红麻表达序列标签微卫星DNA标记

摘要

本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种红麻表达序列标签微卫星DNA分子标记。其步骤包括，基于红麻转录组测序序列开发新的微卫星位点，扩增微卫星位点的引物序列以及微卫星位点多态性分析。本发明的特征是，基于红麻转录组测序的转录因子表达序列标签，分离鉴定了24个微卫星标记的DNA序列和扩增该24个微卫星位点的引物序列。本发明的24个新的红麻微卫星DNA标记可应用于红麻品种的遗传多样性分析，遗传连锁图谱构建以及分子标记辅助育种等研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

权利要求

1.红麻表达序列标签微卫星DNA标记的引物，其特征在于：所述的24个红麻微卫星DNA标记编号分别为HcEMS047，HcEMS080，HcEMS134，HcEMS199，HcEMS218，HcEMS231，HcEMS270，HcEMS304，HcEMS330，HcEMS363，HcEMS369，HcEMS386，HcEMS398，HcEMS457，HcEMS465，HcEMS489，HcEMS498，HcEMS542，HcEMS569，HcEMS611，HcEMS622，HcEMS626，HcEMS641，HcEMS798，其对应的引物序列为SEQ ID NO.1-48所示；

所述24个红麻微卫星DNA标记表达序列标签为 SEQ ID NO.49-72所示。

说明书

红麻表达序列标签微卫星DNA标记

技术领域

[0001] 本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种红麻表达序列标签微卫星DNA分子标记。

背景技术

[0002] 红麻(Hibiscus cannabinus L.)是锦葵科木槿属一年生韧皮纤维作物，具有适应性广、耐盐碱、耐涝、耐贫瘠、抗干旱能力较强、纤维产量高、品质优良及生长快速等特性。其纤维可作为纺织原料、工业原料和生物质能源等，倍受业界新产品新材料开发的重视。

[0003] 微卫星（又称为简单重复序列，SSR）是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。因为微卫星中重复单元的重复次数不同，所以扩增的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星标记具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，被广泛应用于基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域，被认为是十分有效的分子标记之一。据序列来源，微卫星标记可以划分为genomic-SSR和EST-SSR，而EST-SSR来源于转录区域，往往跟功能基因连锁（Liu等，2013，PLoS ONE 8(4): e60346）。在真核生物中，存在着大量的转录因子（transcription factor），这些转录因子在植物的产量、品质、抗逆等性状中发挥着重要作用。因而，开发这些转录因子的EST-SSR标记在性状遗传剖析与分子标记辅助育种中具有明显的优势。

[0004] 至今在红麻应用到的少数微卫星标记主要来自于黄麻或棉花的SSR标记(Karan等，2013，Plant Systematics and Evolution，299：619-629)，与此同时，红麻微卫星DNA在红麻品种分类、遗传关系分析中的应用也迅速铺开，有关红麻微卫星标记的专利争夺正逐步展开。但是，国内外红麻的分子标记的研究起步较晚，仅极少数实验室开始了有关工作，目前可查红麻微卫星标记是部分genomic SSR（公开号CN1302111 C）。鉴于红麻微卫星数目多，还有大量的未被发现，且EST-SSR具有重要的理论和应用价值。因此，开展红麻的表达序列标签微卫星的分离、鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的红麻微卫星标记显得十分迫切和必要。

发明内容

[0005] 本发明旨在分离和鉴定红麻表达序列标签微卫星DNA标记，利用9%聚丙烯胺凝胶对这些分子标记进行多态性分析。

[0006] 本发明实现的技术方案：

[0007] 所述的24个红麻微卫星DNA标记编号HcEMS047，HcEMS080，HcEMS134，HcEMS199，HcEMS218，HcEMS231，HcEMS270，HcEMS304，HcEMS330，HcEMS363，HcEMS369，HcEMS386，HcEMS398，HcEMS457，HcEMS465，HcEMS489，HcEMS498，HcEMS542，HcEMS569，HcEMS611，HcEMS622，HcEMS626，HcEMS641，HcEMS798所对应的红麻微卫星DNA标记引物序列为SEQ ID NO.1-48所示。

[0008] 所述的24个红麻微卫星DNA标记对应的红麻表达序列标签为SEQ ID NO.49-72所示。

[0009] 基于红麻转录组测序，获得转录因子表达序列标签，利用SSRPrimer软件对其进行SSR位点查找，利用Primer 3.0软件设计SSR引物，利用这些SSR引物对红麻8个不同类型材料，即福红992、福红2号、福红航1B、福红B3、福红R-1、KG121、赞引1号与福红952B，进行扩增。通过9%聚丙烯胺凝胶电泳研究这些SSR引物的PCR扩增特点。得到多态性丰富的24个微卫星标记。

[0010] 本发明的具体步骤是：

[0011] (1)红麻表达序列标签SSR引物开发：基于红麻转录组测序获得转录因子的表达序列标签EST(expressed sequence tags) 24条，如表1。

[0012] 表1 红麻EST-SSR的表达序列标签编号及注释

[0013]

[0014]

[0015] 利用网上的SSRPrimer工具(http://hornbill.cspp.latrobe.edu.au/ ssrdiscovery.html)搜索这些序列所包含的SSR。利用Primer3软件对其进行SSR位点查找，并设计24了对引物，如表2所示。

[0016] 表2 红麻EST-SSR的引物编号及序列

[0017]

[0018] (2) 不同红麻品种的基因组DNA提取：采用CTAB法提取红麻8个不同类型材料，即福红992、福红2号、福红航1B、福红B3、福红R-1、KG121、赞引1号与福红952B，基因组DNA。

[0019] (3) SSR的PCR反应及电泳：PCR反应体积10 μL，反应体系组成为50 ng·μL–1 DNA –1 –1 2.0 μL，10 μmol·μL 左右引物各0.5 μL，0.5 U Taq酶0.1 μL，10 mmol·L dNTPs 0.2 μL，10×PCR buffer 1 μL，50 mmol·L–1 Mg2+ 0.8 μL，dd H2O 5.4 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 sec, 60℃退火30 sec, 72℃延伸45 sec, 共10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45 sec，共35个循环；
最后72℃延伸10 min，10℃保存10 min。Taq酶、dNTP等试剂购自上海生工生物技术有限公司，电泳方法为9%聚丙烯胺凝胶电泳。

[0020] (4) SSR的多态性分析：利用上述24对SSR引物对上述红麻8个不同类型材料进行扩增。SSR的多态性和扩增效率如表2和图1所示。发现24对引物得到强且清晰的PCR产物，至少在2个材料间存在差异，表现出多态性。

[0021] 本发明的积极效果如下：

[0022] (1)分离并鉴定了24个红麻转录因子表达序列标签的微卫星标记，经在国际基因数据库中检索，证明为新的微卫星DNA标记。这些微卫星标记的表达序列标签来源于不同类型的转录因子，是具有潜在的理论与应用价值的功能标记。

[0023] (2)经将上述微卫星标记用于红麻多态性分析，发现24对引物得到强且清晰的PCR产物，至少在2个材料间存在差异，表现出多态性。多态性分析和扩增效率结果如表3和图1所示。

[0024] (3)经将上述微卫星标记用于红麻属的遗传多样性分析，证明这24个微卫星标记适用于红麻遗传多样性研究，聚类分析结果如图2所示。

附图说明

[0025] 图1 SSR标记(HcEMS047)对红麻属8个不同类型材料扩增结果的电泳图，其中1: 福红992；2: 福红2号；3: 福红航1B；4: 福红B3；5: 福红R-1；6: KG121；7: 赞引1号；8: 福红952B；M: 100bp Marker。

[0026] 图2 红麻品种/系遗传多样性分析。

具体实施方式

[0027] 下面通过实例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

[0028] 实施例1：基于红麻转录组数据，确定了24条不同类型的转录因子表达序列标签，开发了红麻24个新微卫星标记，如表1，2所示。

[0029] 实施例2：利用不同来源的红麻种质资源，经PCR扩增和电泳检测，确定出24个多态性丰富的微卫星标记，如表3与图1所示。

[0030] 表3 红麻EST-SSR的多态性和扩增效率

[0031]

[0032] ABCD表示电泳带型清晰等级。

[0033] 实施例3：利用上述开发的微卫星标记分析红麻种质资源的遗传多样性分析。供试材料来自福建农林大学麻类遗传育种研究室，分别为福红992、福红2号、福红航1B、福红B3、福红R-1、KG121、赞引1号与福红952B。其中，赞引1号是从赞比亚引进并选育的一份优良品系，茎红色，圆叶型，植株高大；而其他材料是课题组选育的高世代品系，茎绿色，裂叶型，植株较高。利用NTsys软件对8份供试红麻材料进行遗传相似系数计算。其中计算方法是非加权聚类分析（UPGMA），读带采取0，1方式，0表示无带，1表示有带。聚类分析结果显示，这24个微卫星标记能很好地用于红麻的遗传多样性分析。聚类分析结果如图2所示，将8份宏麻材料划分为三大类。