用于生物毒性检测的肺组织模型及生物毒性检测方法转让专利
申请号 : CN201410524951.9
文献号 : CN104316661B
文献日 : 2016-03-23
发明人 : 姚睿 , 赵雨 , 孙伟 , 林峰
申请人 : 清华大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,包括:气管,所述气管内限定有气体通道,所述气管的两端设有分别与所述气体通道导通的进气口和出气口;
血管,所述血管内限定有血液通道,所述血管的两端设有分别与所述血液通道导通的进液口和出液口;和肺泡单元,所述肺泡单元内限定有腔室,所述肺泡单元的壁形成为弹性透气膜,所述肺泡单元设在所述血液通道内且所述腔室与所述气体通道导通,所述肺泡单元形成为空心球状,所述肺泡单元与所述气管之间设有连接管,所述连接管导通所述腔室和所述气体通道。
2.根据权利要求1所述的用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,所述连接管包括两个,其中一个所述连接管与所述进气口连通且另一个所述连接管与所述出气口导通。
3.根据权利要求1所述的用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,所述血管中部设有容纳腔,所述容纳腔与所述血液通道导通且所述容纳腔的径向尺寸大于所述血液通道的径向尺寸,所述肺泡单元设在所述容纳腔内。
4.根据权利要求1所述的用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,还包括:基底层;
血管层,所述血管层设在所述基底层上,所述血管设在所述血管层内;
气管层,所述气管层设在所述血管层上,所述气管设在所述气管层内;和封盖层,所述封盖层设在所述气管层上方并覆盖所述气管层。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,所述气管、血管和肺泡单元分别由聚合物、金属和非金属中的一种或多种制成。
6.根据权利要求5所述的用于生物毒性检测的肺组织模型,其特征在于,所述肺泡单元的壁形成为多孔膜。
7.一种PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:提供根据权利要求1-6中任一项所述的用于生物毒性检测的肺组织模型;
S2:在所述气管内灌注含有第一细胞的第一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;
S3:待所述第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;
S4:停止向所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入含有PM2.5颗粒物的空气并保持气压脉冲;
S5:将所述第二培养基更换为第三培养基,并持续培养;
S6:检测所述肺组织模型的细胞毒性。
8.根据权利要求7所述的PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞,所述第一培养基为上皮细胞培养基,所述第二细胞为内皮细胞,所述第二培养基为内皮细胞培养基,所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
9.根据权利要求7所述的PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,所述用于生物毒性检测的肺组织模型通过微制造方法和3D打印方法中的一种或两种制备而成。
10.根据权利要求7所述的PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,所述肺泡单元的制造方法包括:S11:制造内芯;
S12:通过电喷在所述内芯的表面制造膜结构;
S13:去除所述内芯,得到所述肺泡单元。
11.根据权利要求7所述的PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,所述步骤S1与所述步骤S2通过细胞打印技术集成实现。
12.根据权利要求7所述的PM2.5生物毒性的检测方法,其特征在于,所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反应。
13.一种药物生物毒性的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:提供根据权利要求1-6中任一项所述的用于生物毒性检测的肺组织模型;
S2:在所述气管内灌注含有第一细胞的第一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;
S3:待所述第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;
S4:停止向所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入空气并保持气压脉冲;
S5:将所述第二培养基更换为第三培养基,并持续培养;
S6:将药物加入到第三培养基内,并持续培养;
S7:检测所述肺组织模型的细胞毒性。
14.根据权利要求13所述的药物生物毒性的检测方法,其特征在于,所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞,所述第一培养基为上皮细胞培养基,所述第二细胞为内皮细胞,所述第二培养基为内皮细胞培养基,所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
15.根据权利要求13所述的药物生物毒性的检测方法,其特征在于,所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反应。
16.一种吸入式药物生物毒性的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:提供根据权利要求1-6中任一项所述的用于生物毒性检测的肺组织模型;
S2:在所述气管内灌注含有第一细胞的第一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;
S3:待所述第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;
S4:停止向所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入空气并保持气压脉冲;
S5:将所述第二培养基更换为第三培养基,并持续培养;
S6:将药物弥散在空气内,并向所述气管内通入含有药物的空气并保持气压脉冲,并持续培养;
S7:检测所述肺组织模型的细胞毒性。
17.根据权利要求16所述的吸入式药物生物毒性的检测方法,其特征在于,所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞,所述第一培养基为上皮细胞培养基,所述第二细胞为内皮细胞,所述第二培养基为内皮细胞培养基,所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
18.根据权利要求16所述的吸入式药物生物毒性的检测方法,其特征在于,所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反应。
说明书 :
用于生物毒性检测的肺组织模型及生物毒性检测方法
技术领域
PM2.5生物毒性以及药物生物毒性的检测。
背景技术
气污染可以引起急性和慢性呼吸道疾病,心脏病和肺癌等疾病,严重威胁人类健康。2014年
3月25日,世界卫生组织公布的最新数据显示2012年全球因空气污染死亡的人数高达700
万。其中,室外空气污染导致约370万人过早死亡。其主要原因是暴露于PM10中。
中PM2.5的来源复杂,其中包括物质燃烧、汽车尾气、尘土等。同样,PM2.5的颗粒成分也非
常复杂,既有有机物质,也有金属等物质。不同来源和成分的PM2.5颗粒的致病机理也不尽
相同。
度的不同成分的颗粒物的生物毒性具有差异,物理的检测方法已经不能准确表征PM2.5的
生物毒性。
2
300多万个,面积约70m,平均直径200μm。PM2.5等有害气体主要影响的是肺泡,肺泡主
要有三种细胞组成,Ⅰ型肺泡细胞,Ⅱ型肺泡细胞和巨噬细胞。Ⅰ型肺泡细胞,在肺泡内表
面展开形成紧密连接,占肺泡约95%的面积,而Ⅱ型肺泡细胞合成和分泌细胞活性剂,主要
起分泌和祖细胞的功能。巨噬细胞则存在于肺间质,吞噬、清除外来的尘粒或病原。
物模型涉及免疫准确、成本和伦理等问题,不是PM2.5毒性研究的理想模型。二维细胞培养
模型缺乏体内肺组织的三维特征,使之也不能准确的表征纳米粒子的生物毒性。因此,后续
的研究者利用三维体外肺模型研究肺病机理,环境毒性,药物安全等领域。但面对体内复杂
的肺部组织结构,如何构建一个高度仿生的三维体外肺模型,是一个重要且困难的问题。
发明内容
体内肺组织的仿生。
述血管内限定有血液通道,所述血管的两端设有分别与所述血液通道导通的进液口和出液
口;和肺泡单元,所述肺泡单元内限定有腔室,所述肺泡单元的壁形成为弹性透气膜,所述
肺泡单元设在所述血液通道内且所述腔室与所述气体通道导通。
结构和功能的仿生以及模拟免疫细胞的炎症反应。
纳腔内。
设在所述血管层上,所述气管设在所述气管层内;和封盖层,所述封盖层设在所述气管层上
方并覆盖所述气管层。
一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;S3:待所述第一细胞在肺泡单
元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;S4:停止向
所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入含有PM2.5颗粒物的空气并保持气压脉
冲;S5:将所述第二培养基更换为第三培养基,并持续培养;S6:检测所述肺组织模型的细
胞毒性。
所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;S3:待所述第一细胞在肺泡单
元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;S4:停止向
所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入空气并保持气压脉冲;S5:将所述第二
培养基更换为第三培养基,并持续培养;S6:将药物加入到第三培养基内,并持续培养;S7:
检测所述肺组织模型的细胞毒性。
所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
胞的第一培养基,在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基;S3:待所述第一细胞在
肺泡单元内壁上贴壁生长,且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养;S4:
停止向所述气管灌注所述第一培养基,向所述气管内通入空气并保持气压脉冲;S5:将所
述第二培养基更换为第三培养基,并持续培养;S6:将药物弥散在空气内,并向所述气管内
通入含有药物的空气并保持气压脉冲,并持续培养;S7:检测所述肺组织模型的细胞毒性。
所述第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞。
附图说明
具体实施方式
图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以
上,除非另有明确具体的限定。
第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方,或仅仅表示
第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是
第一特征在第二特征正下方或斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内
部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情
况理解上述术语在本发明中的具体含义。
液口5和出液口7,进液口5和出液口7分别与血液通道14导通。肺泡单元10设在血液通
道14内,肺泡单元10内限定有腔室,腔室与气体通道13导通。肺泡单元10的壁形成为弹
性透气膜。气体可从进气口8进入到气体通道13内,然后经过气体通道13进入到肺泡单
元10的腔室内,腔室内的气体可与血液通道14内的气体进行气体交换,交换后的气体从经
过气体通道13后从出气口11排出。
内部与外部可以相通,肺泡单元10内的气体可与血液通道14内的气体进行交换,实现了模
拟体内肺部血液的气体交换功能。同时,通过在肺泡单元10部分种植细胞,种植细胞后的
肺泡单元10在后续培养过程中可实现体内肺泡的结构和功能的仿生。
元10即可胀大,从而可以模拟体内呼吸时的吸气过程;当减小气体压力后,肺泡单元10可
收缩,实现模拟体内呼吸作用时的呼气过程。
PM2.5纳米粒子的空气,还可以是随机产生或采集的含有PM2.5纳米粒子的空气。其中,含
PM2.5颗粒物的气体可为包含各种来源(金属、非金属)和粒子直径的人工/非人工合成的
含颗粒物的气体。
注射泵、蠕动泵或者压力气瓶等连接在进气口8处,从而使气体可以容易地进入到气体通
道13内。
确的模拟生物体的肺组织模型100,实现了肺泡球状结构单元的体外仿生构建。该仿生单元
实现了模拟体内肺部血液的气体交换功能,呼吸应变作用,以及免疫细胞的炎症反应的仿
生功能,为生物毒性检测提供更为有效且可靠的保证。
细胞正常存活的前提下,创新性地构建了球状肺泡仿生结构并且可以与气液界面(空气—
血管界面),和/或免疫细胞,和/或呼吸应变作用等肺组织功能集成实现高度仿生的肺组
织模型100。
性检测提供更有效可靠的手段。
通道13导通。由此,从进气口8进入气体通道13内的气体可通过连接管15进入到肺泡单
元10的腔室内,同时腔室内的经过交换的气体可通过连接管15进入到气体通道13,进而从
出气口11排出肺组织模型100。
另一个连接管15则可作为气体从腔室内排出的出气通道。由此,气体进入和排出腔室分别
各占一个通道,进气和出气可独立开来,有效避免了进气与出气发生混合。
通道14的径向尺寸可为50微米-200微米。容纳腔12可形成为柱状腔或者其它形状的腔
室。例如,容纳腔12可形成为圆柱形腔,容纳腔12的径向尺寸可为300微米,容纳腔12的
深度(即轴向尺寸)可为300微米。气体通道13的直径可为50微米-200微米。
皮细胞。由此,可以实现体内肺组织器官的高度仿生。其中,根据本发明的一些示例,肺上皮
细胞、免疫细胞及内皮细胞可以包含原代细胞和/或干细胞和/或已建系的细胞和/或去
分化后再分化的细胞。也就是说,肺上皮细胞、免疫细胞及内皮细胞均可以包含原代细胞、
干细胞、已建系的细胞和去分化后再分化的细胞中的一种或多种。
体交换作用。并且可以通过培养免疫细胞来模拟体内的炎症反应,从而实现体内肺器官的
高度仿生模拟。
据实际情况进行合理选择。另外,肺泡单元10还可通过营养材料制作形成。
物可以为聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基
硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡
咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等。金属及非金属材料可以为硅、
钛及钛合金、铜及铜合金、钢、铝及铝合金等。
种类不仅限于以上所描述的,还可以是其他物质,在此不再详细描述。
为芯片式肺组织模型。具体地,如图1所示,肺组织模型100除了包括气管9、血管6、肺泡
单元10之外,还包括基底层4、血管层3、气管层2以及封盖层1。
由此,肺组织模型100由下到上依次为基底层4、血管层3、气管层2和盖封层。并且其中夹
设有血管6和气管9以及肺泡单元10。该肺组织模型100可形成为芯片式的结构,当其中
培植有细胞时,即可实现在芯片尺度上对体内肺组织的结构和功能的高度仿生,可以更准
确地进行生物毒性的检测。
多种组合的体外重构。该模型可用于环境PM2.5生物毒性的检测,也可应用于研究肺病机
理以及药物安全等领域。
上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞,比如血液中的游离
免疫细胞,白细胞等。在实际制备中也可以通过细胞打印技术将S1与S2集成在一起实现,
即将模型的制备和细胞的灌注集成在一起实现。由此,在模型的制造过程中可实现细胞在
通道内的可控分布。
法是指芯片和/或细胞一体打印完成。间接3D打印方法指利用3D打印方法制造通道和/
或模具以辅助模型的制造。肺组织模型的制造方法可以是上述方法的一种,也可以是上述
多种方法的组合。
法直接制造。
的检测方法不仅限于此,还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法,在
此不再详细描述。
上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞,比如血液中的游离
免疫细胞,白细胞等。
的检测方法不仅限于此,还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法,在
此不再详细描述。
上皮细胞与内皮细胞混合培养基,第三培养基中包含游离的免疫细胞,比如血液中的游离
免疫细胞,白细胞等。
的检测方法不仅限于此,还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法,在
此不再详细描述。
微米的通道,与肺泡单元的外部相连。在与肺泡单元相连的位置为直径300微米及深度300
微米的圆柱腔体结构。其内壁培养有内皮细胞。肺泡单元为直径200微米的空心球状体结
构,膜厚为10微米。并且肺泡单元膜为多孔结构,膜内表面培养有肺上皮细胞,外表面培养
有内皮细胞。
与空气阀相连。血管的进液口与装有培养基的注射泵相连,血管的出液口与废液收集装置
相连。
件)将肺芯片的三维结构图转化成可被打印机识别的文件格式(cli)。
基丙烯酸甲酯(276685,Sigma,美国),反应2h后取下,待溶液冷却至室温,加入40mLDPBS
溶液稀释,用截留分子量12000-14000的透析袋在去离子水中60℃透析3天,冷冻干燥2
天,形成白色蓬松泡沫状固体,为明胶-甲基丙烯酸甲酯聚合物,-80℃干燥保存。
0.005g/ml的光引发剂(I2959,2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮,106797-53-9,
英力,中国)粉末溶于0.1 g/ml明胶-甲基丙烯酸甲酯溶液中,Votex振荡混匀,用0.2μm
滤膜过滤后分装成1ml/管备用,避光4℃低温保存。并且之后的相关操作均在避光的条件
下进行。
的含有将打印芯片数据信息的cli文件导入3D细胞打印机中,运行程序使3D细胞打印机
自动完成设计芯片的打印。值得说明的是,芯片的主体材料为GelMA,而明胶被打印在设计
的通道中,在打印过程中,起到支撑作用,避免GelMA的悬空打印。两种材料均在25度及以
上为溶胶态,10度为凝胶态,而GelMA可以被紫外线交联,明胶不能交联。
计芯片结构的制造。
RPMI-1640(含10%血清及添加物),并通过血管的进液口(5)灌注含有人肺微血管内皮细
胞的培养基EBM-2(含5%血清及生长因子),待培养基充满通道后,静置培养2小时,待细
胞贴壁后,进行5天灌流培养,以让细胞充分融合形成紧密连接。
和RPMI-1640培养基的1:1混合培养基,再进行持续培养两周。利用CCK-8试剂盒评估细
胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度,5%CO2的培养箱中进行。
RPMI-1640培养基的1:1混合培养基,再进行持续培养一周。将待检测药物A按所需剂量
溶入EBM-2和RPMI-1640培养基的1:1混合培养基,并替代血液通道的培养基,再持续培养
1周。利用CCK-8试剂盒评估细胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度、5%CO2的培养箱中
进行。
RPMI-1640培养基的1:1混合培养基,再进行持续培养一周。将待检测药物B按所需剂量
弥散分布在正常空气中,并替代气体通道的空气并保持有0.3HZ的气压脉冲,再持续培养1
周。利用CCK-8试剂盒评估细胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度,5%CO2的培养箱中
进行。
技术人员来说是可知的,在此不再详细描述。
点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不
必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任
一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技
术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结
合和组合。
实施例进行变化、修改、替换和变型。