植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白来源于旱稻，名称为OsERF62，由序列表序列1所示的氨基酸序列组成。实验证明，将含有序列表序列2的第102位至第1106位所示DNA分子（即所述蛋白的编码基因）的重组表达载体35S::OsERF62转化水稻日本晴得到的OsERF62基因过表达的T2代转基因株系，在200g/L PEG6000、200mmol/L甘露醇和土壤断水三种干旱胁迫下，植株的存活率或生长势均显著高于野生型水稻日本晴。本发明为提高植物耐旱性提供了一个新的基因和方法，在植物遗传改良和耐旱性研究方面具有重要意义。

权利要求

1.如下1)-3)任一所述在提高目的植物耐旱性中的应用；

1）由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）1）所述蛋白质的编码基因；

所述基因为核苷酸序列是序列表序列2的第10位至第1570位所示的DNA分子；

3）含有2)所述基因的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒；

所述重组载体为在载体pMDC32的KpnI和PacI位点间插入序列表序列2的第10位至第

1570位核苷酸序列所示的DNA片段得到的重组载体；所述目的植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述耐旱性表现为与如下A—C性状中的至少一种正相关：A、经PEG胁迫后的存活率；

B、经甘露醇胁迫后的生长势；

C、经断水胁迫后的存活率。

3.一种提高植物耐旱性的方法，包括将权利要求1中所述基因导入目的植物中的步骤；

所述目的植物为水稻。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述导入是通过权利要求1中所述重组载体实现的。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述耐旱性表现为与如下A—C性状中的至少一种正相关：A、经PEG胁迫后的存活率；

B、经甘露醇胁迫后的生长势；

C、经断水胁迫后的存活率。

说明书

植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 非生物逆境是影响植物正常生长发育，限制着作物产量提高的主要胁迫因子。目前，干旱对世界作物产量的影响，居于各胁迫因素的首位，其对作物生长的危害相当于所有自然灾害之和，在许多地方已经成为农业发展的瓶颈。水稻是世界上的主要粮食作物之一，是我国60％以上人口的主粮。据统计，水稻用水占农业用水的70％左右，我国水稻栽培面积从1997年以来持续缩减，并且每年还有2千多万亩水稻受旱，甚至还有上千万亩水稻无法种植。因此，克服干旱逆境胁迫对植物的伤害，创制抗旱植物新种质、选育抗旱品种、改良农作物的耐旱性，已成为近年来植物抗旱遗传育种研究的热点之一。

[0003] 利用传统育种方法培育抗旱水稻品种周期长、偶然性大，所培育的品种不稳定，进展比较缓慢，而利用基因工程技术可以直接在基因水平上改造植物的遗传背景，定向改造植物的遗传性状。外源基因的转入丰富了基因资源，弥补了常规育种方法的不足，是抗旱品种选育的有效途径之一。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用。

[0005] 本发明所提供的与植物耐旱性相关的蛋白质，来源于旱稻IRAT109，名称为OsERF62，是如下a）或b）的蛋白质：

[0006] a）由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] b）将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由（a）衍生的蛋白质。

[0008] 序列表序列1所示的氨基酸序列由334个氨基酸残基组成。

[0009] 为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0010] 表1 标签的序列

[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0012] 上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2的第102位至第1106位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0013] 所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0014] 所述蛋白质的编码基因为如下1）-4）基因中的任意一种：

[0015] 1）其核苷酸序列是序列表序列2的第10位至第1570位所示的DNA分子；

[0016] 2）其核苷酸序列是序列表序列2的第102位至第1106位所示的DNA分子[0017] 3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0018] 4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0019] 序列表序列1的第10位至第1570位是蛋白OsERF62的全长cDNA序列。其中，自序列表序列1的第102位至第1106位序列为蛋白OsERF62的编码序列。

[0020] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0021] 含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

[0022] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的HPT基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0023] 含有所述基因的重组载体可为重组载体35S::OsERF62，该重组载体35S::OsERF62为在载体pMDC32的KpnI和PacI位点间插入序列表序列2的第10位至第1570位核苷酸序列所示的DNA片段得到的重组载体。

[0024] 本发明所提供的蛋白质及基因可用于调控目的植物的耐旱性。

[0025] 本发明还提供一种提高植物耐旱性的方法，包括将所述基因导入目的植物中的步骤。

[0026] 本发明还提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。

[0027] 在上述方法中，所述导入是通过所述重组载体35S::OsERF62实现的。

[0028] 在上述应用和方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。

[0029] 在上述应用和方法中，所述耐旱性表现为与如下A—C性状中的至少一种正相关：

[0030] A、经PEG（聚乙二醇）胁迫后的存活率；所述PEG胁迫具体可为200g/L的PEG6000溶液胁迫；

[0031] B、经甘露醇胁迫后的生长势；所述甘露醇胁迫的浓度具体可为200mmol/L；

[0032] C、经断水胁迫后的存活率。

[0033] 实验证明，将含有序列表序列2的第102位至第1106位所示DNA分子的重组表达载体35S::OsERF62转化水稻日本晴得到的OsERF62基因过表达的2个独立的T2代转基因株系，两叶一心期时，用200g/L PEG6000的水溶液胁迫处理3天后复水7天的存活率分别为100%—62%，显著高于野生型水稻日本晴的33%—10%；发芽后用含200mmol/L甘露醇的1/2MS培养基培养7-10天后，幼苗的相对株高和鲜重显著大于野生型水稻日本晴；4叶期，进行断水胁迫1周，然后复水10天的存活率为93%—47%，显著高于野生型水稻日本晴的28%—22%。本发明为提高植物耐旱性提供了一个新的基因和方法，在植物遗传改良和耐旱性研究方面具有重要意义。

附图说明

[0034] 图1为实时荧光定量PCR分析旱稻IRAT109和水稻品种日本晴（Nipponbare）内源OsERF62基因的相对表达量结果。其中，图Ⅰ—Ⅳ依次为ABA、脱水、H2O2和PEG（干旱）处理结果。

[0035] 图2为PCR鉴定T0代转基因OsERF62的水稻植株。其中，泳道M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000、1000、750、500、250bp，泳道P为质粒pMDC32阳性对照，泳道W为未转基因日本晴，泳道1—8为转化基因OsERF62的水稻植株。

[0036] 图3为转基因OsERF62的水稻植株的实时荧光定量PCR检测结果。

[0037] 图4为转基因OsERF62的水稻苗期PEG模拟断水胁迫实验结果。

[0038] 图5为转基因OsERF62的水稻苗期培养基模拟渗透胁迫实验结果。

[0039] 图6为转基因OsERF62的水稻苗期盆栽耐旱性鉴定结果。

具体实施方式

[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0042] 旱稻IRAT109：文献：夏志宏.优质粳型旱稻IRAT109及其栽培技术.安徽农业.1994年06期.公众可从中国农业大学获得。

[0043] 水稻品种日本晴：文献：水稻品种“日本晴”.农业科技通讯.1973年02期.公众可从中国农业大学获得。

[0044] 载体pMDC32：文献:Eva M.Farre′and Steve A.Kay.PRR7 protein levels are regulated by light and the circadian clock in Arabidopsis.The Plant Journal,2007,52:548–560.公众可从中国农业大学获得。

[0045] 根癌农杆菌EHA105：文献：高世武等.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报.2012年3月第3卷第1期，公众可从中国农业大学获得。

[0046] 实施例1、植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因的获得

[0047] 取正常条件下培养的旱稻IRAT109幼苗，Trizol法提取总RNA,纯化后用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板，设计引物F1和引物R1进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1580bp的DNA片段进行测序，结果如序列表序列2所示。

[0048] 上述引物的序列如下：

[0049] F1：5′-CGGGGTACCAAAGGCATTCGCAACACACA-3′（下划线碱基为限制性内切酶KpnI的酶切识别序列）；

[0050] R1：5′-CCTTAATTAACCAAAATACATTACGACTGGAC-3′（下划线碱基为限制性内切酶PacI的酶切识别序列）。

[0051] 序列表序列2的第102位至第1106位编码序列表序列1所示的蛋白，将该蛋白命名为OsERF62，将编码该蛋白的基因命名为OsERF62基因。序列表序列1的第10位至第1570位为编码蛋白OsERF62的全长cDNA序列。

[0052] 实施例2、实时荧光定量PCR分析内源OsERF62基因的表达特性

[0053] 一、胁迫处理

[0054] 将水培的苗龄为4周的水稻品种日本晴和旱稻品种IRAT109幼苗，分别进行以下处理：

[0055] 1、ABA处理：将幼苗根部浸泡于100μM的ABA溶液中，光照培养1小时、2小时、4小时、6小时、9小时、12小时、36小时后取叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

[0056] 2、脱水处理：将幼苗置于空气中放置1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时后取叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

[0057] 3、H2O2处理：将幼苗根部浸泡于1mM H2O2溶液中，放置1小时、2小时、4小时、6小时、9小时、12小时、36小时后取叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

[0058] 4、PEG（干旱）处理：将幼苗根部浸泡于200g/L的聚乙二醇（PEG6000）水溶液浸泡1小时、2小时、4小时、6小时、9小时、12小时、36小时后取叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

[0059] 对照的处理：直接取未经任何处理的幼苗叶片-80℃冻存作为对照（0小时）。

[0060] 二、实时荧光定量PCR

[0061] 取步骤一获得的各处理叶片，分别提取总RNA，利用反转录酶M-MLV反转录合成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，采用引物5’-ATGGCTTGCTTGATTACCGAA-3’(与序列表序列2的第1203—1223位序列相同)和5’-AGACCCCGTAAAAGTAGCCCA-3’(与序列表序列2的第1324—1344位序列反向互补)扩增OsERF62基因的特异片段（142bp），采用引物5’-ATTTGGCACCACACATTCTAC-3’和5’-ATAACCTTCGTAGATTGGGACT-3’扩增出水稻Actin基因的特异片段（255bp）以作为内参进行实时定量分析。实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems7500Real Time PCR system(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重-△△CT
复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2 计算相对表达量。

[0062] △△CT=（CT.Target－CT.Actin）Time x－（CT.Target－CT.Actin）Time 0[0063] Time x表示任意时间点，Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

[0064] 结果如图1中的Ⅰ—Ⅳ所示，OsERF62基因能被干旱、脱水、H2O2和ABA诱导表达，说明OsERF62基因与耐旱性相关。

[0065] 实施例3、重组表达载体的构建

[0066] 将实施例1获得1580bp的DNA片段用KpnI和PacI双酶切后，将酶切产物与经KpnI和PacI双酶切的载体pMDC32的骨架片段相连，经测序和酶切证实，获得重组载体35S::OsERF62，该重组载体35S::OsERF62是在载体pMDC32的KpnI和PacI位点间（即双烟草花叶病毒启动子35S下游）插入了序列表序列2的第10位至第1570位核苷酸序列所示的DNA片段。

[0067] 实施例4、重组农杆菌的获得

[0068] 将实施例3获得的重组载体35S::OsERF62冻融法转化根癌农杆菌EHA105，获得含有重组载体35S::OsERF62的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/35S::OsERF62。

[0069] 实施例5、转基因植物的获得和鉴定

[0070] 一、转基因植物的获得

[0071] 用实施例4获得的重组农杆菌EHA105/35S::OsERF62侵染水稻日本晴的胚性愈伤组织，得到8个T0代阳性转基因OsERF62株系，具体方法如下：

[0072] 1、侵染液的制备

[0073] 把重组农杆菌EHA105/35S::OsERF6平铺于含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP培养基中，28℃培养2-3天。挑取单菌斑接种于YEP液体培养基中（50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平），28℃，240rpm培养至OD600为0.8-1.0，按1%的接种量接种于YEP液体培养基中（50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平），28℃，240rpm培养至OD600为0.5-0.6,离心收集菌体重悬于AAM培养基中28℃，240rpm培养至OD600为0.3-0.4作为侵染液。

[0074] 2、侵染和共培养

[0075] 选取良好的水稻日本晴的胚性愈伤组织用步骤1制备的侵染液浸泡30分钟后取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于共培养培养基上培养2-3天。

[0076] 3、筛选培养

[0077] 将经步骤2共培养的愈伤组织用无菌水振荡清洗3-4次，再用500mg/L头孢霉素水溶液振荡洗涤40分钟，直至上清液完全清洁为止；取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4m/s风干4小时；转入延迟筛选培养基暗培养3-7天后再转入筛选培养基中筛选两轮（每轮3-4周）。

[0078] 4、分化培养

[0079] 将经步骤3培养的愈伤组织在预分化培养基中暗培养2-3周后，再移到分化培养基中光照培养2-3周，待幼芽长至约1cM时转入壮苗培养基培养30天，揭去封口膜炼苗培养一周，然后移栽到土中，获得T0代转基因OsERF62的水稻植株。

[0080] 上述培养基配方如表2所示。

[0081] 表2、培养基配方

[0082]

[0083] 注：NB培养基基本成分包括N6大量元素，B5微量元素，B5有机成分，150mg/L肌醇，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，600mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。

[0084] 5、PCR鉴定

[0085] 对步骤4获得的T0代转基因OsERF62的水稻植株进行DNA水平的PCR鉴定，PCR鉴定的引物为5′-AAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACC-3′和5′-TCTACACAGCCATCGGTCCAGACG-3′，目的片段的大小为919bp，靶基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT，扩增产物中含有目的片段的植株为阳性，不含有目的片段的植株为阴性，部分阳性样本的鉴定结果如图2所示。

[0086] T0代表示转基因当代植株，T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。

[0087] 二、转基因植株的实时荧光定量PCR检测

[0088] 分别取野生型水稻日本晴（WT）和经步骤一中5的PCR鉴定呈阳性的T0代转基因OsERF62的水稻株系2个（OE4、OE5）在大田种植的植株叶片，利用TRIZOL试剂提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，采用引物5’-ATGGCTTGCTTGATTACCGAA-3’(与序列表序列2的第1203—1223位序列相同)和5’-AGACCCCGTAAAAGTAGCCCA-3’(与序列表序列2的第1324—1344位序列反向互补)扩增OsERF62基因的特异片段（142bp），采用引物5’-ATTTGGCACCACACATTCTAC-3’和5’-ATAACCTTCGTAGATTGGGACT-3’扩增出水稻Actin基因的特异片段（255bp）以作为内参进行实时定量分析。实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-△△CT计算相对表达量。

[0089] △△CT=（CT.Target－CT.Actin）Time x－（CT.Target－CT.Actin）Time 0[0090] Time x表示任意时间点，Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

[0091] 结果如图3所示。结果表明，T2代转基因OsERF62的水稻株系中OsERF62基因的表达量明显高于WT植株。

[0092] 三、转基因植株的耐旱性鉴定

[0093] 1、水稻苗期PEG模拟断水胁迫实验

[0094] 分别取经野生型水稻日本晴（WT）和经步骤一中5的PCR鉴定呈阳性的T2代转基因OsERF62的水稻株系2个（OE4、OE5）进行了PEG模拟干旱胁迫处理，具体步骤如下：

[0095] 1）将各株系种子分别用20%的NaClO消毒后，将T2代转基因OsERF62的水稻株系OE4和OE5的种子用含有50mg/L潮霉素的无菌水浸泡2天，将WT的种子晚一天浸泡于不含潮霉素的无菌水中浸泡2天；

[0096] 2）用含50mg/L潮霉素的无菌水清洗各株系种子，去掉多余水分后催芽2-3天，挑选长势一致的种子转移至底部镂空了的PCR板上。每个PCR板上分别种植30株OE4或OE5植株，以种植WT为对照，用Hoagland营养液（营养液成分为：1.43mM NH4NO3，0.27mM NaH2PO4·2H2O，0.51mM K2SO4，1.0mM CaCl2，1.46mM MnSO4·7H2O，0.19mM Na2SiO3，9.5μM MnCl2·-2
4H2O，7.5×10 μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，18.8μM H3BO3，0.15μM ZnSO4·7H2O，0.16μM CuSO4·
5H2O，35.6μM FeCl3·6H2O，pH5.5-6.0）在光照培养室生长至两叶一心期时，将PCR板转移至含有200g/L PEG6000的水溶液中胁迫处理3天，转移至水中7天后观察表型，统计存活植株的数目，计算存活率，即存活植株的数目占进行胁迫处理的植株总数的百分比，结果如图4和表3所示。

[0097] 表3、苗期PEG模拟断水胁迫实验植株的存活率结果

[0098]

[0099] 注：**表示与同组内的WT相比在p﹤0.01差异极显著

[0100] 结果表明：经PEG胁迫复水后，转基因OsERF62的水稻株系植株的存活率显著高于WT。这说明超表达基因OsERF62提高了转基因植株对PEG模拟干旱胁迫的抗性。

[0101] 2、苗期培养基模拟渗透胁迫实验

[0102] 分别取野生型水稻日本晴（WT）和经步骤一中5的鉴定呈阳性的T2代转基因OsERF62的水稻株系2个（OE4、OE5）进行苗期培养基模拟渗透胁迫实验，具体步骤如下：

[0103] 1）将株系OE4、OE5种子去壳消毒后在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上于28℃、光周期为每天12小时光照、12小时黑暗条件下发芽，将WT种子去壳消毒后晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上发芽；

[0104] 2）2-3天后从步骤1）中挑选长势一致的发芽种子转移到含有0mmol/L和200mmol/L甘露醇的1/2MS培养基上，28℃、光周期为每天12小时光照、12小时黑暗条件下培养7-10天后观察表型，测量植株的株高及鲜重。计算200mmol/L甘露醇处理的株高占0mmol/L甘露醇处理的株高的百分比，记为相对株高（%），计算200mmol/L甘露醇处理的植株鲜重占0mmol/L甘露醇处理的植株鲜重的百分比，记为相对鲜重（%）。

[0105] 结果如图5和表4所示，在200mmol/L甘露醇下，转基因OsERF62的水稻株系的株高及鲜重都明显高于WT。这说明超表达基因OsERF62导致转基因植株生长势对甘露醇引起的渗透胁迫耐性增强。

[0106] 表4、200mmol/L甘露醇渗透胁迫下植株长势统计结果

[0107]株系 WT OE4 OE5
相对株高（%） 58.72±1.19 63.22±1.78** 75.90±3.07**

[0108]相对鲜重（%） 76.93±3.74 88.15±3.67** 97.96±5.17**

[0109] 注：表中**表示与同组内的WT相比在p﹤0.01差异极显著。

[0110] 3、苗期盆栽耐旱性鉴定

[0111] 分别取野生型水稻日本晴（WT）和经步骤一中5的鉴定呈阳性的T2代转基因OsERF62的水稻株系2个（OE4、OE5）进行苗期盆栽耐旱性鉴定，具体步骤如下：

[0112] 1）将各株系种子分别用20%的NaClO消毒后，将T2代转基因OsERF62的水稻株系OE4和OE5的种子用含有50mg/L潮霉素的无菌水浸泡2天，将WT的种子晚一天浸泡于不含潮霉素的无菌水中浸泡2天；

[0113] 2）用含50mg/L潮霉素的无菌水清洗各株系种子，去掉多余水分后催芽3-4天，挑选长势一致的幼苗栽至花盆中，每盆种植15株转基因OsERF62的水稻株系OE4或OE5，和15株WT。正常条件下生长至4叶期，进行断水胁迫1周，然后复水10天，统计存活植株的数目，计算存活率，即存活植株的数目占进行胁迫处理的植株总数的百分比，结果如图6和表5所示。

[0114] 表5、苗期盆栽耐旱性鉴定的存活率结果

[0115]

[0116] 注：表中**表示与同组内的WT相比在p﹤0.01差异极显著；*表示与同组内的WT相比在p﹤0.01差异显著

[0117] 结果表明：经断水胁迫复水后，转基因OsERF62的水稻株系植株的存活率显著高于WT。这说明超表达基因OsERF62提高了转基因植株的耐旱性。