明引物具有特异性，可作为I型诺如病毒RCA检测的引物。

[0058] 2.4贝类肠腺组织检测结果

[0059] 取贝类肠腺组织10g，剪碎搅拌成均质状，在肠腺中加入1mL GI型诺如病毒阳性粪便上清，涡旋混匀。加入20mL甘氨酸(0.05M)-Nacl(0.15M,pH9.5)，剧烈涡旋振荡5min，5000rpm离心10min，吸上清按1:1的比例加入氯仿丁醇(1:1)，涡旋振荡5min，5000rpm离心10min，吸取上清。上清调节pH7.2～7.5，加入40％的PEG6000，使终浓度为10％；加入
5M的Nacl，使终浓度为0.3M。充分涡旋混匀，置于4℃冰箱沉淀过夜，10000rpm离心30min。
弃上清，沉淀用1mL的EDPC水重悬。重悬液中按1:1的比例加入氯仿丁醇(1:1)，剧烈振荡
5min，5000rpm离心5min，取上清待提RNA。

[0060] 下述步骤同实施例二。结果表明在贝类肠腺组织中检出GI型诺如病毒，同时验证了该RT-RCA方法可以检测GI型诺如病毒。

[0061] 上述结果表明，本发明的RCA引物及检测方法灵敏度高、特异性强，有望为我国I型诺如病毒核酸的检测提供一种敏感、特异的实验技术。