一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子

摘要

本发明公开了一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明还公开了该基因启动子在盐胁迫下提高报告基因在拟南芥和大豆中的表达的应用。实验证明，在盐诱导下，本发明所述的启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥和大豆原生质体中的表达，此为GmNAC4基因耐盐调控机制研究，为获得通用型的盐诱导型启动子提供了序列材料，也为其用于培育抗盐作物品种提供了基础。

权利要求

1.一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.含有权利要求1所述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因GUS表达载体pGmNAC4::pKGWFS7。

3.含有权利要求1所述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因LUC表达载体pGmNAC4::pGreenII-0800LUC。

说明书

一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子

技术领域

[0001] 本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子。

背景技术

[0002] 大豆(Glycine max.)含有丰富的植物蛋白、脂肪和多种对人体有益的活性物质，是重要的蛋白质、油脂及保健品活性物质的重要来源，同时是食品、饲料等多种加工工业的优质原料，在国民经济中处于重要的地位。大豆，豆科(Fabaceae)，大豆属(Glycine)，属于淡土植物，耐盐性较差，土地高盐碱含量限制了大豆种植业的发展(王遵亲等，1993)。

[0003] 转录因子通过与下游基因启动子上的顺式作用相互作用调节基因的表达模式，参与生物体的各项生理活动，转录因子的研究对掌握生物体整个调控网络有重要意义，植物转录因子研究是功能基因组研究的一个重要方面。1997年Aida等首先报道了NAC结构域，发现在矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC(Aida et al.,1997)。后来在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中又相继发现多种NAC转录因子。目前在拟南芥中共发现了105个NAC成员，而水稻中则发现了75个(Ooka et al.,2003)。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。2010年大豆全基因组测序以来，与胁迫相关的大豆NAC转录因子的研究越来越多，一些大豆NAC转录因子参与到干旱、盐、渗透胁迫响应和应答过程，在大豆的抗逆过程中起作用。Luciano G.Fietto 2009发现GmNAC2、GmNAC3、GmNAC4对渗透压胁迫强烈响应，GmNAC3和GmNAC4对ABA、盐及JA响应。

[0004] 利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。NAC家族中逆境相关基因往往对多种逆境胁迫响应，这大部分归功与基因启动上含有多种逆境胁迫相关的顺式作用元件，通过对逆境相关的NAC家族基因启动子研究可以得到多种与胁迫相关的关键DNA片段和顺式作用元件，对构建有效的逆境诱导型启动子有重要意义。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件(ABA-responsive element,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsive element,JRE)、低温响应元件(low-temp rature reponsive element,LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsive element,DRE)等。(朱丽萍,于壮,等.植物逆境相关启动子及功能.遗传.2010,32(3):229-234)对植物启动子的研究有助与了解基因转录调控表达模式和其调控机制，且对特异性及诱导性启动子的研究，有助得到正常高效的转基因植物。

[0005] 本实验室前期工作中已经证明来源于耐盐品种——圣豆9号的GmNAC4基因为盐响应基因，且对盐胁迫为正调节作用(专利CN102660554A)。通过比较耐盐大豆圣豆9号在盐和非盐条件下的基因表达谱变化，发现了GmNAC4基因在盐处理下上调表达，将该基因的过表达载体转入模式生物拟南芥中，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高抗盐/耐旱性的能力。通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法将该基因的过表达载体转入大豆中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱性显著地提高。然而，GmNAC4基因的上游调控基因和参与的信号通路并不明确，研究GmNAC4基因盐诱导启动子可以帮助更好地阐释GmNAC4基因的功能，同时研究GmNAC4的盐诱导特性可为获得通用型的盐诱导型启动子提供重要参考，将来可用于转基因耐盐作物的培育。经过检索，未见有关于GmNAC4基因盐诱导启动子的相关报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子及其应用。

[0007] 本发明所述的大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

[0008] a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；

[0009] b)与序列表中SEQ ID No:1的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。

[0010] 本发明还提供了一种含上述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因GUS表达载体pGmNAC4::pKGWFS7；以及含上述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因LUC表达载体pGmNAC4::pGreenII-0800LUC。

[0011] 本发明所述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子受盐胁迫诱导高效启动目标基因表达的应用。

[0012] 本发明首先在大豆圣豆9号植株中克隆到了GmNAC4基因启动子；利用Gateway系统，经过BP、LR反应，将GmNAC4基因启动子连接到GUS报告基因表达载体pKGWFS7(见图2)上；将pGmNAC4::pKGWFS7载体转入农杆菌菌株GV3101中，通过转化的农杆菌菌株转入模式植物拟南芥中，以验证GmNAC4基因启动子功能。

[0013] 本发明还通过酶切连接将GmNAC4基因启动子连接到pGreenII-0800LUC载体中，通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，验证GmNAC4基因启动子受盐诱导的功能。

[0014] 实验证实：本发明所述圣豆9号GmNAC4基因启动子能够在盐诱导条件下上调目标基因的表达，可望用于转基因耐盐植物的培育。其中：所述植物优选大豆或拟南芥。

[0015] 本发明有益效果体现在：利用PCR克隆技术，本发明首次克隆得到了大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子，并驱动GUS报告基因在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备表达GUS基因的能力，且在盐诱导条件下能更高地表达。通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，经过比较分析证明，转基因拟南芥和大豆原生质体能在盐诱导下较非盐条件下能更高效的表达报告基因。预示本发明所述的基因可广泛用于培育抗盐的植物品种。

附图说明

[0016] 图1为PCR克隆大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子电泳图，其中：M为Marker，泳道1、2、3为启动子DNA。

[0017] 图2为pKGWFS7.0载体示意图。

[0018] 图3为GmNAC4::GUS转基因拟南芥GUS染色结果，其中,A为转基因拟南芥全株的染色结果，在根、根尖、侧根起始部位、气孔有GUS信号，B为根部，C为根尖，D为侧根起始部位，E为气孔。

[0019] 图4为GmNAC4::GUS转基因拟南芥在盐和非盐条件下GUS染色对比图，(盐处理下在转基因拟南芥中根部的GUS信号增强)其中，MOCK为转基因拟南芥正常培养6h对照，NaCl为150mM NaCl处理6h。

[0020] 图5为pGreenII-0800LUC载体T-DNA插入区示意图。

[0021] 图6为GmNAC4启动子在盐和非盐条件下相对荧光素酶测定结果，其中，MOCK为转化原生质体正常培养6h的相对荧光素酶活性，NaCl为转化原生质体150mM NaCl处理6h的相对荧光素酶活性。

具体实施方式

[0022] 实施例1大豆GmNAC4基因启动子的获得

[0023] 根据NCBI网站上查到的GmNAC4基因转录起始位点ATG上游2000kb序列，设计启动子引物(F：5’-ACC GTC GTG TTC ACA AAT C-3’，R：5’-TTT TTC A AA AAC ACA ATT TCG-3’)。利用CTAB法提取圣豆9号基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释到100ug/ul，用作扩增启动子模板。利用高保真酶HIFI(Takara)，扩增GmNAC4基因启动子。

[0024] 1.1圣豆9号基因组DNA提取

[0025] (1)将CTAB提取液水浴预热到65℃；

[0026] (2)将圣豆9号植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末；

[0027] (3)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml预热的CTAB提取液，轻柔颠倒混匀，65℃水浴30min；

[0028] (3)12,000rpm，离心10min，将0.6ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，待提取液降低到室温，再加入0.36ml酚/氯仿/异戊醇(24:23:1)轻柔混匀5min，室温放置10min使液体分层；

[0029] (4)12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，轻柔上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

[0030] (5)12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，弹起沉淀，12,000rpm，离心5min，重复两次；

[0031] (6)弃上清，开盖干燥DNA约10min，加入50μl灭菌水，在60℃中充分溶解RNA10min；

[0032] (7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A260/A280达到1.7-2.0，A230/A260达到2.0-2.2，并将提取的DNA吸取10μl浓度稀释到100μg/μl用作PCR模板，其他放置-20℃备用。

[0033] 1.2GmNAC4基因启动子克隆

[0034] 高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(20μl体系)：

[0035]

[0036] 扩增条件如下：

[0037]

[0038] 反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图1所示。

[0039] 1.3克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

[0040] 1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

[0041] 2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

[0042] 3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

[0043] 4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

[0044] 5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

[0045] 6)空柱，12000rpm，离心2min；

[0046] 7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

[0047] 8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

[0048] 1.4连接GmNAC4启动子与pMD19-T载体

[0049] 反应体系如下(20μl体系)：

[0050]

[0051] 16℃过夜连接。

[0052] 1.5大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

[0053] (1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

[0054] (2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；

[0055] (3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；

[0056] (4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

[0057] (5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。

[0058] 1.6大肠杆菌PCR验证

[0059] 反应体系如下(20μl体系)：

[0060]

[0061] 扩增条件如下：

[0062]

[0063] 反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

[0064] 1.7DNA测序

[0065] 挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海铂尚生物技术有限公司测序，得到测序结果，启动子DNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0066] 经过序列分析，上述DNA序列(SEQ ID No.1)与大豆Williams82的核苷酸同源99.69％，三次实验证明所述DNA序列(SEQ ID No.1)就是大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子。

[0067] 1.8大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNAC4::pMD19-T质粒(天根试剂盒)[0068] (1)将测序正确的菌接种于10ml含有氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时-过夜；

[0069] (2)室温，12000rpm，离心1min，收集菌体；

[0070] (3)弃上清，加入250μl低温预冷的P1，振荡悬浮菌体；

[0071] (4)加250溶液P2轻柔颠倒混匀，静置5min；

[0072] (5)溶液澄清后加入350μl溶液P3，轻轻混匀后放置5min；

[0073] (6)12000rpm，离心12min，同时在过滤柱中加入600μl BL平衡液，室温放置2min,12000rpm离心1min，将收集管中的液体倒掉；

[0074] (7)转移质粒提取管中上层水相于过滤柱中，室温2min，12000rpm离心1min,将收集管中的液体倒掉；

[0075] (8)在过滤柱中加入600μl漂洗液PW，室温2min，12000rpm离心1min,将收集管中的液体倒掉，重复一次；

[0076] (9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心5min；

[0077] (10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位滴加55μl预热55℃的灭菌水，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

[0078] 2.大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子序列分析

[0079] 利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析系统对圣豆9号GmNAC4基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行分析。GmNAC4基因启动子所含有的胁迫相关顺式作用元件如下表格所示，表明该启动子上含有丰富的胁迫相关顺式作用元件，可能受到多种转录因子的调控，参与植物对多种生物和非生物胁迫响应。

[0080]

[0081] 实施例2，稳定转基因技术分析GmNAC4启动子活性

[0082] 2.1.报告基因GUS表达载体pGmNAC4::GUS构建

[0083] 利用Gateway系统构建启动子：：GUS表达载体的流程如图2所示，根据GmNAC4启动子序列设计分别含有attB接头的引物(引物对为5’-AAA AAG CAG GAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AGA AAG CTG GGT TTT TTC A AA AAC ACA ATT TCG-3’，下划线处分别为attB1接头和attB2接头)。

[0084] 2.1.1PCR扩增含有attB接头的GmNAC4基因启动子片段

[0085] (1)高保真酶HIFI进行Gateway系统的第一轮扩增(20μl体系)：

[0086]

[0087] 扩增条件如下：

[0088]

[0089] (2)高保真酶HIFI进行Gateway系统的第二步扩增。

[0090] attb引物序列：

[0091] attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

[0092] attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

[0093] 反应体系如下(50μl体系)：

[0094]

[0095] 扩增条件如下：

[0096]

[0097] 2.1.2克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)(同1.3)

[0098] 2.1.3克隆基因片段的BP反应

[0099] BP反应(Gateway系统)体系如下：

[0100]

[0101] 25℃反应8小时-过夜。

[0102] 2.1.4大肠杆菌感受态质粒转化(同1.5)

[0103] 2.1.5大肠杆菌PCR验证(同1.6)

[0104] 2.1.6DNA测序(同1.8)

[0105] 验证连接到pDONR221中的GmNAC4启动子克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0106] 2.1.7大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNAC4::pDONR221质粒(同1.7)

[0107] 2.1.8克隆基因片段的LR反应

[0108] LR反应(Gateway系统)体系如下：

[0109]

[0110] 25℃反应8小时-过夜。pKGWFS7载体示意图如图2所示。

[0111] 2.1.9大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5)

[0112] 2.1.10大肠杆菌PCR验证(同1.6)

[0113] 2.1.11大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.8)

[0114] 验证转入pKGWFS7载体的阳性质粒的pGmNAC4::pKGWFS7既pGmNAC4::GUS克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0115] 2.1.12农杆菌感受态的制备(无菌操作)

[0116] (1)取农杆菌GV3101菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

[0117] (2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD600值为0.4-0.6；

[0118] (3)4℃，4200rpm，离心10min，收集菌体；

[0119] (4)弃上清，加入10ml预冷的0.15M的NaCl悬浮菌体；

[0120] (5)重复步骤3；

[0121] (6)弃上清，加入2ml预冷的20mM的CaCl2悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

[0122] 2.1.13农杆菌的质粒转化(无菌操作)

[0123] (1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

[0124] (2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

[0125] (3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

[0126] (4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

[0127] (5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

[0128] 2.1.14转化农杆菌的PCR验证

[0129] 反应体系如下(20μl体系)：

[0130] 扩增条件如下：

[0131]

[0132] 反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

[0133] 2.2在拟南芥中验证圣豆9号GmNAC4基因启动子的功能验证

[0134] 2.2.1花侵染法转化拟南芥

[0135] (1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

[0136] (2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD600约为1.0-1.2；

[0137] (3)室温，4200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD600约为0.8；

[0138] (4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

[0139] (5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

[0140] 2.2.2拟南芥种子的表面消毒

[0141] 将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

[0142] 2.2.3转基因植株的筛选

[0143] 对收获的T0代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子。

[0144] 2.2.4转基因拟南芥分析GmNAC4启动子

[0145] 将不同的pGmNAC4::GUS拟南芥纯系进行GUS染色分析表明，转基因拟南芥T3代不同株系间GUS组织特异性表达部位基本一致，且T3-7表达量最高。因此，以T3-7作为后续实验材料。

[0146] 将转基因拟南芥T3-7种植于1/2MS培养基上，取幼苗期和开花期的拟南芥做GUS染色，观察其组织特异性表达，结果如图3所示，表明GmNAC4启动子驱动的GUS在叶片、气孔、根中特异的表达。

[0147] 将T3代纯系拟南芥种子种植与1/2MS培养基上，春化处理后在长日照(16h光照、22℃/8h黑暗、20℃)条件下生长。将生长7天的转基因拟南芥苗，放置MS液体培养基中培养6h作对照，含150mMNaCl的MS液体培养基中作盐处理6h。结果如图4所示，表明GmNAC4启动子能够受盐胁迫诱导。

[0148] 实施例3.利用拟南芥原生质体瞬时转化技术验证GmNAC4启动子受盐诱导。

[0149] 3.1GmNAC4启动子pGreen II-0800LUC载体的构建

[0150] 3.1.1克隆含有酶切位点的GmNAC4启动子片段

[0151] 利用双酶切-连接法构建GmNAC4启动子的双荧光报告载体pGreen II-0800LUC。利用Primer5对圣豆9号GmNAC4启动子上的限制性酶切位点分析，与pGreen II-0800LUC的多克隆位点(pGreen II-0800LUC载体T-DNA插入区如图5所示)进行比较，筛选出可用酶切位点为Sal I和Pst I。

[0152] 利用GmNAC4含有酶切位点的引物(F：5’-ACG CGT CGA CAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AAC TGC AGT TTT TCA AAA ACA CAA TTT CG-3’)PCR扩增GmNAC4启动子，[0153] 高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(20μl体系)：

[0154]

[0155] 扩增条件如下：

[0156]

[0157] 反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

[0158] 3.1.2胶回收PCR产物(同1.3)

[0159] 3.1.3Sal I和Pst I分别双酶切PCR产物和pGreen II-0800LUC载体过夜。

[0160] 反应体系如下：

[0161]

[0162] 37℃过夜充分酶切。

[0163] 3.1.4第二天胶回收酶切产物及pGreen II-0800LUC载体。(同1.3)

[0164] 3.1.5将回收的酶切产物和载体进行连接反应过夜。(同1.4)

[0165] 3.1.6大肠杆菌感受态质粒转化。(同1.5)

[0166] 3.1.7大肠杆菌PCR验证。(同1.6)

[0167] 3.1.8DNA测序(同1.7)。

[0168] 验证连接到pGreenII-0800LUC中的GmNAC4启动子克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0169] 3.1.9大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNAC4::pGreenII-0800LUC质粒：无内毒素质粒纯化DNA纯化体系(NucleoBond Xtra Midi EF)(MACHEREY-NAGEL)

[0170] (1).菌体培养收集：4500×g,15min,4℃

[0171] (2).菌体裂解：8ml Buffer RES-EF彻底重悬菌体，加入8ml Buffer LYS-EF裂解菌体，轻柔混匀，常温裂解5min；

[0172] (3).平衡柱子和滤头：15ml Buffer EQU-EF

[0173] (4).中和:8ml NEU-EF,轻柔混合10-15次，冰上放置5min

[0174] (5).净化和装柱裂解液：颠倒试管3次，将裂解液倒入柱子中

[0175] (6).1st洗：5ml Buffer FIL-EF

[0176] (7).去除过滤柱：去除Nucleobond Xtra Column Filter

[0177] (8).2ed洗：35ml Buffer ENDO-EF

[0178] (9).溶解：5ml ELU-EF

[0179] (14)沉淀：3.5ml异丙醇,15000g，4℃，30min

[0180] (15)清洗和干燥DNA沉淀：2ml 70％乙醇常温，5min,15000g,常温，5min[0181] (16).溶解DNA：加入适量体积的H2O-EF，使DNA浓度达到1000ug/ml,-20℃保存。

[0182] 3.2.1GmNAC4启动子拟南芥及大豆叶肉细胞原生质体瞬时转化

[0183] (1)准备在土里生长的3～4周拟南芥幼苗(拟南芥未受胁迫，未抽苔，生长良好)，取5-8片展开的真叶；(大豆采用三叶一心时期的真叶)

[0184] (2)用新的单面刀片将叶片的中部切成0.5-1mm的小条，保证切片没有组织的挤压；

[0185] (3)将叶片条迅速且轻柔的转移到备好的酶液中，用平头镊子将叶条两边的切面都浸入酶液；

[0186] (4)将叶条在黑暗中抽真空30min黑暗中酶解3小时，轻摇后酶液呈绿色，说明原生质体解离下来；

[0187] (5)用显微镜检查原生质体，正常拟南芥叶肉细胞原生质体应约为30-50μm；

[0188] (6)用W5溶液将酶/原生质体等体积稀释；

[0189] (7)用水将75μm尼龙网上的乙醇洗净并吸去多余水分，并用W5浸湿，然后过滤上述混合物；

[0190] (8)将上清转入30ml圆底离心管，200g离心2min,尽可能去除上清，并轻柔转动重悬原生质体；

[0191] (9)用血球计数板在100倍显微镜下对原生质体计数，按2×105个/ml的比例用W5重悬原生质体，冰上静止30min；

[0192] (10)用移液器尽量吸去W5,不要碰到沉淀。按照2×105个/ml的比例用MMG重悬原生质体，并放置室温；

[0193] (11)在2ml离心管中加入10ul pGmNAC4::pGreenII-0800LUC质粒；

[0194] (12)加入100ul原生质体(2×104个),轻柔混合；

[0195] (13)加入110ulPEG溶液，轻敲离心管充分混合，室温放置10min；

[0196] (14)在6孔板的每个孔中加入1ml 5％的牛血清溶液，晃动几下，使溶液覆盖好孔的内壁(防止原生质体贴壁)，将牛血清移去，加入1mlW5溶液清洗六孔板，移去W5溶液；

[0197] (16)在转化体系中加入440ul W5稀释，轻柔混合以终止转化反应；

[0198] (17)100g离心2min，去除上清，加入200ulW5溶液悬浮原生质体；

[0199] (18)在六孔板中加入1mlW5溶液，将转化后的原生质体转入刘孔板中，黑暗中过夜培养；

[0200] (19)重悬原生质体，100g离心2min收集，去上清，留100ul左右的液体，直接进行LUC测定，或放入-80℃保存。

[0201] 3.3GmNAC4启动子相对荧光素酶活性测定

[0202] 利用Promega  Luciferase Assay System检测启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性，操作参照说明书。将-80℃的原生质体拿出放在冰上融化，取20ul原生质体溶液 Luciferase Reagent,25℃反应10min后测定萤火虫发
光值，加入20ul  Stop& Reagent测定，25℃反应10min，测定海肾发光值。计算相对荧光素酶活性值，相对活性值＝萤火虫发光值/海肾发光值。GmNAC4启动子的相对活性值和受盐诱导情况如图6所示，结果证明，在盐诱导下，GmNAC4启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥和大豆原生质体中的表达，GmNAC4启动子具有盐诱导功能，能够用于今后GmNAC4基因耐盐调控机制研究，预示着将来广泛地应用于培育耐盐转基因植物。