一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法和用途

摘要

本发明提供一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法和用途，并以此为指示剂，提供一种基于“膜修饰电极”、“核酸外切酶III辅助靶序列循环”和“DNA长距式自组装”三重信号放大技术的电化学生物传感器的制备方法，并将其用于肺癌相关靶序列c-erbB-2相关基因的超高灵敏、高特异性检测。该传感器的线性范围为2 aM~50 fM，检出限达到0.5 aM，且能较好地识别完全互补和错配序列，可以实现临床实际肺癌血清样本中超低含量靶序列的检测。

权利要求

1.一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮，其特征在于：所述5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮结构式为 。

2.一种如权利要求1所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤为：称取0.6 g 吖啶酮，加入5 mL浓H2SO4，搅拌溶解后，加热至100℃反应30 min，趁热将溶液倒入0~4℃冰水中，固体析出，过滤干燥得到浅绿色固体2-磺基-吖啶酮；称取0.6 g 2-磺基-吖啶酮，加入3 mL 36 %乙酸，再依次加入0.36 mL的浓硝酸和0.8 mL的冰醋酸，于56~60 ℃下搅拌反应2 h，趁热将溶液倒入冰水中，固体析出，过滤，用10~20 mL水冲洗，并用无水乙醇进一步重结晶纯化，得到黄色针状粉末5,7-二硝基-

2-磺基-吖啶酮。

3.一种如权利要求1所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用。

4.根据权利要求3所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，其特征在于：所述的电化学传感器制备方法包括： 1）电极的预处理将玻碳电极在0.05 μm的Al2O3粉上打磨，并先后用无水乙醇和双蒸水超声震荡5 min，以除去附在电极表面上的杂质，用10 mM 铁氰化钾表征电极表面，直至前后峰位电压差值小于80 V，蒸馏水洗净擦干后取出，氮气吹干；

2）探针修饰电极的制备

将处理后的玻碳电极置于含0.01 M/L 赖氨酸的pH 8.0、0.2 M PBS 缓冲液中，用循环伏安法电合修饰聚赖氨酸膜，再用双蒸水彻底冲洗电极并在室温下干燥，得到聚赖氨酸修饰电极，将聚赖氨酸修饰电极倒置，表面滴加20 μL偶联活化剂，室温自然蒸干，然后用超纯水清洗10 s，除掉未结合在修饰电极表面的偶联活化剂，氮气吹干待用；然后在电极表面滴加10 μL 1μM发卡结构的探针基因P溶液，室温自然蒸干，用超纯水清洗除掉未结合在电极表面的探针基因P，再用10 mM pH7.0 PBS缓冲液清洗，室温干燥，制得发卡探针修饰电极；

3）酶辅助靶序列循环

将发卡探针修饰电极置于一系列浓度的靶序列c-erbB-2相关基因溶液中，室温下杂交

1 h后清洗吹干，将杂交后的电极置于10 U 核酸外切酶III的缓冲液中，37 ℃下反应30 min后，清洗吹干待用；

4）DNA长距式自组装及电化学检测

分别取10 µL 1µM的辅助探针基因AP1和AP2溶液滴涂在上述电极表面，室温下进行DNA长距式自组装，2 h后清洗吹干；分别在含有质量比例为1:1的5 mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe(CN)6]的100 mM pH 7.0 PBS + 0.1 M KCl缓冲溶液测量不同修饰电极的CV曲线，扫描速率为0.05 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为2 s；将DNA长距式自组装后的电极置于含

100 μM 5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的10 mM pH 7.0 PBS缓冲溶液中，20 min后清洗吹干；

而后将电极置于100 mM pH 5.0 磷酸盐PB缓冲溶液中扫描CV和方波伏安法曲线。

5.根据权利要求4所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，其特征在于：所述循环伏安法的条件为：电压-1.0 ~ +2.4 V，扫描速率为100 mVs-1，表征圈数为14圈。

6.根据权利要求4所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，其特征在于：所述偶联活化剂为含5 mM 的EDC和8 mM的NHS的pH 7.4磷酸缓冲液。

7.根据权利要求4所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，其特征在于：所述CV法的扫描速率为0.50 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为

2 s；方波伏安法的扫描电位范围为-0.2 V ~ +0.15 V，电位增量为0.005 V，幅度为0.025 V。

8.根据权利要求4所述的一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，其特征在于：所述探针P序列为5'-NH2-AAA AAT TTA TTT GAT AGG CGA ACT ATT TGT TTT TAA TAT CAA ATA ATG GTT-3'；所述探针AP1序列为5'-CAA AAT ATA T GA TAG GCG AA-3'；探针AP2序列为5'-ATA TAT TTT GTT CGC CTA TC-3'。

说明书

一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法和

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法和用途，属于有机合成领域。

背景技术

[0002] 肺癌是世界上威胁人类生命的主要恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率逐年上升，已居恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) 占所有肺癌的80%。目前，针对肺癌治疗的研究已取得较大进展，但肺癌总的5年生存率仍只有15%，即使ⅠA期NSCL患者，术后5年生存率也只有80%。因此，肺癌的早期快速诊断对于治疗方案的选择及预后评价至关重要。

[0003] 近年来，随着生物化学、分子生物学及免疫学等技术的发展，对肺癌研究的不断深入，医学工作者们在肺癌肿瘤标志物筛选方面取得了突破性进展，目前已发现多种与肺癌相关的蛋白、基因等标志物，特别是肿瘤标志物c-erbB-2等。有研究人员发现，c-erbB-2在肺癌患者血清中异常表达，且性质稳定，正逐渐成为可靠的早期诊断肺癌的新型肿瘤标志物之一。许多学者通过PCR方法从基因水平来研究与 NSCLC 关系密切的基因标志物。虽然PCR可实现基因表达的定量检测，但由于存在操作过程繁琐、成本高、需要专门的技术人员等缺点，限制了检测在临床肺癌诊断中的应用。因此，开发一种简便、快速、灵敏、经济的c-erbB-2检测技术具有极其广阔的应用前景，将有望解决NSCLC早期诊断这一临床迫切的实际问题，具有极其重要的意义。

[0004] 生物传感器是利用生物特异性识别过程来探测蛋白质、基因、抗体、毒素等的传感检测器，是新一代的生物检测技术。其中电化学生物传感是由生物材料（DNA、酶、抗原、细胞、组织等）作为敏感元件，电极作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器，其生物分子识别的专一性决定了此传感器具有高度选择性。因此，学者们设计了很多用于检测DNA的电化学生物传感策略。虽然这些传感策略能实现DNA的灵敏特异性检测，但还存在如下缺陷：1）复杂耗时，缺乏经济性。2）传统指示剂存在价格昂贵，与单双链DNA都会发生作用，杂交检测特异性不高。3）稳定性较差。4）某些官能团标记方法，背景信号大，灵敏度低。5）假阳性和假阴性的现象仍不可避免。这些电生物传感策略在实际样本检测中想取代临床传统技术，仍面临巨大的困难。因此，有必要继续研究一种电化学生物传感新方法。

[0005] 下面所述的为本发明人设计并合成一种新型的具有较高水溶性和电化学活性的吖啶酮类衍生物-“5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮”，并以此为杂交指示剂，研制出了一种测定c-erbB-2相关基因的电化学传感器——基于“膜修饰电极”、“核酸外切酶III辅助靶序列循环”和“DNA长距式自组装”三重信号放大技术的电化学生物传感器：将L-赖氨酸修饰在玻碳电极表面，通过共价修饰法将发卡探针DNA固定到聚赖氨酸的末端羧基上。通过探针DNA与靶DNA的杂交，再经过核酸外切酶III切割循环后，修饰电极表面留有柔性短寡核苷酸序列，其可与辅助探针基因AP1和AP2杂交形成超级三明治结构，选择5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮作为杂交指示剂，其可嵌入到DNA的双螺旋结构中，成功实现三重信号放大技术的电化学生物传感器的研制。由于聚赖氨酸含有羧基，有利于DNA在电极表面的固定，另外“聚赖氨酸良好的导电性”、“核酸外切酶III辅助靶序列循环”及“DNA长距式自组装”都极大地增强了传感器的检测灵敏度。从而建立了高灵敏度、高特异性的c-erbB-2相关基因检测方法。今后，我们将在此新技术成功应用于肺癌早期诊断的基础上，推广应用于其他类型肿瘤的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法和用途，提供一种基于“膜修饰电极”、“核酸外切酶III辅助靶序列循环”和“DNA长距式自组装”三重信号放大技术的电化学生物传感器的制备方法，并将其用于肺癌相关靶序列c-erbB-2相关基因的超高灵敏、高特异性检测。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮，所述5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮结构式为 。

[0009] 一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备方法，所述步骤为：称取0.6 g 吖啶酮，加入5 mL浓H2SO4，搅拌溶解后，加热至100℃反应30 min，趁热将溶液倒入冰水（0~4℃）中，固体析出，过滤干燥得到浅绿色固体2-磺基-吖啶酮；称取0.6 g 2-磺基-吖啶酮，加入3 mL 36 %乙酸，再依次加入0.36 mL的浓硝酸和0.8 mL的冰醋酸，于56~60 ℃下搅拌反应2 h，趁热将溶液倒入冰水中，固体析出，过滤，用10~20 mL水冲洗，并用无水乙醇进一步重结晶纯化，得到黄色针状粉末5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮。

[0010] 一种杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在电化学传感器上的应用。

[0011] 所述的电化学传感器制备方法包括： 1）电极的预处理

[0012] 将玻碳电极在0.05 μm的Al2O3粉上打磨，并先后用无水乙醇和双蒸水超声震荡5 min，以除去附在电极表面上的杂质，用10 mM 铁氰化钾表征电极表面，直至前后峰位电压差值小于80 V，蒸馏水洗净擦干后取出，氮气吹干；

[0013] 2）探针修饰电极的制备

[0014] 将处理后的玻碳电极置于含0.01 M/L 赖氨酸的pH 8.0、0.2 M PBS 缓冲液中，用循环伏安法电合修饰聚赖氨酸膜，再用双蒸水彻底冲洗电极并在室温下干燥，得到聚赖氨酸修饰电极，将聚赖氨酸修饰电极倒置，表面滴加20 μL偶联活化剂，室温自然蒸干，然后用超纯水清洗10 s，除掉未结合在修饰电极表面的偶联活化剂，氮气吹干待用；然后在电极表面滴加10 μL 1μM发卡结构的探针基因P溶液，室温自然蒸干，用超纯水清洗除掉未结合在电极表面的探针基因P，再用10 mM pH7.0 PBS缓冲液清洗，室温干燥，制得发卡探针修饰电极；

[0015] 3）酶辅助靶序列循环

[0016] 将发卡探针修饰电极置于一系列浓度的靶序列c-erbB-2相关基因（1 aM~100 fM）溶液中，室温下杂交1 h后清洗吹干，将杂交后的电极置于10 U 核酸外切酶III的缓冲液中，37 ℃下反应30 min后，清洗吹干待用；

[0017] 4）DNA长距式自组装及电化学检测

[0018] 分别取10 µL 1µM的辅助探针AP1和AP2溶液（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）滴涂在上述电极表面，室温下进行DNA长距式自组装，2 h后清洗吹干；分别在含有5 mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)的100 mM pH 7.0 PBS + 0.1 M KCl缓冲溶液测量不同修饰电极的CV曲线，扫描速率为0.05 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为2 s；将DNA长距式自组装后的电极置于含100 μM 5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮DSA的 pH 7.0 PBS缓冲溶液中，20 min后清洗吹干；而后将电极置于pH 5.0 磷酸盐PB缓冲溶液中扫描CV和方波伏安法(SWVs)曲线。

[0019] 所述循环伏安法的条件为：电压-1.0 ~ +2.4 V，扫描速率为100 mVs-1，表征圈数为14圈。

[0020] 所述偶联活化剂为含5 mM 的EDC和8 mM的NHS的pH 7.4磷酸缓冲液。

[0021] 所述CV法的扫描速率为0.50 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为2 s；方波伏安法的扫描电位范围为-0.2 V ~ +0.15 V，电位增量为0.005 V，幅度为0.025 V。

[0022] 所述探针P序列为5'-NH2-AAA AAT TTA TTT GAT AGG CGA ACT ATT TGT TTT TAA TAT CAA ATA ATG GTT-3'；所述探针AP1序列为5'-CAA AAT ATA T GA TAG GCG AA-3'；探针AP2序列为5'-ATA TAT TTT GTT CGC CTA TC-3'；

[0023] 本发明的优点在于：

[0024] 1、合成了一种新型的电化学杂交指示剂吖啶酮类衍生物-“5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮”（DSA），它具有较高的水溶性和电化学活性，且对单双链的选择性较强。

[0025] 2、以DSA为杂交指示剂，研制了一种基于“膜修饰电极”、“核酸外切酶III辅助靶序列循环”和“DNA长距式自组装”三重信号放大技术的电化学生物传感器，可将其用于肺癌相关靶序列c-erbB-2相关基因的超高灵敏、高特异性检测。

[0026] 3、该传感器的线性范围为2 aM~50 fM，检出限达到0.5 aM，且能较好地识别完全互补和错配序列，可以实现临床实际肺癌血清样本中超低含量靶序列的检测。

附图说明

[0027] 图1是电化学杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的质谱图。

[0028] 图2为本发明的不同修饰电极的[Fe(CN)6]3-/4-表征图。图中在不同修饰电极上的3-/4-
[Fe(CN)6] 表征：膜修饰电极（a）、核酸外切酶III辅助靶序列循环前（c）和后（b）、DNA长距式自组装（d）

[0029] 图3为本发明的电化学信号检测图。不同浓度目标DNA的电化学信号A、B、C、D、E、F、G比较。

具体实施方式

[0030] 下列结合附图和实施例对本发明进行详细描述：

[0031] 实施例1

[0032] DSA的表征数据如下：

[0033] DSA的元素分析：C, 42.83 %; H, 1.99 %; N, 11.52 %. (计算值: C, 42.75 %; H, 1.93 %; N,11.50 %); DSA的红外分析IR (KBr)ν：3410(υNH), 1592(υC-C), 1642(υC =C), 1389 (υC-NO2), 1190 (υSO2OH).

[0034] DSA的质谱分析FAB-MS：m/z 366 ([M+1]+).

[0035] DSA的氢谱分析1H NMR (CDCl3, δ)：9.04 (s,ArH), 8.76 (s,ArH), 8.13 (s,ArH), 7.85 (d, ArH), 6.87 (d, ArH), 4.21 (s, NH).

[0036] 实施例2

[0037] 本发明的电化学传感器包括玻碳电极GCE，表面涂覆有敏感膜，ExoIII酶，辅助序列AP1和AP2。敏感膜由聚赖氨酸PLLy和固定的发卡探针基因P （5'-NH2-AAA AAT TTA TTT GAT AGG CGA ACT ATT TGT TTT TAA TAT CAA ATA ATG GTT-3'）组成，将固定了探针DNA的玻碳电极浸入含有一定浓度的互补DNA（T1）的PBS（磷酸盐pH 7.0）缓冲溶液中，进行杂交反应。将杂交后的电极置于10 U ExoIII酶的缓冲液中，37 ℃剪切消除，由于ExoIII可从3´端平端开始逐步降解探针基因P，直至与T1杂交形成双链的部分被完全降解，剩下未与T1杂交的部分基因残留于电极表面。同时，T1被完整释放出来并可继续与另一条P再次杂交。如此发生杂交、降解、再杂交的循环过程，一条T1就能使多条P被消化降解。在上述循环完成之后，探针基因P可从发卡结构转变成柔性的短线性结构。在电极表面滴加辅助探针基因AP1（5'-CAAAATATATGATAGGCG AA-3'）和AP2（5'-ATATATTTTGTTCGCCTATC-3'）溶液，室温下进行DNA长距式自组装。将长距式自组装后的电极置于含5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的 pH 7.0 PBS缓冲溶液中，使其嵌入到DNA的双螺旋结构中。上述电极清洗吹干后即可用于电化学检测。

[0038] 上述传感器的制备方法

[0039] 1)电化学杂交指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制备：称取0.6 g 吖啶酮，加入5 mL浓H2SO4，搅拌溶解后，加热至100℃反应30 min，趁热将溶液倒入冰水中，固体析出，过滤干燥得到浅绿色固体2-磺基-吖啶酮；称取0.6 g 2-磺基-吖啶酮，加入3 mL 36 %乙酸，再依次加入0.36 mL的浓硝酸和0.8 mL的冰醋酸，于56~60 ℃下搅拌反应2 h。趁热将溶液倒入冰水中（0~4℃），固体析出。过滤，用10~20 mL水冲洗，并用无水乙醇进一步重结晶纯化，得到黄色针状粉末5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮。

[0040] 2）聚赖氨酸修饰玻碳电极的制备：将处理后的玻碳电极置于含0.01 M L-赖氨酸的0.2 M PBS (pH 8.0) 缓冲液中，用循环伏安法电合修饰聚赖氨酸膜，条件为：电压-1.0 ~ +2.4 V，扫描速率为100 mVs-1，表征圈数为14圈，再用双蒸水彻底冲洗电极并在室温下干燥，得到聚赖氨酸修饰电极。

[0041] 3）发卡探针P、c-erbB-2相关基因、AP1和AP2的设计探针：发卡探针P：5'-NH2-AAA AAT TTA TTT GAT AGG CGA ACT ATT TGT TTT TAA TAT CAA ATA ATG GTT-3（'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；c-erbB-2相关基因：5'-AAC CAT TAT TTG ATA TTA AAA CAA ATA GGC TTG-3'为特定序列DNA（也由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的c-erbB-2相关基因）；AP1：5'-CAA AAT ATA T GA TAG GCG AA-3（' 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；AP2：5'-ATA TAT TTT GTT CGC CTA TC-3（'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；将探针P溶于TE缓冲液中（由10 mMTris、1.0 mM EDTA和0.10 mM NaCl配制，并用10 mmol/L HCl调至pH 7.4）制成100µM的探针溶液；将目标DNA溶解于pH7.0 PBS缓冲液中制成100µM的目标DNA溶液。

[0042] 4）发卡探针基因在修饰电极上的固定：聚赖氨酸修饰玻碳电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的赖氨酸。再在电极表面滴加20 μL偶联活化剂(含5 mM 的EDC和8 mM的NHS的pH 7.4的磷酸缓冲液)，室温自然蒸干，然后用超纯水清洗10 s，除掉未结合在修饰电极表面的偶联活化剂，氮气吹干。然后在电极表面滴加10 μL1μM发卡结构的探针基因P溶液，将末端修饰氨基的探针基因P共价固定于聚赖氨酸的羧基上，室温自然蒸干，用超纯水清洗除掉未结合在电极表面的P，再用pH 7.0 PBS缓冲液清洗，室温干燥，制得发卡探针修饰电极。

[0043] 5） 酶辅助靶序列循环：将发卡探针修饰电极置于一系列浓度的靶序列c-erbB-2相关基因溶液中，室温下杂交1 h后清洗吹干。将杂交后的电极置于10 U 核酸外切酶III的缓冲液中，37 ℃下反应30 min后，清洗吹干待用。

[0044] 6）DNA长距式自组装：分别取10 µL 1µM的辅助探针AP1和AP2溶液滴涂在上述电极表面，室温下进行DNA长距式自组装，2 h后清洗吹干。分别在含有5 mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)的100 mM pH 7.0 PBS + 0.1 M KCl缓冲溶液测量不同修饰电极的循环伏安曲线，扫描速率为0.05 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为2 s。从实验结果可知（见附图2），电极表面的DNA含量越多，峰电流值（Ip）越小；电极表面的DNA含量越少，峰电流值（Ip）越大。这是由于DNA磷酸骨架带负电荷，阻碍带同种电荷的[Fe(CN)6]3-/4-到电极表面发生氧化还原反应，导致其电子传递受阻，峰电流减小。

[0045] 通过以上方法即可得到所需的传感器。

[0046] 实施例3

[0047] 上述电化学传感器用于检测c-erbB-2相关基因，具体检测方法为：将固定了发卡探针DNA的玻碳电极浸入含有一定浓度的互补DNA 溶液，进行杂交反应。将杂交后的电极置于10 U 核酸外切酶III的缓冲液中，37 ℃剪切消除，探针P从发卡结构转变成柔性的短线性结构。在电极表面滴加辅助探针AP1和AP2溶液，室温下进行DNA长距式自组装。将长距式自组装后的电极置于含5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的 pH 7.0 PBS缓冲溶液中，让其嵌入到DNA的双螺旋结构中。上述电极清洗吹干后即可置于PB缓冲溶液中用方波伏安法检测。

[0048] 本发明运用现有技术的方波伏安法电化学检测技术观察指示剂的氧化还原信号变化。实验结果见附图3，由图可知，一定范围内，随着目标DNA浓度增加，杂交形成的双链脱氧核糖核酸（dsDNA）量增加，酶切产生的柔性短序列越多，从而形成DNA长距式自组装的量越多，使得指示剂嵌入量增加，峰电流信号加大。指示剂5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的峰电位为-0.028V。测定的条件：测定介质为PB缓冲溶液，pH =5.0。方波伏安法测定参数：电位增量为0.005 V，幅度为0.025 V。其线性范围为：2 aM ~ 50 fM。回归方程为I (μA) = 0.5955 Log[C/(aM)] + 0.5814，线性相关系数r为0.9947，该方法对特定序列DNA的最低检测下限为0.5 aM。

[0049] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。