一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法

摘要

本发明公开了一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，本发明根据12种常见呼吸道病毒（甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒）的基因保守区设计引物和探针，提取待测样品中的核酸片段进行扩增，最后使用毛细管电泳方法分离样品。本发明具有所需样本量低、灵敏度及准确性高、特异性好、成本低的优点。既克服了常规单管多重荧光PCR检测引物设计困难和多色荧光相互干扰不易分型的缺点，也克服了芯片检测方法的操作繁琐，检测成本高等缺点，为呼吸道病毒的筛查提供了新的方法。

权利要求

1.一种同时检测12种常见呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：包括表1中的RT引物组，表2中的PCR引物组，反转录缓冲液，PCR缓冲液，25mM氯化镁，反转录酶，DNA聚合酶，荧光标记物，阳性对照和X溶液，所述的X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；

表1

表2

。

说明书

一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学方法进行病毒检测领域，具体涉及一种检测12 种呼吸道病毒的方法。

背景技术

[0002] 呼吸道病毒是一大类能侵犯呼吸道主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，其中以呼吸道病毒最常见，包括流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等。并且，近年来新的致病性呼吸道病毒还在不断地被发现，如偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒等，给人类的健康构成很大的威胁。急性呼吸道感染大多具有潜伏期短、发病急、感染力强、传播快等特点，常可导致较高的发病率和死亡率，尤其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒易发生各种变异，常突然暴发，病情凶险，死亡率也较高。呼吸道病毒引起的感染症状比较相似，难以靠临床症状及常规检测方法进行明确诊断，因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性的方法进行筛查。

[0003] 目前，我国常用的呼吸道病毒的检测方法主要包括以下几种：1、电子显微镜镜检 直接对标本中病毒进行形态学鉴定，缺点：①诊断效率低，且有些病毒难以直接从形态学上进行区分；②需要昂贵设备和有经验操作者。2、病毒分离培养 是病毒诊断“金标准”，缺点：①费时费力，且需要有经验操作者；②生物安全风险较高。3、免疫学检查 应用最广泛的是酶联免疫技术（ELISA），一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性的结合，再将酶显色，之后观察结果；优点：①样品通量较高，利用96孔酶标板，可以同时完成多个样本的检测；②较敏感：利用酶联的特性，可以将原来的抗原信号放大；③比传统的培养法缩短时间。缺点：①易出现假阳性；②灵敏度不确定；③病毒抗原发生变异时出现假阴性结果。4 分子生物学—PCR检测方法：目前经常使用的有PCR、实时荧光定量PCR等，都是针对病毒的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。其优点是：灵敏度高并可以精确定量。但是也存在以下缺点：①通量低，一般一次只能检测一种病毒，多重荧光检测时存在荧光干扰影响检测结果；②检测成本相对较高。

[0004] GenomeLab GeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性。采用多重PCR方法，通过燃料标记，在同一个PCR管中同时分析多个基因的表达，克服了上述呼吸道病毒检测方法存在的缺陷，具有以下优点：

[0005] 1、高通量：采用双96孔板，实现单个反应检测12个位点，可同时做192个反应，一天出结果；对于交叉感染者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。

[0006] 2、准确性强：本方法采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可以将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；

[0007] 3、敏感性高，结果重复性好：本方法克服传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性。

[0008] 4、方法简便，使用经济：使用引物混合液，每个样品检测12个位点仅需一次加样；单个样品的检测成本低，利于大规模推广；

[0009] 5、易于实现自动化。

发明内容

[0010] 本发明目的是提供一种高通量、高灵敏度和高特异性的针对12 种呼吸道病毒的快速分子生物学检测方法。

[0011] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：本发明所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组，其特征在于，包括针对 12 种呼吸道病毒和 1 种内对照基因的反转录引物， 其序列见表1：

[0012] 表1

[0013]

[0014] 其中博卡病毒和腺病毒无RT引物，1 种内对照基因为人RNA内参，其基因的反转录引物为：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

[0015] 在一种同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组中，包括针对 12 种呼吸道病毒和 3种内对照基因的PCR引物，其序列见表2：

[0016] 表2

[0017]

[0018] 其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3 种内对照基因的PCR引物：①人RNA内参的PCR引物序列为： GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA内参的引物序列为：5’ CGCTAGGAATCAGACCAACAC 和5’ ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反应内参的引物序列为：5’ GCCAGATATACGCGTTGACA 和5’ AGGGCGTACTTGGCATATGAT。

[0019] 本发明所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0020] （1）选取适当的目的基因相关序列，设计特异性检测12种常见呼吸道病毒的特异性引物具体的核苷酸序列如下表3：

[0021] 表3

[0022]

[0023] （2）取被检样品提取总核酸；

[0024] （3）以提取的总核酸为模板进行反转录；

[0025] （4）建立RT和PCR 反应体系，将上述引物以及各反应组份置于PCR 仪中，加入被检样品提取的DNA模板或反转录产物，进行扩增；

[0026] （5）以毛细管电泳的方法进行样品分离、鉴定。

[0027] 所述的反转录引物包括10种呼吸道病毒的RT扩增引物和人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括2种呼吸道病毒的正反向PCR引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述10种呼吸道病毒的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物。

[0028] 所述步骤（2）中的被检样品包括患者的包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和痰液。

[0029] 所述步骤（3），RT反应体系及反应条件为：5-20ng/μL的核酸样品5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物2μL，RT酶1μL；混匀后进行反转录；反应条件是：48℃ 1分钟、42℃ 60分钟、95℃ 5分钟、4℃直至收取RT产物，反转录引物溶液中各RT引物的浓度为500nM。

[0030] 所述步骤（4），PCR反应体系及反应条件：RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL；混匀后加入到PCR管中进行PCR反应，反应条件是：95℃10分钟、94℃ 30秒、55℃ 30秒、70℃ 1分钟，35个循环、70℃ 1分钟、4℃直至收取PCR产物；PCR引物溶液中各种PCR引物浓度均为200nM；所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

[0031] 所述步骤（5）包括制备遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。

[0032] 所述反应体系设立有阳性对照和阴性对照；所述阳性对照是采用上述12种呼吸道病毒、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因基因重组克隆质粒；所述阴性对照是未使用的病毒采样液。

[0033] 本发明所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：包括如上述的同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组，具体见表1和如上述的同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组，具体见表2。

[0034] 具体地说，实现上述目的本发明采用如下技术方案：本发明用于同时检测12种常见呼吸道病毒的方法包括以下步骤（1）利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的12种常见呼吸道病毒选取适当的与目的基因相关的特异性序列，设计出针对特异性检测12种常见呼吸道病毒的相应基因片段的反转录引物、 PCR引物；（2）取被检样品提取总核酸；（3）以提取的总核酸模板进行反转录，其中博卡病毒和腺病毒不必设计RT引物；（4）设计针对特异性检测12种常见呼吸道病毒的相应基因片段的PCR引物，其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，其它10种只有一种PCR引物，然后建立PCR 反应体系，将上述引物以及各反应组份置于PCR 仪中，加入反转录产物，进行扩增；（5）以毛细管电泳的方法进行样品分离、鉴定。

[0035] 基于12 种病毒的特征性基因序列，设计针对各种病毒的特异性检测引物，反转录引物包括以下表中12种呼吸道病毒的RT引物及人RNA内参的RT扩增引物，PCR引物包括以下表中余下的2种呼吸道病毒的PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述12种呼吸道病毒的PCR扩增引物和人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如上述的表3所示；

[0036] 其中，所述反转录反应体系的反应组份及反应条件为：5-20ng/μL的核酸样品5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物2μL，RT酶1μL；混匀后进行反转录；反应条件是：48℃ 1分钟、42℃ 60分钟、95℃ 5分钟、4℃直至收取RT产物，反转录引物溶液中各RT引物的浓度为500nM。

[0037] 所述聚合酶链式反应体系的反应组份及反应条件为：RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL；混匀后加入到PCR管中进行PCR反应，反应条件是：95℃10分钟、94℃ 30秒、55℃ 30秒、70℃ 1分钟，35个循环、70℃ 1分钟、4℃直至收取PCR产物。PCR引物溶液中各种PCR引物浓度均为200nM；所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光（Cy5）标记。

[0038] 所述产物的分离和检测如下：取PCR产物1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油1滴混合均匀后加入到样品板中进行毛细管电泳分离，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱比对，从而判断呼吸道病毒的种类。

[0039] 与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明可以快速地实现对未知样品中是否携带上述12 种呼吸道病毒同时进行检测和鉴定，而且一天之内可以完成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间。还可根据需要进行靶位点调整。

[0040] 综上所述，本发明是基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测12种呼吸道病毒的检测方法，可以同时针对12种呼吸道病毒进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、快速 、高通量的技术优势，可应用于出入境口岸、疾控中心、医院及其他医疗机构呼吸道病毒的快速筛查和鉴定。

附图说明

[0041] 图1 是无模板的阴性对照电泳图谱（峰为InControl）。

[0042] 图2是 阴性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/huDNA/InControl）。

[0043] 图3 是甲型流感阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/InfA/huDNA/InControl）。

[0044] 图4 是腺病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HADV/huDNA/InControl）。

[0045] 图5 是副流感1型阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HPIV1/huDNA/InControl）。

[0046] 图6 是丙型流感阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/InfC/huDNA/InControl）。

[0047] 图7 是博卡病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/Boca/huDNA/InControl）。

[0048] 图8 是鼻病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HRV/huDNA/InControl）。

[0049] 图9 是副流感3型阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HPIV3/huDNA/InControl）。

[0050] 图10是副流感2型阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HPIV2/huDNA/InControl）。

[0051] 图11 是偏肺病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/HMPV/huDNA/InControl）。

[0052] 图12 是乙型流感阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/InfB/huDNA/InControl）。

[0053] 图13 是冠状病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/huDNA /HCOV /InControl）。

[0054] 图14 是呼吸道合胞病毒阳性样品电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/huDNA /HRSV/InControl）。

[0055] 图15 是所有阳性样品和对照电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA/InfA/HADV/HPIV1/InfC/Boca/HRV/HPIV3/HPIV2/HMPV/InfB/huDNA/HCOV/HRSV/InControl）。

[0056] 图16 是甲型流感病毒灵敏性试验电泳图谱，图中：A. 40 copy/μL，B. 80 copy/μL，C. 160 copy/μL， A、B、C为不同的灵敏性的电泳图谱。

[0057] 图17 是特异性试验电泳图谱（峰从左到右依次为：huRNA /huDNA/ InControl）。

具体实施方式

[0058] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

[0059] 具体实施一：

[0060] 样本核酸提取

[0061] 采集患者样本并提取总核酸：采集患者的鼻咽拭子、痰液的分离培养物，从分离培养物中提取总核酸。本发明设计特异性检测12种常见呼吸道病毒的特异性引物具体的核苷酸序列。

[0062] 本发明针对 12 种呼吸道病毒和 1 种内对照基因的反转录引物， 其序列见表1：

[0063] 表1

[0064]

[0065] 其中博卡病毒和腺病毒无RT引物，1 种内对照为人RNA内参，其基因的反转录引物为：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

[0066] 本发明针对 12 种呼吸道病毒和 3种内对照基因的PCR引物， 其序列见表2。

[0067] 表2

[0068]

[0069] 其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3 种内对照基因的PCR引物：①人RNA内参的PCR引物序列为： GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA内参的引物序列为：5’ CGCTAGGAATCAGACCAACAC 和5’ ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反应内参的引物序列为：5’ GCCAGATATACGCGTTGACA 和5’ AGGGCGTACTTGGCATATGAT。

[0070] 具体实施二：以提取的总核酸为模板进行反转录

[0071] RT反应体系及反应条件为：5-20ng/μL的核酸样品5μL，本实施例采用10 ng/μL的核酸样品5μL。

[0072] 反转录扩增（RT）反应

[0073] （1）按以下比例在PCR管中加入试剂盒样品

[0074]RT反应试剂 量/孔
DEPC水 8μL
5×RT缓冲液 4μL
RT引物（各RT引物浓度均为500nM） 2μL
RT酶 1μL
样品（5-20ng/μL） 5μL
Total 20μL

[0075] 注：反转录引物溶液中各RT引物的浓度为500nM；在RT反应中加入阳性对照品，阳性对照品为由各目标病毒克隆所得，包含目的片段质粒，用量为1μL/反应。混匀后按以下温度孵育：

[0076]步骤 温度 时间
1 48℃ 1分钟
2 42℃ 60分钟
3 95℃ 5分钟
4 4℃ 持续：直至收取RT产物

[0077] 具体实施三

[0078] 聚合酶链式反应（PCR）扩增反应，PCR反应体系及反应条件：采用具体实施二的RT产物8.6μL。

[0079] 以反转录产物为模板进行PCR反应。①按以下比例在PCR管中加入试剂盒样品：

[0080]PCR反应试剂 量/孔
10×PCR缓冲液 2μL
25mM 氯化镁溶液 4μL
PCR引物 2μL
DNA聚合酶 1.4μL
X溶液 2μL
RT产物 8.6μL
Total 20μL

[0081] 注：PCR引物溶液中各种PCR引物浓度均为200nM ；X溶液为包括三磷酸脱氧腺苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA；反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA。所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

[0082] ②混匀后按以下温度进行热循环反应：

[0083]步骤 温度 时间
1 95℃ 10分钟
2 94℃ 30秒
3 55℃ 30秒
4 70℃ 1分钟
5 N/A 重复2-4步骤34次（共35次）
6 70℃ 1分钟
7 4℃ 持续：直至收取PCR产物

[0084] 具体实施四

[0085] GeXP遗传分析仪毛细电泳进行病毒分离、鉴定

[0086] ①制备GeXP样品：

[0087]GeXP样品 量/孔
上样缓冲液 38.75μL
DNA大小标准400 0.5μL
PCR产物 1μL
矿物油 1滴

[0088] ②毛细电泳分离样品。将GeXP样品加入样品板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压为2kV，30秒，分离电压为6kV，35分钟。

[0089] 各具体样品电泳图谱见图1-图14。

[0090] 具体实施五

[0091] 结果分析

[0092] 根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标表示信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断呼吸道病毒的种类。标准图谱如图15所示，其结果能准确检测出12种呼吸道病毒，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。

[0093] 具体实施六

[0094] 检测方法的灵敏度和特异性分析

[0095] 灵敏度分析：将阳性对照按照一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。最高灵敏度可检测到40拷贝。参见图16。

[0096] 特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。优化后检测体系中进行单一模板体系内特异性检测评价，未见非特异性信号，体系内特异性良好；优化后检测体系中加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的混合核酸，未见非特异性信号，体系外特异性良好。参见图17。

[0097] 具体实施七

[0098] 采用本发明的方法对有发热症状人群的50份咽拭子临床样本进行检测，检测结果见表4。检测结果的判定应同时符合以下２个条件，否则试验结果无效：

[0099] ①3种内对照峰信号强度均＞2000A.U；

[0100] ②阴性对照峰信号强度均≤2000A.U。

[0101] 当靶峰信号强度＞2000A.U时判断为阳性结果。

[0102] 当靶峰信号强度大于≤2000A.U时判断为阴性结果。

[0103] 表4 咽拭子临床样本（50份）进行检测结果

[0104]

[0105]

[0106]

[0107] 注：“+”代表：峰信号强度＞2000A.U；“—”代表：峰信号强度≤2000A.U。

[0108] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加和替换，也应属于本发明的保护范围。

[0109] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。