旱生香茶菜乙素xerophilusinB在制备抑制肿瘤生长产品中的应用

摘要

本发明公开了旱生香茶菜乙素Xerophilusin B在制备抑制肿瘤生长产品中的应用，本发明提供了提供了Xerophilusin B在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：1)预防或治疗肿瘤；2)抑制肿瘤细胞增殖；所述xerophilusin B的化学结构式为如下式I：因此，鉴于香茶菜属植物中各类新化合物的不断发现，以及在肿瘤治疗与研究中发现的显著效果，随着旱生香茶菜植物提取化合物成分的研究逐渐深入，以xerophilusin B为代表的二萜类化合物可能会为肿瘤治疗带来新的途径。

权利要求

1.Xerophilusin B在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：

1)预防或治疗肿瘤；

2)抑制肿瘤细胞增殖；

所述Xerophilusin B的化学结构式为如下式I：式I；

所述肿瘤为食管鳞癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肿瘤细胞增殖通过使细胞阻滞于G2/M期和/或促进肿瘤细胞凋亡体现。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述促进肿瘤细胞凋亡通过降低细胞中凋亡通路蛋白BCL-2/Bax的蛋白表达量比值体现。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为食管鳞癌细胞KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450或KYSE-510。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为KYSE-150或KYSE-450。

6.Xerophilusin B在制备具有1)-3)中至少一种的功能的产品中的应用：

1)使肿瘤细胞阻滞于G2/M期；

2)促进肿瘤细胞凋亡；

3)降低肿瘤细胞中BCL-2/Bax的蛋白表达量比值；所述肿瘤为食管鳞癌；

所述Xerophilusin B的化学结构式为如下式I：式I。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为食管鳞癌细胞KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450或KYSE-510。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为KYSE-150或KYSE-450。

说明书

旱生香茶菜乙素xerophilusin B在制备抑制肿瘤生长产品中

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种旱生香茶菜乙素xerophilusin B在制备抑制肿瘤生长产品中的应用。

背景技术

[0002] 食管癌是全世界范围高发并严重威胁人类健康及生命的恶性肿瘤之一，目前，食管恶性肿瘤的发病率居于全部恶性肿瘤的第8位。与欧美国家患食管腺癌不同，我国食管癌一直以鳞状上皮细胞癌为主，而食管腺癌的发病率未见明显升高，90％以上食管癌病例类型为食管鳞癌，因此食管鳞癌是一个具有中国特色的恶性肿瘤病种。并且在我国，食管癌具有明显的地理分布聚集现象，高发病率地区与高病死率地区相当集中。高发省份为河南、河北、重庆以及福建省，其次为新疆、甘肃、山西、安徽及江苏省。国家防癌办第三次肿瘤普查资料显示，从20世纪70年代至21世纪初，虽个别区域其病死率有所下降，但我国食管癌发病率居高不下的现状仍然持续。

[0003] 近年来，寻找有效的具有显著抗肿瘤活性的天然植物与中草药提取物成为研究的热点之一，以长春碱类、紫杉烷类以及消癌平为代表的天然植物及中草药提取物已经广泛用于临床并收到良好的疗效。香茶菜属(Isodon)系唇形科(Labiatae)植物，为多年生草本灌木或半灌木，主要分布于亚洲东部及非洲西部，全世界范围约有150余种，我国是该属植物资源最丰富的国家，蕴藏量巨大，约有90余种，25个变种，全国各地除青海与内蒙古外均有植株分布，其中以西南诸省区尤其是云南省分布种类最多。对于香茶菜属植物药用价值的利用由来已久，其中约有30余种原植物被民间用作药用材料，具有清热解毒、活血破瘀、抗菌消炎等功效，目前国内外对该属植物的开发利用及研究正蓬勃发展。

[0004] Xerophilusin B主要分布在香茶菜属植物中(如旱生香茶菜Isodon xerophilus、细锥香茶菜I.coetsa、腺叶香茶菜I.adenolomus、叶穗香茶菜I.phyllostachys等)。最早由孙汉董等从旱生香茶菜中分离得到(Han-Dong Sun,et al.,Journal of Natural Products,2000,63(5),599-601.)。细胞毒活性筛选表明：xerophilusin B对三种人肿瘤细胞系K562、HL-60和MKN-28均表现出了显著活性，IC50值分别为0.73、0.29和0.17μg/mL[阳性对照药米托蒽醌(mitoxantrone)的IC50值分别为0.0334、0.29和0.02μg/mL](Han-Dong Sun,et al.,Journal of Natural Products,2000,63(5),599-601.)；对三种人肿瘤细胞系K562、MKN45和HepG2也表现出了较好活性，IC50值分别为4.1、0.4和3.9μM[阳性对照药顺铂(cis-platin)的IC50值分别为2.7、3.5和3.3μM](Han-Dong Sun,et al.,Journal of Natural Products,2007,70(8),1295-1301.)；对三种人肿瘤细胞系HT-29，BEL-7402和SK-OV-3也表现出了一定的活性，IC50值分别为2.52、3.06和2.14μg/mL[阳性对照药阿霉素(ADR)的IC50值分别为0.08，0.12和0.47μM](Han-Dong Sun,et al.,Archives of Pharmacal Research,2011,34(12),2007-2014.)；对五种人肿瘤细胞系HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7和SW480均表现出了显著活性，IC50值分别为0.8、1.3、2.0、1.1和0.9μM[阳性对照药顺铂(cis-platin)的IC50值分别为1.5、14.5、14.1、15.0和16.9μM](Han-Dong Sun,et al.,Journal of Natural Products,2011,74(5),1213-1220.)；Xerophilusin B能够抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7中脂多糖(LPS)诱导的NO生成(IC50＝0.23μM)，同时能够抑制mRNA生成(JoséLuis Ríos,et al.,Journal of Natural Products,2009,72(9),1269-1272.)。

[0005] 迄今为止，未见对映-贝壳杉烷二萜xerophilusin B抗食管癌活性的文献报道。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供Xerophilusin B的新用途。

[0007] 本发明提供了Xerophilusin B在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：

[0008] 1)预防或治疗肿瘤；

[0009] 2)抑制肿瘤细胞增殖；

[0010] 所述Xerophilusin B的化学结构式为如下式I：

[0011]

[0012] 式I。

[0013] 上述应用中，所述抑制肿瘤细胞增殖通过使细胞阻滞于G2/M期和/或促进肿瘤细胞凋亡体现。

[0014] 上述应用中，所述促进肿瘤细胞凋亡通过降低细胞中凋亡通路蛋白BCL-2/Bax的蛋白表达量比值体现。

[0015] 上述应用中，所述肿瘤为食管鳞癌；所述肿瘤细胞为食管鳞癌细胞KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450或KYSE-510，所述肿瘤细胞具体为KYSE-150或KYSE-450。

[0016] 本发明另一个目的是提供Xerophilusin B的另外用途。

[0017] 本发明提供了Xerophilusin B在制备具有1)-3)中至少一种的功能的产品中的应用：

[0018] 1)使细胞阻滞于G2/M期；

[0019] 2)促进肿瘤细胞凋亡；

[0020] 3)降低BCL-2/Bax的蛋白表达量比值。

[0021] 上述产品中，所述肿瘤为食管鳞癌；所述肿瘤细胞为食管鳞癌细胞KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450或KYSE-510，所述肿瘤细胞具体为KYSE-150或KYSE-450。

[0022] 本发明第三个目的是提供一种抗肿瘤药物。

[0023] 本发明提供的抗肿瘤药物，其活性成分为所述化合物Xerophilusin B。

[0024] 上述药物由所述化合物Xerophilusin B和药物载体组成，上述药物载体可以为药理上接受的所有的药物载体。

[0025] 上述药物中，所述肿瘤为食管鳞癌。

[0026] 上述药物可以如下：

[0027] 药物1：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

[0028] 药物2：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

[0029] 药物3：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

[0030] 药物4：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

[0031] 药物5：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按常规口服液制法制成口服液。

[0032] 药物6：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为5：1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

[0033] 药物7：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为3：1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

[0034] 本发明的实验证明，从香茶菜属植物旱生香茶菜(Isodon xerophilus)中筛选能够有效抑制食管鳞癌细胞增殖的二萜类化合物Xerophilusin B，通过体内与体外实验研究验证其能够通过诱导细胞凋亡及周期阻滞等作用机制导致细胞死亡，且通过对比化合物与传统化疗药物对瘤体及正常器官组织中的作用区别，利用裸鼠肝肾功能检测，来考察其毒性反应，为进一步作为抗肿瘤药物先导化合物提供证据。因此，鉴于香茶菜属植物中各类新化合物的不断发现，以及在肿瘤治疗与研究中发现的显著效果，随着旱生香茶菜植物提取化合物成分的研究逐渐深入，以xerophilusin B为代表的二萜类化合物可能会为肿瘤治疗带来新的途径。

附图说明

[0035] 图1为Xerophilusin B1H-NMR波谱数据(400MHz,CDCl3)。

[0036] 图2为Xerophilusin B13C-NMR波谱数据(100MHz,CDCl3)。

[0037] 图3为Xerophilusin B ESI波谱数据。

[0038] 图4为Xerophilusin B HREI波谱数据。

[0039] 图5为化合物xerophilusin B结构式。

[0040] 图6为Xerophilusin B对食管鳞癌细胞增殖的影响。

[0041] 图7为Xerophilusin B对食管鳞癌细胞及正常细胞增殖的影响

[0042] 图8为Xerophilusin B在食管鳞癌细胞及正常细胞中的IC50值

[0043] 图9为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞形态学影响的观察

[0044] 图10为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450裸鼠移植瘤抑制效应

[0045] 图11为Xerophilusin B对KYSE-150裸鼠移植瘤瘤体积抑制效应

[0046] 图12为Xerophilusin B对KYSE-450裸鼠移植瘤瘤体积抑制效应

[0047] 图13为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450裸鼠移植瘤瘤重抑制效应

[0048] 图14为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450裸鼠移植瘤瘤体组织学影响[0049] 图15为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞细胞周期的影响

[0050] 图16为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞细胞凋亡的影响

[0051] 图17为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞中β-actin蛋白含量的影响[0052] 图18为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞中凋亡相关蛋白表达的影响[0053] 图19为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450细胞中Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

[0054] 图20为Xerophilusin B对NIH-3T3与HEK-293细胞增殖的影响

[0055] 图21为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450移植瘤裸鼠血清肝肾功指标的影响

[0056] 图22为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450移植瘤裸鼠肝组织的影响

[0057] 图23为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450移植瘤裸鼠肾组织的影响

[0058] 图24为Xerophilusin B对KYSE-150移植瘤裸鼠心、肺、脾组织的影响

[0059] 图25为Xerophilusin B对KYSE-450移植瘤裸鼠心、肺、脾组织的影响

[0060] 图26为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450移植瘤裸鼠体重的影响

[0061] 上述附图中，xerophilusin B简写为spxl-3。

具体实施方式

[0062] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0063] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其余如下：

[0064] 1、实验所需试剂

[0065] 表1 为实验所需试剂

[0066]

[0067] 2、主要仪器设备

[0068] 表2 为主要仪器设备

[0069]

[0070]

[0071] 3、溶液的配制：

[0072] 1)化合物xerophilusin B溶液：xerophilusin B溶解在DMSO中，得到的溶液；体外实验中所用化合物溶液称取3.46mg xerophilusin B化合物(分子量＝346)结晶粉末与10ul DMSO溶剂混合，混匀至完全溶解后即配制成浓度为1mol/L化合物储存原液。吸取1uL原液加入999ul培养基中即配成1mmol/L化合物储存液，按此方法依次稀释配制成所需浓度液体，最后将各浓度化合物溶液中的DMSO补足至与最高浓度实验组相同的量，以保证各组化合物溶液中DMSO的浓度均一，本研究细胞实验中DMSO浓度皆为0.1％(v/v)。同样方法配制体内实验中使用的xerophilusin B溶液，但溶解结晶粉末后用来稀释原液的溶剂为乳化剂1％Pluronic F68。

[0073] 2)乙二胺四乙酸(EDTA)溶液：将37.2gEDTA钠盐加入到160mL的蒸馏水中，并用磁力搅拌器在室温环境条件下进行充分搅拌摇匀。接通电子酸度计，在实时读数的条件下向溶液中缓慢加入NaOH粉末，直至将溶液的pH值调整到8.0，所需NaOH的量大约为4g，用蒸馏水定容至200mL后，经高压蒸汽灭菌处理，于室温条件下保存。EDTA溶液的最终浓度为0.5mol/L。

[0074] 3)TAE(Tris-Acetate-EDTA)电泳缓冲液(50×)：准确称取Tris碱121g，加入400mL蒸馏水中，用磁力搅拌器充分搅拌震荡，混匀后向溶液中加入28.55mL的冰醋酸以及50mL浓度为0.5mol/L的EDTA溶液，最后加入蒸馏水并定容至500mL，于室温条件下保存。

[0075] 4)溴化乙锭(EB)溶液：准确称量0.2g溴化乙锭，溶于20mL水中，用磁力搅拌器充分搅拌约2小时后，将溶液转移至棕色试剂瓶中，或者将溶液转移到锡纸包裹的试剂瓶中，在室温条件下避光保存。

[0076] 5)双抗(青霉素及链霉素溶液)溶液：青霉素与链霉素各100万单位溶解于100mL无菌双蒸水中，配制成100×浓度的双抗溶液，其中每mL的双抗溶液中含青霉素与链霉素各10000单位，然后分装入新的Ep管中，于-20℃条件下保存。使用时以无菌双蒸水稀释成最终浓度为100单位/mL。

[0077] 6)细胞冻存液：主要成分是含有80％的RPMI1640无血清培养基，10％的二甲基亚砜(DMSO)以及10％的胎牛血清。

[0078] 7)磷酸盐缓冲液(PBS)：准确称量NaCl8.5g，KCl0.2g，Na2HPO4·2H2O粉末2.85g，KH2PO4粉末0.27g，溶解于无菌双蒸水中，定容至1L，最后经高温高压灭菌后备用。

[0079] 8)10×Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)：首先将80g NaCl，24.2g的Tris碱溶解于800mL无菌双蒸水中，最后使用HCl调节pH值到7.6。

[0080] 9)Harris苏木精的配制：先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾(KAl(SO4)2)，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的KAl(SO4)2蒸馏水中，煮沸1min后，待冷却少许，缓慢加入红色氧化汞(HgO)0.5g，继续加热至染液变成紫红色时，用纱布覆盖瓶口，用滤纸过滤后每100mL中滴加冰醋酸5mL。

[0081] 10)伊红(eosin)的配制：先将伊红溶解于酒精中，用玻璃棒搅拌溶解后，每100mL中滴加冰醋酸1滴。

[0082] 4、实验所用的细胞及培养方法

[0083] 使用的食管鳞癌细胞有如下4株：KYSE-140(中分化鳞癌)，KYSE-150(低分化鳞癌)，KYSE-450(高分化鳞癌)以及KYSE-510(高分化鳞癌)(上述细胞株均记载在如下文献中：Shimada Y1,Imamura M,Wagata T,Yamaguchi N,Tobe T.Characterization of21newly established esophageal cancer cell lines.Cancer.1992Jan15；69(2):
277-84.；公众可从中国医学科学院肿瘤医院；中国科学院昆明植物研究所获得)。以上细胞系均经过STR鉴定。

[0084] 为研究化合物对正常组织细胞的影响与毒性反应，应用了以下2株正常组织来源细胞系，分别为：小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3(ATCC,CRL-1658)，人胚肾细胞系HEK-293(human embryonic kidney-293(ATCC,CRL-1573)，均购自ATCC细胞库。

[0085] 食管鳞癌细胞的培养使用RPMI1640培养基，小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3的培养使用DMEM(Hyclone,USA)培养基，人胚肾细胞系HEK-293的培养使用MEM(Hyclone,USA)，其中需添加10％的胎牛血清(Gibco)与浓度为0.2％的青霉素和链霉素双抗(Invitrogen)。细胞培养孵箱条件为37℃恒温，湿度恒定，CO2的浓度维持在5％。

[0086] 实施例1、化合物Xerophilusin B(简写为spxl-3)的获得

[0087] 1)提取与纯化

[0088] a)将采集的旱生香茶菜植株叶子部分经研磨、干燥处理后作为植物原料(7.5千克)，室温环境中粉碎处理浸泡于体积为12L的丙酮溶液中，每3天更换一次新鲜的丙酮溶液。

[0089] b)将浸泡后的植物原料在室温下进行过滤，收集过滤液。所收集的过滤液采用减压蒸馏方法以除去溶剂获得粗浸膏。

[0090] c)将b)中的粗浸膏溶解于水中(4L)，用石油醚(共3次，每次3L)与乙酸乙酯(共3次，每次4L)依次抽提萃取，收集浓缩液即得到乙酸乙酯萃取浸膏(504克)。

[0091] d)将乙酸乙酯浸膏提取物(504克)使用MCl树脂进行脱色处理，利用90％MeOH-H2O进行洗脱后，产生淡黄色的浸膏(423克)。

[0092] e)将d)中的淡黄色浸膏(423克)采取硅胶柱层析，采用CHCl3-Me2CO(1:0→0:1)梯度洗脱处理得到A-G，7个部分。

[0093] f)将d)中所得的粗产品B(33.4克)经硅胶柱层析，采用石油乙醚-丙酮(6:1→2:1)梯度系统洗脱流程进行洗脱，最终产生化合物xerophilusin B(103.5mg)。

[0094] 2)结构鉴定

[0095] a)利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)测定xerophilusin B纯度，以保证其纯度达到至少98％。

[0096] b)使用电子微量天平称取适量化合物粉末，装入Ep管中，吸取DMSO溶液加入EP管中，用移液器反复抽吸混匀使化合物完全溶解后，置于-20℃长期干燥保存。

[0097] 其中化合物xerophilusin B的NMR、ESI(图3)以及HREI波谱数据(图4)如下：

[0098] 化合物xerophilusin B:1H NMR(400MHz,pyridine-d5,δin ppm,J in Hz)δ1.68(H-1a,d,13.4)；1.00(H-1b,dd,13.4,4.5),1.48(H-2,m),1.35(H-3a,br d,13.2),1.10(H-3b,dd,13.2,3.6),1.52(H-5,br s),4.21(H-6,br s),2.75(H-9,d,7.1),1.61(H-11a,dd,
15.3,6.7),1.50(H-11b,m),2.24(H-12a,m),1.42(H-12b,m),3.10(H-13,m),4.95(H-14,d,
6.5),6.17(H-17a,br s)5.27(H-17b,br s),1.08(H3-18,s),0.91(H3-19,s),5.47(H-20,s).13C NMR(100MHz,pyridine-d5,δin ppm)δ27.7(C-1,t),19.0(C-2,t),41.3(C-3,t),
33.8(C-4,s),63.3(C-5,d),73.0(C-6,d),101.6(C-7,s),57.6(C-8,s),45.4(C-9,d),43.0(C-10,s),17.3(C-11,t),26.2(C-12,t),40.3(C-13,d),70.1(C-14,d),199.8(C-15,s),
149.0(C-16,s),118.3(C-17,t),31.6(C-18,q),23.3(C-19,q),98.0(C-20,d).HRMS(m/z):
[M]+calcd.for HRMS(m/z):[M+Na]+calcd.for C20H26O5Na,369.1678；found,369.1681.[0099] 从1H-NMR和13C-NMR图谱(图1-图2)可以得出化合物sxp-3的分子式为C20H26O5，分子质量为346.41744，以上数据与NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中PubChem检索库中CID 44445767号化合物数据信息吻合，并且与文献报道的旱生香茶菜素Xerophilusin B的数据一致，其化合物结构式如图5所示。综上所述，通过数据库检索并与文献数据对照，确定该化合物为旱生香茶菜素xerophilusin B。

[0100] 实施例2、Xerophilusin B在抑制食管鳞癌生长中的应用

[0101] 1、Xerophilusin B对食管鳞癌细胞系的体外生长抑制作用

[0102] 测定细胞生长抑制率实验试剂采用Dojindo公司的Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，具体方法如下：

[0103] 1)将经过培养扩增后的KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450、KYSE-510以及NIH-3T3与HEK-293细胞，培养至细胞融合度达到70～80％，使用0.25％胰酶消化处理细胞，然后使用改良型RPMI-1640、DMEM或MEM完全培养基吹打制成均一的细胞悬液，置于15ml或50ml离心管中。

[0104] 2)加入完全培养基将重悬的细胞悬液进行稀释，使最终浓度达到1.5×104个/mL，充分混匀之后吸取200μL加入到96孔板中(每孔约含2000个细胞)，置于37℃和5％的CO2细胞培养箱中孵育培养。在滴加细胞悬液入孔时，应用1mL枪头以减少枪头过小所造成的细胞损伤及死亡；每加3～5个孔后，为避免细胞悬液沉降造成细胞浓度不均匀，用移液器或吸管再次混匀细胞悬液；为加快铺板速度以减少孔间差异，将离心管中的细胞悬液分装入1.5mL或2mL Ep管。

[0105] 3)96孔板边孔不作为实验用，为避免在后续细胞孵箱孵育及操作过程中靠近板子边缘的培养基蒸发，造成孔间体积差异浓度不均影响读数，将四周边孔以及不用于检测的孔加以同体积培养基或无菌水。

[0106] 4)铺板完毕后，将盖子盖好，并在盖子及孔板上标注实验批次、实验者姓名、浓度梯度及时间，轻轻摇晃孔板以利细胞铺匀。孵育期间适时镜下观察细胞贴壁及长势情况。

[0107] 5)当细胞贴壁之后，细胞融合度达到50～60％之后，吸弃各孔中原培养基，然后每孔加入新鲜培养基及10uL各浓度化合物Xerophilusin B溶液(溶剂为DMSO)，使每孔中细胞培养基的总量达到100μL，把加入化合物的当天作为细胞增殖的起始点(第0小时)。实验分组中设置Xerophilusin B处理组(细胞+10uL Xerophilusin B溶液+培养基)、DMSO对照组(细胞+统一剂量DMSO+培养基)、空白对照组(细胞+培养基)以及本底对照组(培养基)。

[0108] 6)化合物Xerophilusin B浓度设置0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM及250Μm(用培养基稀释)，共8个浓度梯度。

[0109] 7)分别在加药后的第0小时、第6小时、第12小时、第24小时、第48小时以及第72小时分别向96孔板的每个孔中加入10μl的CCK-8检测液，加入时沿孔壁均匀滴加，以免在孔中生成气泡影响OD值得读数，然后在37℃和5％的CO2细胞培养箱中孵育0.5～1.5个小时。此处加入CCK-8后的检测时间间隔需要经过不同时间点重复检测，以便摸索出最佳检测时间，时间过长则检测初始OD值过大，待细胞继续生长后易超出其检测范围，降低了准确性，而若间隔时间过短，则可能反应不完全，造成假阴性。对于食管鳞癌时间一般为0.5～1小时，正常细胞系一般0.5小时即可。

[0110] 8)盖好孔板顶盖，将其置于孵箱里层以减少孵箱开关而影响避光。若进行多批次实验且暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl0.1M的HCl溶液或者1％(w/v)SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。为避免待检测化合物与CCK-8产生氧化还原反应而造成实验假阳性，因此在滴加入CCK-8之前，用移液器将孔内培养基吸弃，并加入200uL新鲜培养基。

[0111] 9)从加入CCK-8检测液的培养孔中吸出100μl培养液，按照序号加入到一个新的酶标仪比色板中，设定酶标仪，揭去96孔培养板顶盖，放入酶标仪托架，震摇5～10秒后读取培养液在450nm处的吸光值，每种细胞实验组设置6个复孔。

[0112] 10)检测OD值结果，各组均减去相应组中的本底对照孔OD值，以细胞加药后时间为横轴，起点为第0小时，细胞培养液在450nm处的吸光值(OD值)作为纵轴，连接形成增殖曲线，并使用Bonferroni检验比较各个时间点上重复测量数据的统计学意义。

[0113] 11)将测得的各组OD值代入抑制率计算公式：抑制率(％)＝(1–OD处理组/ODDMSO组)×100中，计算化合物抑制率。

[0114] 分别在加药后0小时、6小时、12小时、24小时、48小时以及72小时后，应用Cell Counting Kit-8法检测xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时的450nm处的吸光值即OD值，绘制增值曲线并计算生长抑制率。

[0115] 结果如图6所示，为加入浓度梯度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM的xerophilusin B化合物0小时、6小时、12小时、24小时、48小时以及72小时后，KYSE-140、KYSE-150细胞、KYSE-450细胞以及KYSE-510细胞的增殖曲线情况，横坐标代表加入化合物后的6个时间检测点，纵坐标所示为以将在450nm处的吸光值进行标准化处理并作为细胞数量的衡量指标(标准化细胞指数Normalized Cell Index)。可以明确看出对于KYSE-150细胞，空白对照组细胞随时间的推移显示出细胞数逐渐增多，吸光度逐渐增大的线性趋势；随着xerophilusin B化合物浓度逐步升高，其对应的细胞增殖速率逐渐减缓，增殖曲线趋势下降，并且在72小时后xerophilusin B化合物浓度为0.5μM时，与对照组细胞吸光度相比即有显著生长抑制作用(P<0.01)，同样在1μM、2μM、5μM以及10μM浓度下，细胞增殖都被显著抑制(P值均<0.001)，当化合物达到最高10μM时，细胞在6小时时已经大部分死亡，吸光度趋近于0(图6B)。相似地，对于KYSE-450细胞，空白对照组细胞随时间的推移显示出细胞数亦逐渐增多，吸光度逐渐增大的线性趋势；随着xerophilusin B化合物浓度逐步升高，其对应的细胞增殖速率逐渐减缓，增殖曲线趋势下降，并且在72小时后xerophilusin B化合物浓度为1μM时，与对照组细胞吸光度相比即有显著生长抑制作用(P<0.01)，同样在2μM、5μM以及10μM浓度下，细胞增殖都被显著抑制(P值均<0.001)，当化合物达到最高10μM时，细胞在6小时时已经全部死亡，吸光度趋近于0。同样，在KYSE-140细胞系与KYSE-510细胞系中，都观察到xerophilusin B化合物有相同作用趋势，但是其效果没有在KYSE-150细胞与KYSE-450细胞中显著。由于此研究中的二萜类化合物均用DMSO溶液溶解为化合物原液或储存液，其对于食管鳞癌细胞的细胞毒性未知，因此为排除实验中检测到的化合物抗生长抑制活性为DMSO溶剂所致，在以上细胞增殖实验中均设置了DMSO对照组，即只加入了相同剂量的DMSO溶剂，即体积分数皆为0.1％(v/v)。检测结果显示，与只含有肿瘤细胞与培养液的空白对照组相比，DMSO溶剂对细胞增殖能力无影响，实验中使用到的DMSO浓度剂量对细胞本身没有毒性。

[0116] 根据细胞增殖实验数据结果，为更明确地比较化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用的的效果，将其转换成为细胞增殖抑制率。

[0117] 如图7所示，为加入xerophilusin B化合物作用72小时后的细胞生长抑制率情况，横坐标代表xerophilusin B化合物6个浓度梯度，纵坐标显示细胞生长抑制率，在加入不同浓度的xerophilusin B化合物后，4种食管鳞癌细胞的细胞生长抑制率均随xerophilusin B化合物浓度的升高而呈现出逐步递增的效果。在KYSE-140细胞系中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0.61％、6.50％、12.66％、29.74％、78.36％以及98.01％；在KYSE-150细胞系中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0、8.61％、25.60％、76.46％、99.05％以及99.46％；在KYSE-450细胞系中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0、0、13.12％、64.97％、95.30％以及99.08％；在KYSE-510细胞系中，作用
72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0、0、0、27.90％、90.21％以及99.11％。

[0118] 在HEK293细胞中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0、0.36％、3.44％、35.77％、83.32％以及
98.97％。

[0119] 在NIH-3T3细胞中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为4.04％、3.59％、11.44％、29.78％、65.30％以及94.30％。

[0120] Xerophilusin B化合物在两株正常细胞中的抑制率，显著低于在食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞与KYSE-450细胞中的抑制率。并且，根据以上抑制率计算出化合物作用72小时后的IC50值，结果发现在NIH-3T3细胞与HEK-293细胞中的IC50值分别为2.61μM与3.24μM，远高于在食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞(1.15μM)与KYSE-450细胞(1.70μM)的IC50值。

[0121] 可以明显看出，xerophilusin B化合物对各食管鳞癌细胞系的生长抑制作用均随浓度梯度升高表现出逐渐增强的趋势，在xerophilusin B化合物浓度达到10μM时，其在各细胞系中的生长抑制率均达到90％以上，而在KYSE-150细胞与KYSE-450细胞两株细胞系中，在xerophilusin B化合物浓度仅为1μM与2μM的极低浓度时，能够显著抑制肿瘤细胞增殖，2μM浓度下其抑制率均超过了50％，由此可见，在此两株食管鳞癌细胞中xerophilusin B化合物具有更强的杀伤作用。

[0122] 另外，根据以上xerophilusin B化合物在食管鳞癌细胞中的抑制率，计算出化合物作用72小时后的IC50值。结果如图8所示，横坐标代表各细胞系名称，纵坐标表示IC50值(μM)，在KYSE-140细胞系、KYSE-150细胞系、KYSE-450细胞系以及KYSE-510细胞系中的IC50值分别为2.79μM、1.15μM、1.70μM以及2.62μM。从以上数值可以明显看出，xerophilusin B化合物在食管鳞癌细胞细胞系KYSE-150细胞与KYSE-450细胞中的IC50值显著低于KYSE-140细胞与KYSE-510细胞，说明xerophilusin B化合物对食管鳞癌细胞细胞系KYSE-150细胞与KYSE-450细胞的生长抑制作用较强，因此择取此两株细胞系继续进行细胞功能实验。

[0123] 2、Xerophilusin B作用食管鳞癌细胞后的形态学观察

[0124] 通过光学显微镜观察细胞形态可以反映细胞生存状态及活力，利用高倍镜肉眼可直接观察到细胞的基本形态、细胞膜、细胞质(浆)以及细胞核，具体方法如下：

[0125] 1)实验分组：化合物Xerophilusin B浓度设0μM、2μM与5μM三个浓度梯度，每个浓度各设3个复孔，加药前，用吸管吸弃孔中原有培养基，滴加入新鲜完全培养基2mL，六孔板中实验组中加入浓度为200μM或500μM的xerophilusin B溶液20uL/孔，因此加入后体系中药液浓度为2μM及5μM。对照组加入等量DMSO溶剂，每组各设3个平行复孔。

[0126] 2)应用无水乙醇或95％酒精棉球将显微镜载物台、目镜、物镜、调节旋钮以及显微镜周围区域严格消毒。

[0127] 3)将传代培养或加入化合物处理后的细胞培养瓶或培养板，旋紧瓶盖或压紧顶盖后从培养箱中小心取出。

[0128] 4)打开倒置显微镜开关，调节灯光亮度，将细胞培养瓶或培养板轻置于载物台上。

[0129] 5)从目镜中观察视野，同时调节物镜与培养瓶底面的距离，调节至最清晰时停止。

[0130] 6)移动培养瓶或培养板以选择最佳观察区域，或调节物镜倍数以便更清晰观察细微结构。

[0131] 7)反复调整物镜与载物台间距离已达到清晰视野，利用照相机拍摄记录细胞画面。

[0132] 8)适当晃动培养瓶以观察是否有絮状物或颗粒状物，仔细辨别是否为污染以便及时处理，以免造成实验假阳性。

[0133] 结果如图9所示，对于KYSE-150细胞，空白对照组中细胞排列均匀，细胞间连接紧密，细胞形态正常，呈多边形，细胞核呈卵圆形，与细胞质比例正常，细胞胞质中无空泡，培养基颜色正常透明无浑浊，培养基中无絮状等杂质，无细胞分泌颗粒，细胞增殖旺盛。当加入2μM浓度的xerophilusin B化合物后，24小时观察到细胞形态改变，其细胞膜破裂，细胞增殖减弱，细胞数与正常对照组相比明显减少，细胞形状由多边形变为圆形，细胞体积增大，细胞内出现空泡，细胞核形状改变呈不规则状，细胞核内染色体形状改变，细胞质核比例改变，细胞表面突出膜泡状小泡，细胞间连接大部分消失，部分细胞脱离培养板底壁并飘入细胞培养基中，培养基中悬浮有颗粒状细胞分泌物，培养基颜色较暗淡，但并未发现有浑浊或污染现象。当加入5μM浓度的xerophilusin B化合物后，24小时可观察到大部分细胞完全失去正常细胞形态，细胞内结构紊乱，细胞膜破碎，细胞内容物漏出，细胞表面及周围附有大量膜泡状结构，细胞核碎裂，细胞间连接消失，细胞黏附能力大大降低，轻微震荡晃动培养板即可使贴壁细胞脱离培养板底壁，培养基颜色晦暗，悬浮大量死亡细胞及细胞碎片，但未观察到有微生物或病原体污染的迹象。

[0134] 同样，在加入xerophilusin B化合物后的食管鳞癌KYSE-450细胞中，也观察到了相似的现象。在空白对照组中细胞排列均匀，细胞间连接紧密，细胞形态正常，呈多角形，细胞核呈卵圆或圆形，核质比例正常，细胞胞质中无空泡，培养基颜色正常透明无浑浊，培养基中无絮状等杂质，无细胞分泌颗粒，细胞增殖旺盛。当加入2μM浓度的xerophilusin B化合物后，24小时观察到细胞形态改变，其细胞膜破裂，细胞增殖减弱，细胞数与正常对照组相比明显减少，细胞形状由多角形变为卵圆形或圆形，细胞体积增大，细胞内出现空泡，细胞核形状改变呈不规则状，细胞核内染色体形状改变，细胞质核比例改变，细胞表面突出膜泡状小泡，细胞间连接大部分消失，部分细胞脱离培养板底壁并飘入细胞培养基中，培养基中悬浮有颗粒状细胞分泌物，培养基颜色较暗淡，但并未发现有浑浊或污染现象。当加入5μM浓度的xerophilusin B化合物后，24小时可观察到绝大部分细胞完全失去正常细胞形态，细胞内结构紊乱，细胞膜破碎，细胞内容物漏出，细胞表面及周围附有大量膜泡状结构，细胞核碎裂，细胞间连接消失，细胞黏附能力显著降低，轻微震荡晃动培养板即可使贴壁细胞脱离培养板底壁，培养基颜色晦暗，悬浮大量死亡细胞及细胞碎片，但也未观察到有微生物或病原体污染的迹象。

[0135] 由此，通过形态学的观察，可以发现并证实xerophilusin B化合物对食管鳞癌细胞生长具有明显的杀伤性，可显著改变细胞形态与生长活性。

[0136] 3、Xerophilusin B对食管鳞癌细胞体内裸鼠成瘤作用的影响

[0137] 实验用BALB/cA-nu裸鼠购自于北京华阜康生物科技有限公司，在裸鼠经过1周左右适应笼舍之后，随机对实验动物进行耳钉编号分组，每组5只，分成8组。随机选取其中的4组，对于每只裸鼠分别在腋下注射2×107个KYSE-150细胞，另外的3组在每只裸鼠的腋下注射2×107个KYSE-450细胞，在动物饲养室内饲养7天，并于接种之后的第3天和第7天测量皮下成瘤的尺寸。截至皮下注射成瘤后的第7天，接种KYSE-150细胞与KYSE-450细胞的8组实验动物全部成活并且全部在皮下形成移植瘤。

[0138] 从接种细胞之后的第7天开始，化合物实验组每天给每只裸鼠腹腔注射7.5mg/kg浓度或15mg/kg浓度的xerophilusin B化合物溶液200uL，顺铂组每2天注射1次2mg/kg浓度的顺铂稀释液，空白正常对照组每天注射同等剂量Pluronic F68溶液200uL，具体分组情况如图10所示。接种KYSE-150细胞的各组裸鼠自首次腹腔注射给药后共注射19天，化合物组共接受xerophilusin B化合物腹腔注射19次，顺铂组共接受顺铂注射液腹腔给药11次，接种KYSE-450细胞的各组裸鼠自首次腹腔注射给药后共注射20天，化合物组共接受xerophilusin B化合物腹腔注射20次，顺铂组共接受顺铂注射液腹腔给药11次。以上每组中每只裸鼠在给药之前测量移植瘤的体积，称量裸鼠体重，并观察实验裸鼠的生活状态。

[0139] 在实验过程中，注射Pluronic F68与化合物xerophilusin B的裸鼠体重自然增加，行动敏捷，食欲正常，皮毛密集有光泽；而注射顺铂的裸鼠精神萎靡，倦卧少动，皮毛干涩，食欲不佳。根据肿瘤尺寸的测量数据计算肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。接种KYSE-150细胞的各组裸鼠与接种KYSE-450细胞的各组裸鼠分别于接种后第26天与第27天，使用引颈法处死实验裸鼠，仔细剥取肿瘤组织，记录拍照之后进行称重。

[0140] 在接种KYSE-150组的实验动物组中(图11，A为曲线，B为表型)，注射Pluronic F68溶液的空白对照组有1只裸鼠由于瘤体增长迅速在第17天衰竭死亡，由接受相同处理的候补裸鼠入组后参与最终的统计分析。将注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物组与Pluronic F68溶液的空白对照组进行比较，结果发现肿瘤的生长在第1～4天没有显著差异，但是从接种细胞后的第5天开始直至处死实验动物的第19天，注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，采用Bonferroni post t检验发现化合物组与空白对照组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p<0.001)。同样，将注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物组与Pluronic F68溶液的空白对照组进行比较，结果发现肿瘤的生长在第1～3天没有显著差异，但是从接种细胞后的第4天开始直至处死实验动物的第19天，注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，采用Bonferroni post t检验发现化合物组与空白对照组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p<0.001)。

[0141] 从接种细胞后的第3天开始直至处死实验动物的第19天，注射顺铂注射液的顺铂组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，采用Bonferroni post t检验发现两组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p<0.001)。结果说明在体内腹腔注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物以及注射
15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物能够显著抑制KYSE-150移植瘤的生长。

[0142] 同样，在接种KYSE-450组的实验动物组中(图12，A为曲线，B为表型)，注射顺铂注射液的顺铂组实验动物有1只裸鼠由于顺铂药物毒性副作用导致逐渐衰竭并在第19天衰竭死亡，由接受相同处理的候补裸鼠入组后参与最终的统计分析。将注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物组与Pluronic F68溶液的空白对照组进行比较，结果如图15A所示，发现肿瘤的生长在第1～7天没有显著差异，但是从接种细胞后的第8天开始直至处死实验动物的第20天，注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，采用Bonferroni post t检验发现化合物组与空白对照组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p<
0.001)。同样，将注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物组与Pluronic F68溶液的空白对照组进行比较，结果发现肿瘤的生长在第1～6天没有显著差异，但是从接种细胞后的第7天开始直至处死实验动物的第20天，注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，化合物组与空白对照组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p<0.001)。

[0143] 在接种细胞后的第3天开始直至处死实验动物的第20天，注射顺铂注射液的顺铂组实验动物移植瘤的体积明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，采用Bonferroni post t检验发现两组移植瘤的生长曲线之间的差异具有统计学意义(p＜0.001)。结果说明在体内腹腔注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物以及注射
15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物能够显著抑制KYSE-450移植瘤的生长。

[0144] 对于KYSE-150移植瘤裸鼠，在腹腔注射后第19天处死动物，仔细解剖剥离移植瘤之后称重，体内腹腔注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物实验动物移植瘤的重量明显小于腹腔注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.01，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义；同样，体内腹腔注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物实验动物移植瘤的重量明显小于腹腔注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.001，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义。相似地，注射顺铂注射液的顺铂组实验动物移植瘤的重量明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.001，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义。结果说明7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物与15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物皆能在KYSE-150细胞成瘤实验中的确能够抑制肿瘤细胞的生长(图13A)。

[0145] 同样，对于KYSE-450移植瘤裸鼠在腹腔注射后第20天处死动物，瘤体称重后发现，体内腹腔注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物实验动物移植瘤的重量明显小于腹腔注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.01，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义；体内腹腔注射15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物实验动物移植瘤的重量明显小于腹腔注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.001，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义。注射顺铂注射液的顺铂组实验动物移植瘤的重量明显小于注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验动物，p<0.001，两组移植瘤重量之间的差异具有统计学意义。结果说明7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物与15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物皆能在KYSE-450细胞成瘤实验中能够有效抑制肿瘤细胞的生长(图13B)。

[0146] 将KYSE-150细胞裸鼠与KYSE-450细胞裸鼠分别在皮下接种食管鳞癌细胞22天与23天后处死实验裸鼠，仔细分离皮下移植瘤，记录并称重之后将裸鼠移植瘤组织切成两部分，其中一部分立刻用中性福尔马林溶液固定24小时，然后用石蜡包埋组织形成蜡块并进行病理组织切片，使用苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)进行免疫组织化学染色。另外一部分同样立刻应用中性福尔马林溶液固定留作备用。在解剖分离皮下的移植瘤时，可以发现7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物实验动物与15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物实验动物的瘤体，其瘤体质地较紧实，瘤体外表面由一层透明被膜包裹，瘤体本身与皮肤及周围皮下组织无粘连，分离时可以轻易迅速地将瘤体取下，取下后观察到瘤体表面光滑呈椭圆形，无明显血管分布。在解剖切取腹腔注射Pluronic F68溶液的空白对照组实验裸鼠皮下瘤体时，发现瘤体皆硕大，瘤体部位皮肤粗糙，皮下有淤血，个别皮肤表面可见瘤体破溃后形成的溃疡及渗出，瘤体表面坑洼，瘤体形状不规则，解剖分离时与皮肤粘连紧密，瘤体被膜破溃并有菜花状结节膨出，浸润周边肌肉组织，攀附于肩胛部和上肢骨骼周围，分离出的瘤体质地较均匀，瘤体表面可观察到有大量血管分布，用纱布擦拭后出血明显，切开时质地较紧实，瘤体结构较致密。另外，在解剖切取腹腔注射顺铂注射液的顺铂组实验裸鼠皮下瘤体时，发现瘤体范围局限，但瘤体部位皮肤粗糙，瘤体表面凹凸不平，解剖分离时瘤体表面有被膜覆盖，与皮肤粘连较少，切开时瘤体质地较硬，瘤体结构致密(图11B、12B)。

[0147] 将接种了食管鳞癌细胞系KYSE-150的裸鼠实验组分离出来的移植瘤，经过中性甲醛固定液固定、脱水、透明、浸蜡与石蜡包埋、切片之后，每个裸鼠来源肿瘤标本的切片选取10张进行免疫组化HE染色。

[0148] 结果如图14所示。在HE染色切片上100倍放大的视野下，在注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物裸鼠移植瘤切片中观察到遍布的斑片状小坏死灶，经400倍放大视野后可观察到局部病灶的食管鳞癌细胞出现细胞核明显固缩、染色加深的现象。在解剖分离并切开注射了15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物KYSE-150裸鼠移植瘤瘤体时，发现其中央部位出现明显的大面积干酪状坏死灶或液化灶，内容物排除后形成较大的坏死腔，将其HE切片于100倍放大的显微镜视野下，可观察到在移植瘤瘤体中央部位有大面积液化坏死造成的空洞，空洞内可看到液化的细胞组织碎片。而在HE染色切片上400倍放大的视野下观察，发现空洞周边病灶的食管鳞癌细胞出现细胞核固缩、染色加深等细胞凋亡的征象。当镜下观察注射了Pluronic F68溶液的KYSE-150空白对照组裸鼠移植瘤瘤体时，在HE染色切片上100倍放大的视野下发现其瘤体内质地均匀无坏死，肿瘤细胞排列紧密，在HE染色切片上400倍放大的视野下，可观察到细胞核核分裂相明显，染色体粗大，细胞核比例高，细胞增殖力旺盛。镜下观察注射了顺铂注射液的顺铂组KYSE-150实验裸鼠移植瘤瘤体时，在HE染色切片上100倍放大的视野下发现其瘤体内质地紧密，肿瘤细胞排列紧密，肿瘤细胞间分布有结缔组织，局灶可观察到有小斑片状细胞坏死灶存在，在HE染色切片上400倍放大的视野下，可观察到细胞核核分裂相明显，染色体粗大，细胞核比例高，细胞增殖力旺盛。

[0149] 同样，在相同条件下将接种了食管鳞癌细胞系KYSE-450的裸鼠实验组分离出来的移植瘤。结果如图14所示，在HE染色切片上100倍放大的视野下，在注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B的低浓度化合物裸鼠移植瘤切片中即可观察到遍布的大面积空泡状坏死灶与液化灶，经400倍放大视野后可观察到局部病灶的食管鳞癌细胞同样出现细胞核明显固缩、染色加深。在15mg/kg浓度xerophilusin B的高浓度化合物组移植瘤瘤体中，发现其中央部位出现明显的大面积干酪状坏死灶或液化灶，内容物排除后形成较大的坏死腔，100倍视野下可观察到在移植瘤瘤体中央部位有大面积液化坏死造成的空洞，空洞内可看到液化的细胞组织碎片。而在400倍视野下发现空洞周边病灶的食管鳞癌细胞出现细胞形状改变、核固缩、染色加深等细胞凋亡的征象。观察注射Pluronic F68溶液的空白对照组瘤体时，在100倍视野下发现其瘤体内遍布粗大血管管腔，扩张的血管管腔被增长迅速的肿瘤瘤体压迫变形呈不规则状，瘤体质地均匀无坏死，肿瘤细胞排列紧密，在400倍视野下可观察到细胞核核分裂相明显，染色体粗大，细胞核比例高，细胞增殖力旺盛。镜下观察注射顺铂注射液的顺铂组移植瘤瘤体时，在100倍视野下发现其瘤体内质地紧密，肿瘤细胞排列紧密，肿瘤细胞间分布有结缔组织，局灶可观察到有小斑片状细胞坏死灶存在，在400倍视野下可观察到细胞核核分裂相明显，染色体粗大，细胞核比例高，细胞增殖力旺盛。

[0150] HE染色切片的结果表明，化合物xerophilusin B能够有效抑制体内肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞死亡，从镜下观察到的一系列的现象推测其导致肿瘤细胞死亡的原因机制可能为通过凋亡实现，其具体机制需要进一步通过以下实验逐步验证。

[0151] 4、Xerophilusin B对食管鳞癌细胞周期分布的影响

[0152] 为进一步研究化合物xerophilusin B在体内与体外实验中导致食管鳞癌细胞死亡、抑制瘤体增长的原因与机制，在经加药处理之后，收集细胞并使用乙醇固定完成，经过PI染色采用流式细胞技术检测并分析化合物xerophilusin B(2μM和5μM)对于细胞周期的影响。另外，采用周期染剂检测技术进一步验证化合物xerophilusin B对肿瘤细胞周期分布的影响。

[0153] 1)将处于对数期生长的KYSE-150与KYSE-450细胞用0.25％胰酶消化下来后，用相3
应的完全培养基吹打重悬，经细胞计数仪计数并接种于六孔板中，每孔细胞数约2×10个/孔。进行细胞接种时，将细胞悬液滴入孔中后应及时轻轻左右上下摇晃六孔板，以避免细胞成簇团集与一处，造成叠加生长局部过满，影响后续处理。

[0154] 2)在37℃和5％的CO2细胞培养箱中培养12小时，待细胞完全贴壁之后，观察以确定细胞融合度达到60～70％以上。

[0155] 3)加药前，用吸管吸弃孔中原有培养基，滴加入新鲜完全培养基2mL，六孔板中实验组中加入浓度为200μM或500μM的xerophilusin B溶液20ul/孔，因此加入后体系中药液浓度为2μM及5μM。对照组加入等量DMSO溶剂，每组各设3个平行复孔。

[0156] 4)加药24小时之后，更换无血清RPMI1640/DMEM/MEM培养基，在37℃和5％的CO2细胞培养箱中培养12小时或过夜对细胞进行同步化处理，然后更换含有10％胎牛血清的RPMI1640/DMEM/MEM完全培养基继续于培养箱中培养24小时。

[0157] 5)吸弃原有完全培养基，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，然后使用0.25％胰酶消化细胞，使用含有10％胎牛血清的RPMI1640/DMEM/MEM完全培养基悬浮细胞，经过短暂离心之后使用PBS磷酸盐缓冲液冲洗细胞，短暂离心之后弃去上清。

[0158] 6)使用1×Buffer A缓冲液洗涤细胞后，在1500转/分的条件下短暂离心并弃掉上清液，重复以上步骤3次，加入适量1×Buffer A缓冲液以重悬细胞，收集并利用细胞计数仪进行细胞计数，使每孔细胞悬液的最终浓度达到1～2×106个/mL。

[0159] 7)向细胞悬浮液中加入9倍体积的70％乙醇溶液，轻轻吹打混匀，于4℃条件下固定至少24小时(4℃避光固定过夜，或-20℃避光长期固定)。操作时需注意不可剧烈震荡装有固定细胞的Ep管，以免损伤细胞。

[0160] 8)检测前，将固定细胞取出，在1500转/分的条件下短暂离心后收集细胞，之后使用1×Buffer A缓冲液洗涤细胞以除去乙醇，将固定细胞重悬于400μL的1×Buffer A缓冲液中。

[0161] 9)在每孔中加入100ul浓度为1％的RNaseA溶液以避免RNA干扰，使其终浓度达到0.25mg/mL，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。装有细胞的Ep管应用封口膜密封后再置于水浴箱中，以免水蒸气进入影响实验结果。

[0162] 10)将Ep管从水浴箱中取出，擦拭表面水雾，可以观察到管中细胞沉降在管底，切勿剧烈震摇或混匀，以免损伤细胞致其破裂。于每孔中加入5μL的PI溶液，在室温条件下避光孵育至少30分钟。然后迅速将悬液吸入流式管中，应用流式细胞仪进行检测。检测前用手指轻轻弹敲流式管，促进其混匀，以避免阻塞流式检测探头。

[0163] 11)应用ModFit LT3.2(Verity Software House Co.,USA)分析软件计算并分析G0/G1期，S期以及G2/M期各个时相细胞的百分率。

[0164] 对于食管鳞癌细胞系KYSE-150，如图15所示，在正常对照组中，最左边的蓝色峰代表所有检测细胞中发生凋亡的细胞所占的比例，其右侧高尖的红色峰代表G1期细胞所占比例，此峰右侧稍低矮的红色峰代表G2/M期细胞所占比例，两个红色峰中间的浅灰色矮峰代表S期细胞所占的比例。当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，流式细胞术检测结果显示其G2/M期细胞所占平均比例为31.82％，高于正常对照组细胞G2/M期细胞所占平均比例(22.27％)，差异有统计学意义(p<0.001)；还检测到其G1期细胞所占比例为32.46％，低于对照组细胞G1期细胞所占平均比例(45.45％)，差异有统计学意义(p<
0.001)；此外，其S期细胞所占比例为35.72％，高于正常对照组细胞S期细胞所占平均比例(32.27％)，虽然其差异没有统计学意义(p>0.05)，但其比例也可以看出为升高趋势。当化合物xerophilusin B的浓度达到5μM时，流式细胞术检测结果显示发生凋亡的细胞比例达
39.67％，显著高于正常对照组细胞凋亡细胞所占比例(1.34％)及2μM xerophilusin B实验组细胞凋亡细胞所占比例(2.84％)，其差异都具有显著的统计学意义(p<0.001)。

[0165] 同样地，对于食管鳞癌细胞系KYSE-450，如图15所示，当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，流式细胞术检测结果显示其G2/M期细胞所占平均比例为31.78％，高于正常对照组细胞G2/M期细胞所占平均比例(19.65％)，差异有统计学意义(p<0.001)；还检测到其G1期细胞所占比例为33.91％，低于对照组细胞G1期细胞所占平均比例(51.89％)，差异有统计学意义(p<0.001)；此外，其S期细胞所占比例为34.31％，高于正常对照组细胞S期细胞所占平均比例(28.46％)，其差异有统计学意义(p<0.01)。当化合物xerophilusin B的浓度达到5μM时，流式细胞术检测结果显示其发生凋亡的细胞比例高达62.05％，显著高于正常对照组细胞凋亡细胞所占比例(1.56％)及2μM xerophilusin B实验组细胞凋亡细胞所占比例(1.75％)，其差异都具有显著的统计学意义(p<0.001)。

[0166] 上述实验结果表明，在食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞和KYSE-450细胞中，当加入浓度为2μM的化合物xerophilusin B后，能够对肿瘤细胞的周期产生显著影响，其G2/M期细胞比例显著升高，G1期细胞比例显著下降，差异皆具有统计学意义，S期细胞有升高趋势，由此可认为，此低浓度下xerophilusin B主要通过影响细胞周期使细胞阻滞于G2/M期。而当化合物浓度升高至高浓度5μM时，肿瘤细胞死亡细胞量显著增多，因此，高浓度xerophilusin B主要通过促进细胞凋亡抑制细胞增殖。

[0167] 5、Xerophilusin B对食管鳞癌细胞凋亡的影响

[0168] 为了验证细胞形态学以及周期检测中关于化合物xerophilusin B导致的细胞凋亡的检测结果，进一步利用流式细胞技术，使用FITC-AnnexinV和PI分别染色并检测化合物xerophilusin B对食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞与KYSE-450细胞凋亡水平的影响。

[0169] 1)将处于对数期生长的KYSE-150与KYSE-450细胞用0.25％胰酶消化下来后，用相应的完全培养基吹打重悬，经细胞计数仪计数并接种于六孔板中，每孔细胞数约2×103个/孔。进行细胞接种时，将细胞悬液滴入孔中后应及时轻轻左右上下摇晃六孔板，以避免细胞成簇团集与一处，造成叠加生长局部过满，影响后续处理。

[0170] 2)加药前，用吸管吸弃孔中原有培养基，滴加入新鲜完全培养基2mL。

[0171] 3)在37℃和5％的CO2细胞培养箱中培养12小时贴壁之后，使细胞融合度达到60～70％以上，六孔板中实验组中加入浓度为200μM或500μM的xerophilusin B溶液20uL/孔，因此加入后体系中药液浓度为2μM及5μM。对照组加入等量DMSO溶液。每组各设3个平行复孔。

[0172] 4)待加药后24h与48小时，用吸管吸弃原培养基，用冷却的PBS磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，然后用完全培养基将细胞从六孔板壁上吹打冲洗下来，使用含有10％胎牛血清的RPMI1640/DMEM/MEM完全培养基悬浮细胞，转移到15ml的离心管中，经过短暂离心之后，用冷却的PBS磷酸盐缓冲液清洗细胞2次。注意胰酶中不能含有乙二胺四乙酸(EDTA)，细胞消化时间以及PBS磷酸盐缓冲液清洗时间不宜过长，否则易造成结果的假阳性。

[0173] 5)将试剂盒中的10×AnnexinV结合缓冲液(0.1M Hepes/NaOH(pH 7.4)，1.4M的NaCl,25mM的CaCl2)按照1:10的比例用无菌双蒸水进行稀释，配制成流式结合缓冲液。

[0174] 6)将细胞悬液加入离心管中，按照800r/min的转速条件进行短暂离心5分钟，使用新配制好的AnnexinV结合缓冲液工作液将细胞重悬，然后使用细胞计数仪进行细胞计数，使细胞悬液的最终浓度达到至少1～2×106个/mL。

[0175] 7)从细胞悬液中吸出100μL(含有1～2×105个细胞)转移到新的无菌Ep管中，做好标记后放置在冰上操作。

[0176] 8)向Ep管中加入5μL的FITC-AnnexinV染剂，在室温条件下于超净台中避光静置15～20分钟。

[0177] 9)向Ep管中加入5μL的PI染料溶液，在室温条件下避光静置约5分钟，注意对于每一种待测细胞KYSE-140，KYSE-150，KYSE-450，KYSE-510，NIH-3T3或HEK-293，必须准备单染和空白对照细胞用以设定流式细胞具体参数，即预留3管100μL(含有2×105个细胞)细胞悬液，其中1管不加任何试剂，1管只加入5μL的FITC-AnnexinV染剂溶液，1管只加入5μL的PI染料溶液。

[0178] 10)在流式细胞仪上机之前，向每个Ep管中加入400μL的AnnexinV结合缓冲液工作液进行孵育，在15分钟之内上机检测。操作时需注意不可剧烈震荡装有固定细胞的管，以免损伤细胞。

[0179] 11)检测时迅速将悬液吸入流式管中，应用流式细胞仪进行检测。检测前用手指轻轻弹敲流式管，促进其混匀，以避免阻塞流式检测探头。

[0180] 12)在下机的检测结果中，流式凋亡图中所示的横坐标是AnnexinV FITC,纵坐标是PI，左上、右上、左下及右下四个象限中，右上象限代表已死亡的细胞，左下象限是尚存活的细胞，右下象限代表的是凋亡的细胞。

[0181] 检测结果如图16A、C所示，对于食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞，当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，流式图中可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比明显增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为21.67％，高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例(5.13％)，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液48小时后，流式图中，可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比显著增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为35.17％，高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例(6.07％)，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入5μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，在流式图中同样可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比明显增多，其中早期凋亡细胞比例增加最为显著。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为88.47％，升高更加明显，与空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例相比，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入5μM浓度xerophilusin B化合物溶液48小时后，流式图中可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比显著增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为94％，高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。

[0182] 对于食管鳞癌细胞系KYSE-450细胞如图16B、C所示，当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，流式图中可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比明显增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为21.67％，高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例(4.07％)，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入2μM浓度xerophilusin B化合物溶液48小时后，流式图中可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比显著增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为39.87％，高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例(4.53％)，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入5μM浓度xerophilusin B化合物溶液24小时后，在流式图中同样可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比明显增多，其中早期凋亡细胞比例增加最为显著。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为90.97％，升高更加明显，与空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例相比，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。当加入5μM浓度xerophilusin B化合物溶液48小时后，流式图中可以看到代表早期凋亡细胞的右下象限中的细胞比例以及代表晚期凋亡细胞的细胞比例，与空白正常对照组中各象限的细胞比例相比显著增多。流式细胞术检测结果显示其FITC-AnnexinV染色阳性的细胞比例即早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的总和比例为96.57％，远高于空白正常对照组细胞中AnnexinV染色阳性的比例，差异具有显著统计学意义(p<0.001)。

[0183] 上述结果表明，化合物xerophilusin B能够促进食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞和KYSE-450细胞中发生凋亡，使处于凋亡阶段的细胞比例升高，差异具有显著统计学意义。

[0184] 6、Xerophilusin B对食管鳞癌细胞中凋亡通路蛋白表达的影响

[0185] 从以上实验研究结果中可以得出，化合物xerophilusin B能够通过诱导细胞凋亡抑制体外培养的食管鳞癌细胞增殖并抑制体内接种移植瘤的生长，为进一步深入探讨化合物xerophilusin B导致细胞凋亡的分子机制，提取了不同浓度化合物xerophilusin B作用前后食管鳞癌细胞的蛋白，并运用Western blot蛋白印迹检测技术定量检测分析与细胞凋亡密切相关的内源性信号通路蛋白，即依赖细胞色素c活性的caspase-9与caspase-3级联激活信号通路。

[0186] 本研究中用于检测cytochrome c，pro-caspase-9cleaved-caspase-9，pro-caspase-3，cleaved-caspase-3，pro-caspase-7，PARP，Bax以及Bcl-2蛋白表达水平的抗体购自于CST(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)公司，以上各蛋白的兔抗人单克隆抗体即Rabbit anti-cytochrome c，pro-caspase-9cleaved-caspase-9，pro-caspase-3，cleaved-caspase-3，pro-caspase-7，PARP，Bax以及Bcl-2monoclone antibody，购自于CST公司，作为内参的β-actin抗体购自于Albgent(San Diego，USA)公司。β-actin二抗以及以上各抗体二抗均购自ProteinTech公司(Chicago，USA)。

[0187] 提取食管鳞癌细胞系KYSE-150与KYSE-450细胞总蛋白，使用BCA Protein Assay Kit(Themo,Rockford,USA)试剂盒配制标准蛋白浓度梯度溶液并检测待测样本蛋白浓度，进行总蛋白，一抗为兔抗人单克隆抗体，二抗为羊抗兔。

[0188] 在培养的细胞内加入浓度为0.5μM，1μM，2μM以及5μM的xerophilusin B化合物，加药24小时后提取细胞总蛋白后加入内参蛋白β-actin的抗体，显影后发现，相同条件下对于KYSE-150细胞，0.5μM、1μM以及2μM浓度的xerophilusin B化合物处理后的细胞，其细胞内β-actin蛋白的含量与正常对照组细胞内β-actin蛋白的含量无明显差异，而当化合物浓度升高达到5μM时，检测到细胞内β-actin蛋白含量明显降低。同样地，对于KYSE-450细胞，0.5μM、1μM以及2μM浓度的xerophilusin B化合物处理后的细胞，其细胞内β-actin蛋白的含量与正常对照组细胞内β-actin蛋白的含量虽有所减低但无显著差异，而当化合物浓度升高达到5μM时，检测到细胞内β-actin蛋白含量降低至无法识辨。因此，将0.5μM，1μM，2μM浓度的化合物作为后续食管鳞癌细胞内凋亡信号通路蛋白分子含量检测的浓度范围(图17)。

[0189] 如图18所示，当在食管鳞癌细胞细胞系KYSE-150细胞中加入1μM极微量xerophilusin B化合物后，使作为细胞凋亡促进因子的细胞色素c的蛋白表达量明显升高，当化合物浓度升高至2μM后，细胞色素c蛋白表达水平显著升高。表达量升高的细胞色素c激活下游胱氨酸蛋白激酶caspase-9使其由无活性的蛋白酶原形式(47kDa)降解成为有活性的酶形式(37kDa)，可以观察到随着化合物xerophilusin B的浓度逐渐升高，Pro-caspase-
9蛋白水平明显下调，并且同时伴随着其剪切形式Cleaved caspase-9蛋白表水平逐级上升。当发现诱发凋亡的关键蛋白因子细胞色素c蛋白与Pro-caspase-9蛋白含量水平升高后，继续深入检测其下游级联激活反应链条上的关键因子caspase-3，检测结果显示伴随着化合物xerophilusin B的浓度逐渐升高，Pro-caspase-3酶原蛋白水平明显下调，并且同时伴随着其剪切形式Cleaved caspase-3蛋白平逐渐上升，并且还检测到caspase-3激酶下游的Pro-caspase-7酶原蛋白水平随化合物浓度水平升高而降低。作为DNA损伤的感受器，PRAP蛋白能够被caspase家族激酶作为切割底物而降解，从而导致DNA损伤修复失灵，最终细胞发生凋亡。研究检测到随着化合物xerophilusin B浓度逐渐升高，PRAP蛋白水平逐渐下降，当浓度达到2μM时，蛋白水平显著下调，这也印证了在细胞形态学及流式细胞凋亡检测中得到的结果。同样，对于食管鳞癌细胞细胞系KYSE-450细胞也发现了相似的结果，随着化合物xerophilusin B的浓度逐渐升高细胞色素c的蛋白表达量明显升高，当化合物浓度升高至2μM后，细胞色素c蛋白表达水平显著升高。Pro-caspase-9蛋白水平明显下调，并且同时伴随着其剪切形式Cleaved caspase-9蛋白表水平逐级上升。Pro-caspase-3酶原蛋白水平明显下调，并且同时伴随着其剪切形式Cleaved caspase-3蛋白平逐渐上升，其下游的Pro-caspase-7酶原蛋白水平随化合物浓度水平升高而降低。另外还检测到随着化合物xerophilusin B浓度逐渐升高，导致DNA修复酶PARP(poly ADP-ribose polymerase)蛋白水平逐渐下降。

[0190] 在凋亡调控机制中，线粒体膜通透性的增加能够使细胞内外的凋亡激活因子进入线粒体，或使线粒体内的凋亡促进因子进入细胞胞浆中，从而造成细胞凋亡程序启动，在此过程中，位于线粒体膜上的Bcl-2蛋白家族分子的Bcl-2蛋白，作为促细胞生存(即抗凋亡)因子，起着关键的调节作用，同时此家族的另一成员Bax蛋白为促凋亡因子，能够与Bcl-2蛋白共同调节线粒体内外因子的进出。因此，为探讨化合物xerophilusin B是否是通过影响Bcl-2家族蛋白的表达来促使线粒体中的凋亡诱导因子释放入细胞中，检测了加入化合物xerophilusin B前后细胞中Bcl-2蛋白与Bax蛋白表达水平。应用β-actin作为内参蛋白。

[0191] 如图19A所示，当在食管鳞癌细胞细胞系KYSE-150细胞中加入xerophilusin B化合物后，可以观察到随着化合物xerophilusin B的浓度逐渐升高，Bax蛋白水平明显上调，同时Bcl-2蛋白表达水平出现下降趋势。相似地，当在食管鳞癌细胞细胞系KYSE-450细胞中加入xerophilusin B化合物后，也观察到随着化合物xerophilusin B的浓度逐渐升高，Bax蛋白水平明显上调，同时Bcl-2蛋白表达水平出现下降的趋势。并且，经过对Bcl-2蛋白与Bax蛋白表达量经β-actin校准后比值的分析，发现随着化合物xerophilusin B浓度的逐渐升高，Bcl-2/Bax比值逐渐降低，对于KYSE-150细胞，当化合物浓度为0.5μM、1μM及2μM时，其Bcl-2/Bax比值分别为0.72、0.2及0.18。对于KYSE-450细胞，当化合物浓度为0.5μM、1μM及2μM时，其Bcl-2/Bax比值分别0.51、0.43以及0.14，均逐渐递减(图19B)。

[0192] 由此，上述结果表明，化合物xerophilusin B通过调节BCL-2与Bax蛋白水平促使细胞膜的通透性增加，从而使外源性的细胞色素c进入细胞内或线粒体内，随后引发胱氨酸蛋白酶casepase-9、caspase-3以及caspase-7蛋白由无活性蛋白酶原形式转变为活性形式，进而发生一系列级联激活反应，最后导致PARP降解，DNA损伤无法修复而启动细胞凋亡程序，细胞最终死亡。

[0193] 7、Xerophilusin B抗食管鳞癌细胞的安全性评价

[0194] 1)、Xerophilusin B对正常细胞系NIH-3T3与HEK-293生长的影响

[0195] 对于化合物的安全性评价是研究化合物是否能够特异杀伤肿瘤细胞从而成为抗肿瘤药物前体的重要步骤。为了能够进一步研究xerophilusin B是否能够对食管鳞癌细胞系的起到特异性杀伤作用，又检测了化合物xerophilusin B对两株正常细胞系即小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3与人胚肾细胞系HEK293的毒性作用，分别在加药后0小时、6小时、12小时、24小时、48小时以及72小时后，应用Cell Counting Kit-8法检测xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时的450nm处的吸光值即OD值，绘制增值曲线并计算生长抑制率。

[0196] 如图20所示，为加入浓度梯度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM的xerophilusin B化合物0小时、6小时、12小时、24小时、48小时以及72小时后，NIH-3T3细胞与HEK-293细胞的增殖曲线情况。可以明确看出对于NIH-3T3与HEK-293细胞，空白对照组细胞随时间的推移显示出细胞数逐渐增多，吸光度逐渐增大的线性趋势；随着xerophilusin B化合物浓度逐步升高，其对应的细胞增殖速率逐渐减缓，增殖曲线趋势下降。

[0197] 根据细胞增殖实验数据结果，为更明确地比较化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用的的效果，将其转换成为细胞增殖抑制率。如图7所示，为加入xerophilusin B化合物作用72小时后的细胞生长抑制率情况。在NIH-3T3细胞系中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为4.04％、3.59％、11.44％、29.78％、65.30％以及94.30％；在HEK-293细胞系中，作用72小时后xerophilusin B化合物在其浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM以及10μM时，生长抑制率分别为0、0.36％、
3.44％、35.77％、83.32％以及98.97％。另外，根据以上xerophilusin B化合物在食管鳞癌细胞中的抑制率，计算出化合物作用72小时后的IC50值。如图8所示，在NIH-3T3细胞与HEK-
293细胞中的IC50值分别为2.61μM与3.24μM，远高于在食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞(1.15μM)与KYSE-450细胞(1.70μM)的IC50值。

[0198] 可以明显看出，虽然xerophilusin B化合物对NIH-3T3与HEK-293两株正常细胞系的生长抑制作用均随浓度梯度升高也表现出逐渐增强的趋势，但在相同条件下各浓度xerophilusin B化合物对两株正常细胞系的生长抑制率均低于xerophilusin B化合物对食管鳞癌细胞系KYSE-150细胞与KYSE-450细胞的生长抑制率，化合物xerophilusin B具有一定的食管鳞癌细胞生长抑制特异性。

[0199] 2)、Xerophilusin B对裸鼠肝肾功的影响

[0200] 通过体外细胞实验检测到化合物xerophilusin B在杀伤食管鳞癌细胞的同时对于正常细胞系具有较低的毒性，为进一步探讨其毒性作用引入体内裸鼠皮下移植瘤实验来综合评判化合物xerophilusin B的安全性。在体内裸鼠皮下移植瘤实验及腹腔内注射化合物实验结束时，采用眼球后静脉丛取血法采集裸鼠外周血后，进行肝功与肾功血清生化检测。检测结果如表所示，检测项目共16项，检测数据结果如表3所示。

[0201] 表3  为Xerophilusin B对KYSE-150与KYSE-450移植瘤裸鼠血清肝肾功生化指标的影响

[0202]

[0203] 单位:ALT(U/L),AST(U/L),TP(g/L),ALB(g/L),GLOB(g/L),TBIL(μmol/L),ALP(U/L),GGT(U/L),GLU(mmol/L),UN(mmol/L),CREA(μmol/L),UA(μmol/L),CHO(mmol/L),TG(mmol/L),LDH(U/L).(*p<0.05,**p<0.01,and***p<0.001).

[0204] 其中ALT、AST、CREA以及UN是反映肝肾功能最具代表性的生化指标。如图21A所示，对于KYSE-150细胞移植瘤裸鼠，在腹腔注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物19天后，检测到血清中ALT水平为36.6U/L，与注射Pluronic F68的对照组的ALT水平(38.2U/L)相比，差异无统计学意义(p>0.05)，在腹腔注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物后，血清中ALT水平为56.8U/L，与对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)，而在腹腔注射浓度为2mg/kg/每2天顺铂注射液的裸鼠血清中，检测到ALT水平高达95.4U/L，远高于其他各组，与对照相比差异有显著统计学意义(p<0.001)。同样，还检测到了注射浓度为7.5mg/kg与浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物后血清中AST水平分别为145U/L与160.2U/L，与对照组相比，差异都无统计学意义(p值均>0.05)，而在注射顺铂的裸鼠血清中，检测到AST水平高达361U/L，远高于其他各组，与对照相比差异有显著统计学意义(p<0.001)。说明化合物xerophilusin B对KYSE-150裸鼠肝脏功能指标无影响，而顺铂对肝功产生了明显的毒性反应。相似地，对KYSE-450细胞移植瘤裸鼠在腹腔注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物20天后，血清中ALT水平为43.4U/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中ALT水平为53.2U/L，与对照组(50.4U/L)相比，差异均无统计学意义(p>0.05)。同样，在注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物，血清中AST水平为143U/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中ALT水平为
302U/L，与对照组(158U/L)相比，差异均无统计学意义(p>0.05)(图21B)。

[0205] 对KYSE-150细胞移植瘤裸鼠在腹腔注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物19天后，血清中CREA水平为11.11μmol/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中CREA水平为9.44μmol/L，与对照组(11.74μmol/L)相比，差异均无统计学意义(p>0.05)。同样，在注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物，血清中UN水平为8.31mmol/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中UN水平为
7.49mmol/L，与对照组(10.35mmol/L)相比，差异均无统计学意义(p>0.05)(图21C、D)。类似地，对KYSE-450细胞移植瘤裸鼠在腹腔注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物19天后，血清中CREA水平为11.98μmol/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中CREA水平为9.92μmol/L，与对照组(10.74μmol/L)相比，差异均无统计学意义(p>
0.05)。在注射浓度为7.5mg/kg的xerophilusin B化合物，血清中UN水平为13.48mmol/L，注射浓度为15mg/kg的xerophilusin B化合物的裸鼠血清中UN水平为10.98mmol/L，与对照组(12.49mmol/L)相比，差异均无统计学意义(p>0.05)说明化合物xerophilusin B对KYSE-
150与KYSE-450裸鼠肾脏功能指标无毒性(图21C、D)。

[0206] 3)、Xerophilusin B对裸鼠器官组织的影响

[0207] 在裸鼠皮下成瘤与腹腔注射实验结束后，解剖后肉眼观察心、肝、脾、肺及肾等主要脏器，观察其颜色、形状与大小后，进行进一步的组织病理学检查。

[0208] 结果如图22所示：经切片与免疫组化HE染色后，观察到注射7.5mg/kg与15mg/kg浓度的xerophilusin B化合物的裸鼠，其肝脏被膜完整，肝小叶结构正常，肝索清楚，排列整齐，肝细胞完整，形态规则，肝细胞核清晰，大而圆，胞浆丰富淡染，无变性、坏死、无纤维组织增生。与正常对照组无区别。而注射顺铂的裸鼠肝细胞索排列紊乱，肝内纤维间隔增多，增宽，将小叶切割，肝窦模糊不清，肝细胞胞浆空亮，呈弥漫性气球样变及灶状颗粒变性，并可见灶状坏死，汇管区血管扩张充血。

[0209] 另外，观察到各组中裸鼠肾脏被膜完整，肾小球、肾小管结构正常、肾间质无异常。脾脏被膜完整，脾小梁结构正常，红、白髓比例正常，无炎性细胞浸润及色素沉着(图23)。并且，还观察到心与肺切片无病理改变(图24、25)。以上在组织病理学观察到的结果也印证了血生化检测到的顺铂对于肝脏毒性的结果。

[0210] 4)、Xerophilusin B对裸鼠体重的影响

[0211] 对于裸鼠体重的检测能够直观反映化合物对机体的毒性作用，在接种食管鳞癌细胞并腹腔注射给药后，每日检测裸鼠体重变化，经实验数据分析发现，如图26A所示，对于KYSE-150细胞移植瘤裸鼠，腹腔注射给药后各组裸鼠体重均衡，但随着时间推移，注射7.5mg/kg浓度xerophilusin B化合物的裸鼠其体重均稳定上升，实验结束时的平均体重为
18.12g，与注射Pluronic F68的对照组裸鼠的裸鼠体重(19.66g)相比，差异无统计学意义。
注射15mg/kg浓度xerophilusin B化合物的裸鼠平均体重为16.26g，虽然与对照组比较有统计学意义，但其原因应为对照组裸鼠瘤体生长迅速，瘤体过大，因此体重增加明显。而注射顺铂的裸鼠体重逐渐下降，实验结束时称得平均体重为15.01g，远低于对照组平均体重，差异具有显著性(p<0.001)。同样，对于KYSE-450细胞移植瘤裸鼠，腹腔注射给药后各组裸鼠体重均衡，但随着时间推移，注射7.5mg/kg浓度与15mg/kg xerophilusin B浓度化合物的裸鼠其体重均稳定上升，实验结束时的平均体重分别为17.68g与19.13g，与注射Pluronic F68的对照组裸鼠的裸鼠体重(18.77g)相比，差异无统计学意义。而注射顺铂的裸鼠体重逐渐下降，实验结束时称得平均体重为17.64g，远低于对照组平均体重，差异具有显著性(p<0.05)(图26B)。以上在结果也印证了病理学与血生化检测到的顺铂对于裸鼠机体毒性的结果。

[0212] 综合以上的实验数据和结果，证实了Xerophilusin B能有效抑制人食管鳞癌细胞KYSE-140、KYSE-150、KYSE-450或KYSE-510的增殖，尤其是对KYSE-150、KYSE-450增殖抑制效果更佳，并引起细胞周期阻滞和诱导凋亡，为中草药及其成分应用于临床治疗肿瘤奠定了一定的基础。

[0213] 实施例3、抗食管鳞癌药物制备

[0214] 根据上述实施例2，可以看出，Xerophilusin B可以作为治疗抗食管鳞癌药物的活性成分，按照常规药物制剂制备抗食管鳞癌药物，具体如下：

[0215] 药物1：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

[0216] 药物2：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

[0217] 药物3：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

[0218] 药物4：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

[0219] 药物5：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按常规口服液制法制成口服液。

[0220] 药物6：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为5：1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

[0221] 药物7：Xerophilusin B，以及利用混合溶剂、纳米药物晶体技术和环糊精制成制剂，按其与赋形剂重量比为3：1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。