一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途

摘要

本发明公开了一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途，属于微生物药物领域。一种抑制Aβ聚集的化合物，其结构如式(I)所示，该化合物可通过保藏编号为CCTCCNO：M 2014343的链霉菌发酵分离制备得到。结构如式(I)所示化合物具有较强的抑制Aβ聚集的活性，且具有良好的剂量依赖性。其可用于制备Aβ聚集抑制剂，并用于制备阿尔茨海默症以及其他形式痴呆的治疗药物。本发明为治疗阿尔茨海默症提供了新的途径。

权利要求

1.生产一种抑制Aβ聚集的的化合物的链霉菌，其特征在于：保藏编号为CCTCC NO：M 

2014343；所述的化合物的结构式如下：

2.利用权利要求1所述的链霉菌制备权利要求1中所述的化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的链霉菌先在ISP2液体培养基中培养，再转接到FM3培养基中进行发酵；所述的FM3培养基由以下组分组成：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，黄豆粉15g/L，蛋白胨2g/L，碳酸钙4g/L，海盐18g/L，pH值为7.0；

(2)将步骤(1)获得的发酵液用乙酸乙酯萃取、浓缩得粗提物；

(3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用二氯甲烷和甲醇组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；

(4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过LH20柱层析以及半制备液相分离纯化得到权利要求1中所述的化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的硅胶的目数为300～400目。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的链霉菌经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，再以5％的接种量接种到FM3培养基中，28℃、220r/min振荡培养7d；

(2)将步骤(1)获得的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩获得乙酸乙酯提取物；

(3)将步骤(2)获得的乙酸乙酯提取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为

50:1、25:1、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷和甲醇组成的五个洗脱液进行洗脱，依次获得各洗脱液洗出的组分；

(4)将步骤(3)获得含有目的化合物的组分合并后，减压浓缩，再将浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析以及C18半制备液相分离纯化，得到权利要求1中所述的化合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的LH20柱层析所用洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷和甲醇；所述的C18半制备液相分离纯化所用的流动相为体积比15:85的甲醇和水；

步骤(2)和(4)中所述减压浓缩的温度为40～100℃。

6.权利要求1中所述的化合物在制备Aβ聚集抑制剂和/或治疗痴呆症的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的痴呆症为阿尔茨海默症。

说明书

一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途

技术领域

[0001] 本发明属于微生物药物领域，特别涉及一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)也称老年痴呆症，是一种发病率最高且危害最大的中枢神经系统退行性疾病，常见的临床表现为持续性的记忆力衰退，认知功能障碍，失语以及人格改变等。老年痴呆症不仅危害着老年人的身心健康和生活质量，同时给家庭和社会带来了沉重的负担。流行病学资料表明AD在65岁以上的老年人群中具有高达3～10％的发病率，且由于缺乏特异性的临床治疗方法，已成为老年人继心脏病、肿瘤、卒中之后的第四大死因。由于老年痴呆与增龄密切相关，随着老年人口的增加以及人类寿命的延长，AD的发病率也随之增加，AD的发病机制和防治渐渐成为了国内外研究的热点，也得到了越来越多的医学关注。

[0003] AD的发病机制仍未完全阐明，但临床发现AD患者脑中的标志性病理特征表现为在大脑皮层和海马出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和主要由β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)组成的老年斑。众多临床和基础研究也表明Aβ在脑内的广泛沉积和老年斑形成是AD发生与发展的早期必然因素，远远早与NFTs及其他病理损害的发生。Aβ的聚集使其具有神经细胞毒性，表现为破坏细胞膜完整性、扰乱胞内环境稳定及诱导细胞凋亡等。因此Aβ异常聚集被认为是AD最主要的发病机制，而阻止或抑制Aβ的聚集沉积也成为AD的新治疗靶点。

[0004] 目前针对AD的临床治疗药物主要为胆碱酯酶抑制剂，抗氧化药，抗炎药，脑循环改善剂，钙拮抗剂等，但这些药物均存在一定的毒副作用和使用限制。因而筛选具有抑制Aβ聚集的小分子先导化合物正成为研制AD治疗药物的热点。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于提供一种抑制Aβ聚集的化合物。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种生产上述抑制Aβ聚集的化合物的链霉菌及利用该链霉菌制备该化合物的方法。

[0007] 本发明的再一目的在于提供上述抑制Aβ聚集的化合物的用途。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0009] 一种抑制Aβ聚集的化合物，其结构如式(I)所示：

[0010]

[0011] 一种生产式(I)所示结构的化合物的链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)菌株219204。该菌株从采自中国广东省深圳红树林的土壤样品中分离得到，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，并保藏于中国典型培养物保藏中心(编号：CCTCC NO：M 2014343；分类命名：链霉菌219204 Streptomyces sp.219204；保藏日期：2014年07月21日；地址：中国.武汉.武汉大学)。该菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为HQ992725，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0012] 利用该链霉菌菌株219204制备式(I)所示结构的化合物的方法包括如下步骤：

[0013] (1)将链霉菌219204先在ISP2液体培养基中培养，再转接到FM3培养基中进行发酵。所述的FM3培养基由以下组分组成：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，黄豆粉15g/L，蛋白胨2g/L，碳酸钙4g/L，海盐18g/L，pH值为7.0。

[0014] (2)将步骤(1)获得的发酵液用乙酸乙酯萃取、浓缩得粗提物。

[0015] (3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用二氯甲烷和甲醇组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液。

[0016] (4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过LH20柱层析以及半制备液相分离纯化得到式(I)所示结构的化合物。

[0017] 步骤(3)中所述的硅胶的目数优选为300～400目。

[0018] 优选的，利用该链霉菌菌株219204制备式(I)所示结构的化合物的方法包括如下步骤：

[0019] (1)将链霉菌219204经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，再以5％的接种量接种到FM3培养基中，28℃、220r/min振荡培养7d。

[0020] (2)将步骤(1)获得的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩获得乙酸乙酯提取物。

[0021] (3)将步骤(2)获得的乙酸乙酯提取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为50:1、25:1、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷和甲醇组成的五个洗脱液进行洗脱，依次获得各洗脱液洗出的组分。

[0022] (4)将步骤(3)获得含有目的化合物的组分合并后，减压浓缩，再将浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析以及C18半制备液相分离纯化，得到式(I)所示化合物。

[0023] 步骤(4)中所述的LH20柱层析所用洗脱液优选为体积比1:1的二氯甲烷和甲醇；所述的C18半制备液相分离纯化所用的流动相优选为体积比15:85的甲醇和水。

[0024] 步骤(2)和(4)中所述减压浓缩的温度优选为40～100℃。

[0025] 式(I)所示结构的化合物具有抑制Aβ聚集的作用。

[0026] 基于式(I)所示结构的化合物的作用，其可用于制备Aβ聚集抑制剂。

[0027] 基于式(I)所示结构的化合物的作用，其可用于制备阿尔茨海默症以及其他形式痴呆的治疗药物。

[0028] 式(I)所示结构的化合物未见其作为制备抗Aβ聚集制剂用途的报道，但是本发明通过生物活性测试实验表明具有如式(Ⅰ)所示结构的化合物具有较强的抑制Aβ聚集的活性，且具有良好的剂量依赖性。该化合物由于其抗Aβ聚集作用预示可用于阿尔茨海默氏症以及其他形式痴呆的治疗，为治疗阿尔茨海默氏症提供了新的途径。

附图说明

[0029] 图1是荧光分光光度计检测式(Ⅰ)所示结构的化合物抑制Aβ聚集的结果图。

具体实施方式

[0030] 以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0031] 实施例1菌株219204分离，鉴定与保藏

[0032] 从采自中国广东省深圳红树林的土壤样品中分离得到菌株219204，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，并保藏于中国典型培养物保藏中心(编号：CCTCC NO：M 2014343；分类命名：链霉菌219204 Streptomyces sp.219204；保藏日期：2014年07月21日；地址：中国.武汉.武汉大学)。其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为HQ992725，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0033] 实施例2菌株219204大量发酵及其发酵物样品前处理方法

[0034] 将链霉菌219204经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，按照5％接种量接种到10L的FM3培养基中，28℃、220r/min振荡培养7d，获得发酵液。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，40℃减压浓缩至干得粗提取物。所述的ISP2液体培养基由以下组分组成：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L；所述ISP2培养基pH值为7.2。所述的FM3培养基由以下组分组成：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，黄豆粉15g/L，蛋白胨2g/L，碳酸钙4g/L，海盐18g/L；所述FM3培养基的pH值为7.0。

[0035] 实施例3化合物的分离及结构确认

[0036] (1)化合物分离

[0037] 将实施例2中获得的粗提取物溶于适量甲醇后拌入硅胶，采用干法上样在300～400目的硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为50:1、25:1、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷和甲醇组成的五个洗脱液进行洗脱，每个梯度洗脱体积为1.5L，合并体积比为25:1和10:1的洗脱液，再将减压浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析，洗脱液为1:1(体积比)的二氯甲烷和甲醇，收集含有目的化合物的组分，浓缩后再利用C18半制备液相分离纯化，采用的流动相比例为15:85(体积比)的甲醇和水，得到目的化合物(20mg)。

[0038] (2)结构确认

[0039] 通过UV、IR、MS和NMR多种波谱学手段，确定了上述化合物的结构，其理化性质与波谱数据如下：

[0040] 白色粉末；

[0041] 旋光度：

[0042] 分子式：C22H20O10；

[0043] 分子量：444；

[0044] HRESI-MS(m/z)：445.1115[M+H]+(Calcd.For：445.1129)；

[0045] 最大紫外吸收为212、253、285nm；

[0046] 红外光谱数据：

[0047] 3352,2926,1753,1691,1641,1565,1454,1255,1224,1123,1017,952,762,688cm-1；

[0048] 核磁共振数据：

[0049] 1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,J＝7.4 Hz,2H),7.61(t,J＝7.3 Hz,1H),7.51(t,J＝7.6 Hz,2H),6.30(d,J＝2.1 Hz,1H),5.97(s,OH),5.93(s,OH),5.74(s,OH),
5.63(d,J＝2.1 Hz,1H),5.56(s,OH),4.67(d,J＝2.3 Hz,1H),4.65(d,J＝4.1 Hz,1H),
4.48(d,J＝2.4 Hz,1H),4.47(s,1H),3.83(s,3H),2.29(dd,J＝14.4,2.6 Hz,1H),1.67(d,J＝14.5 Hz,1H)；

[0050] 13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ194.93,173.69,170.72,163.36,161.56,139.58,132.55,128.36,127.88,104.73,87.75,79.83,78.16,76.42,75.43,69.24,56.28,54.64,
52.96,35.60。

[0051] 该化合物的结构如式(I)所示：

[0052]

[0053] 实施例4式(I)所示结构的化合物抑制Aβ聚集的活性评价

[0054] 试剂来源：Aβ蛋白(1-42，M＝4514.1)购自上海楚肽生物科技有限公司，硫磺素T(ThT)购自TCI公司。

[0055] 活性评价试验方法参考文献Naiki,H.；Higuchi,K.；Hosokawa,M.；Takeda,T.Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye,thioflavin t1.Analytical biochemistry 1989,177,244-249和李光武,任振华,唐敏,王培源,汪华侨.银杏叶中单体活性成分抑制Aβ1-42聚集和纤维的形成.解剖学杂志,2007,30(1):47-49，优化步骤后进行，具体步骤如下：

[0056] (1)Aβ1-42工作液配制

[0057] 1mg Aβ1-42粉末用1mL六氟异丙醇完全溶解后，按0.1mL分装成10管，真空冷冻抽干后于-80℃保存。取出1管Aβ1-42，加入40μL二甲基亚砜，溶解后再加入400μL PBS，即成50μM Aβ1-42工作液。

[0058] (2)15μM硫磺素T溶液配制

[0059] 称取0.031885g的硫磺素T(ThT)溶于20mL 50mM甘氨酸-NaOH(pH＝8.5)溶液中即得5mM ThT母液。取0.3mL 5mM ThT溶液加入100mL 50mM甘氨酸-NaOH(pH＝8.5)溶液中即可得到15μM硫磺素T溶液。

[0060] (3)实验分组

[0061] 空白对照组：32μL磷酸缓冲液PBS，2μL二甲基亚砜；Aβ1-42聚集模型组：17μL Aβ1-42工作液，15μL磷酸缓冲液PBS，2μL二甲基亚砜；化合物实验组：17μL Aβ1-42工作液，15μL磷酸缓冲液PBS，2μL浓度分别为6.25、25或100μM的上述化合物(溶剂为二甲基亚砜)；96孔荧光板中充分混匀各组，37℃孵育48h。

[0062] (4)荧光测量

[0063] 48小时后，向96孔荧光板的孔中加入15μM硫磺素T溶液166μL，总体积为200μL，2min后检测通过荧光分光光度计检测，Ex＝453nm，Em＝485nm，记录485nm处最大发射波长的荧光值，实验重复3次。

[0064] (5)统计方法：用SPSS统计软件方差分析*P<0.05，**P<0.01。

[0065] (6)实验结果

[0066] 用上述方法，检测的荧光强度结果见附图1。可以看出，与未加上述化合物的模型组对比，6.25～100μM化合物实验组的荧光强度均明显低于模型组Aβ1-42聚集后产生的荧光强度且具有统计学意义(P<0.05)，表明式(I)所示结构的化合物可以显著的抑制Aβ1-42聚集，且呈现良好的剂量依赖关系。

[0067] 上述实施例说明链霉菌菌株219204通过发酵可以生成式(I)所示结构的化合物，该化合物具有较强的抑制Aβ聚集活性，可用于治疗阿尔茨海默症或其他形式的痴呆。