一种测定替勃龙片剂中抗氧剂含量的方法

摘要

本发明提供一种测定替勃龙片剂中抗氧剂含量的方法，具体的为一种通过反相高效液相色谱法测定替勃龙片剂中抗氧剂成分6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量的方法。本方法操作简便，专属性较好，可避免片剂中的辅料和替勃龙的组合成分对于抗氧剂含量测定的干扰，且样品稳定，准确性高，适用性较好。

权利要求

1.一种测定替勃龙片剂中的6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量的方法，其特征在于以6-棕榈酰-L-抗坏血酸为对照品，以异抗坏血酸为稳定剂，采用反相高效液相色谱法对所述替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量进行测定，由外标法计算含量；其中高效液相色谱法所用色谱柱为C18反相色谱柱，流动相包括无机相A和有机相B，其中A为磷酸-水体系，B为乙腈-甲醇体系，A与B的体积比VA/VB＝15/85～5/95，磷酸-水的体积比V磷酸/V水＝1/99，乙腈-甲醇的体积比V乙腈/V甲醇＝45/55～55/45。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于流动相中VA/VB＝5/95，V乙腈/V甲醇＝50/50。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于流动相流速为0.8mL/min～1mL/min，紫外检测器检测波长为243nm，色谱柱为C18反相色谱柱，柱温为25～35℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于流动相流速为1mL/min，柱温为30℃，色谱柱为C18 250×1.6mm 5μm或150×4.6mm 5μm。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于色谱柱为Inertsil ODS-3 250×1.6mm

5μm。

6.根据权利要求1～5任意一项权利要求所述的方法，其特征在于测定过程中包括如下溶液的配制：I.提取溶剂的配制

取异抗坏血酸适量置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成质量浓度为1mg/mL的异抗坏血酸甲醇溶液；

II.供试品溶液的配制

取替勃龙片适量置于容量瓶中，加入少量水，振摇，使药片崩解后，加入适量提取溶剂，超声后放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液制备成质量浓度为

0.02mg/mL的供试品溶液；

III.对照品溶液的配制

取6-棕榈酰-L-抗坏血酸对照品适量，置于容量瓶中，加入适量提取溶剂，超声后放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，制备成质量浓度为0.02mg/mL的对照品溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于采用如下方法进行含量计算：替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量＝Ax×CS/AS×D/片数，其中含量的单位为mg/片，公式中：Ax：供试品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

CS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的实际浓度；

AS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

D：稀释体积。

说明书

一种测定替勃龙片剂中抗氧剂含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及替勃龙片剂杂质控制的方法，具体的涉及一种测定替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量的方法。

背景技术

[0002] 替勃龙(tibolone)是一种人工合成的甾体激素类药物，化学名称为17-羟基-7α-甲基-19-去甲基-17α-孕甾-5(10)-烯-20-炔-3-酮。该药物临床上广泛应用于防治心脑血管疾病、骨质疏松，缓解绝经期抑郁症状，调解脂代谢，治疗更年期或绝经期妇女机能紊乱等，是目前较为理想的绝经期妇女激素替代治疗药物。

[0003] 替勃龙易被氧化而产生与氧化有关的杂质，传统的制剂制备工艺中使用维生素E作为抗氧剂，维生素E为油状，制备中需要加热溶解，导致抗氧作用大大降低；制剂研究过程中发现，加入6-棕榈酰-L-抗坏血酸对于药物活性成分具有更好的稳定作用。该抗氧剂成分的化学名称为(S)-2-[(R)-3，4-二羟基-5-氧代-2，5-二氢-2-呋喃基]-2-羟乙基十六酸酯，化学结构式为：

[0004]

[0005] 6-棕榈酰-L-抗坏血酸的加入能有效降低替勃龙片中与氧化有关的杂质含量，当6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量降低时，其抗氧化作用减弱，与氧化有关的杂质会相应增加，影响药品的安全性和有效性；而作为药品的一种辅料，抗氧剂的含量也需要明确和控制，加之6-棕榈酰-L-抗坏血酸本身也易被氧化发生降解从而影响其含量，因此需要通过测定
6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量对替勃龙片剂的质量进行控制。

[0006] 目前已有的替勃龙片剂质量标准中尚无检测抗氧剂6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量的规定。测定6-棕榈酰-L-抗坏血酸原料常用的碘滴定法由于干扰问题不适合用于替勃龙片剂中该成分的含量测定。

[0007] 为提高替勃龙片剂的质量，解决替勃龙片剂中的氧化杂质控制有关的问题，有必要提出一种替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸抗氧剂含量的测定方法，可以在产品的质量研究和稳定性研究中对该抗氧剂含量进行测定。

发明内容

[0008] 本发明的目的之一在于提供一种测定替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量的方法。

[0009] 本发明的目的之二在于提供一种替勃龙片剂的氧化杂质控制方法。

[0010] 本发明的技术方案是：

[0011] 利用高效液相色谱法，以6-棕榈酰-L-抗坏血酸为对照品，以异抗坏血酸为稳定剂，对作为供试品的所述替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量进行测定，由外标法计算得到替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量。

[0012] 本方法所用的流动相包括无机相A和有机相B，其中A为磷酸-水体系，B为乙腈-甲醇体系。

[0013] 本方法所用的流动相中A与B的体积比VA/VB＝15/85～5/95，优选5/95；磷酸-水的体积比V磷酸/V水＝1/99；乙腈-甲醇的体积比V乙腈/V甲醇＝45/55～55/45，优选50/50。流动相流速为0.8mL/min1mL/min，优选1mL/min。色谱柱为C18反相色谱柱，色谱柱可以采用250×1.6mm5μm或150×4.6mm5μm的规格，例如Inertsil ODS-3 250×1.6mm 5μm，Diamonsil C18150×4.6mm 5μm或Agilent C18 150×4.6mm 5μm。柱温设定为25～
35℃，优选柱温为30℃。紫外检测器检测波长为243nm。

[0014] 本方法中还包括如下溶液的配制：

[0015] I.提取溶剂的配制

[0016] 取异抗坏血酸适量置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成异抗坏血酸甲醇溶液，优选配制成质量浓度为1mg/mL的异抗坏血酸甲醇溶液。

[0017] II.供试品溶液的配制

[0018] 取替勃龙片适量置于容量瓶中，加入少量水，振摇，使药片崩解后，加入适量提取溶剂，超声后放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液制备成供试品溶液，优选制备成质量浓度为0.02mg/mL的供试品溶液。

[0019] III.对照品溶液的配制

[0020] 取6-棕榈酰-L-抗坏血酸对照品适量，置于容量瓶中，加入适量提取溶剂，超声后放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，制备成对照品溶液，优选制备成质量浓度为0.02mg/mL的对照品溶液。

[0021] 本方法还包括如下计算含量的步骤：

[0022] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量即得。

[0023] 替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量(mg/片)＝Ax×CS/AS×D/片数[0024] 公式中：Ax：供试品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

[0025] CS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的实际浓度；

[0026] AS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

[0027] D：稀释倍数

[0028] 本发明的流动相采用已知的方法进行配制。本方法所用的替勃龙片剂可通过购买得到。

[0029] 本发明的有益效果如下：

[0030] 1、本方法采用异抗坏血酸作为样品制备过程中的稳定剂，克服了6-棕榈酰-L-抗坏血酸容易降解的缺点，测定过程中样品稳定性高，重现性好。

[0031] 2、本方法避免了辅料和替勃龙的组合成分对于6-棕榈酰-L-抗坏血酸含量测定的干扰现象，具有更好的专属性。

[0032] 3、本方法操作简便，准确性好，耐用性强。

附图说明

[0033] 1-图1为实施例1中对照品溶液的HPLC图谱

[0034] 2-图2为实施例1中供试品溶液的HPLC图谱

[0035] 3-图3为实施例1中提取溶剂异抗坏血酸甲醇溶液的HPLC图谱

[0036] 4-图4为实施例2中供试品溶液(未添加6-棕榈酰-L-抗坏血酸)的HPLC图谱具体实施方式

[0037] 实施例1：

[0038] (1)溶液配制

[0039] I.提取溶剂的配制

[0040] 称取异抗坏血酸0.5g置于500mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成质量浓度为1mg/mL的异抗坏血酸甲醇溶液。

[0041] II.供试品溶液的配制

[0042] 取替勃龙片10片(规格为2.5mg)，置于100mL容量瓶中，加入10mL水，振摇，使药片崩解后，加入适量提取溶剂，超声10min，放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液稀释成质量浓度为0.02mg/mL的供试品溶液。

[0043] III.对照品溶液的配制

[0044] 取6-棕榈酰-L-抗坏血酸对照品10mg，置于50mL容量瓶中，加入适量提取溶剂，超声10min，放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，得到6-棕榈酰-L-抗坏血酸储备液，精密量取该储备液1mL，置于10mL量瓶中，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，制得质量溶度为0.02mg/mL的对照品溶液。

[0045] (2)设定色谱操作条件：

[0046] I.流动相：无机相A/有机相B的体积比VA/VB＝5/95，其中，A为磷酸-水体系，磷酸/水的体积比V磷酸/V水＝1/99；B为乙腈-甲醇体系，乙腈/甲醇的体积比V乙腈/V甲醇＝50/50

[0047] II.流动相流速：1mL/min

[0048] III.紫外检测器检测波长：243nm

[0049] IV.色谱柱：Inertsil ODS-3C18反相色谱柱，250×1.6mm，5μm

[0050] V.柱温：30℃

[0051] (3)含量测定

[0052] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(结果如附图1、附图2)，按外标法以峰面积计算含量即得。

[0053] 替勃龙片剂中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的含量(mg/片)＝Ax×CS/AS×100/10[0054] 公式中：Ax：供试品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

[0055] CS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的实际浓度；

[0056] AS：对照品溶液中6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积；

[0057] 实施例2：

[0058] 对实施例1的检测方法进行考察。

[0059] (一)专属性

[0060] 1、6-棕榈酰-L-抗坏血酸对照品溶液：采用实施例1中制备得到的6-棕榈酰-L-抗坏血酸对照品溶液。

[0061] 2、空白提取溶剂：以实施例1中制备得到的提取溶剂异抗坏血酸甲醇溶液作为空白提取溶剂。

[0062] 3、供试品溶液(未添加6-棕榈酰-L-抗坏血酸)：取自制的未添加6-棕榈酰-L-抗坏血酸的替勃龙片10片(规格为2.5mg)，采用实施例1中制备供试品溶液的方法，得到不含6-棕榈酰-L-抗坏血酸用于专属性考察对照用的溶液。

[0063] 采用实施例1的色谱条件，分别精密吸取上述三种溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图1，3，4所示。

[0064] (二)溶液稳定性

[0065] 1、供试品溶液：取替勃龙片10片(规格为2.5mg)，置于100mL容量瓶中，加入10mL水，振摇，使药片崩解后，加入适量提取溶剂(根据实施例1的方法制得的1mg/mL异抗坏血酸甲醇溶液)，超声10min，放至室温，加入提取溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

[0066] 2、未添加稳定剂的对照溶液：取替勃龙片10片(规格为2.5mg)，置于100mL容量瓶中，加入10mL水，振摇，使药片崩解后，加入适量甲醇溶液，超声10min，放至室温，加入甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为未添加稳定剂的对照溶液。

[0067] 于相同的条件下，分别精密量取上述两种溶液各10μL，注入液相色谱仪，根据色谱图得到6-棕榈酰-L-抗坏血酸的峰面积随时间变化情况，结果如表1所示：

[0068] 表1：溶液的稳定性考察

[0069]

[0070] (三)线性

[0071] 取抗坏血酸棕榈酸酯对照品10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加提取溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.1mg/mL的抗坏血酸棕榈酸酯溶液，按照下表2分别移取适量该溶液置适宜的量瓶中，用提取溶剂(根据实施例1的方法制得的1mg/mL异抗坏血酸甲醇溶液)稀释至刻度，摇匀，即得到不同浓度线性溶液(50％～150％)。以峰面积对2
浓度作图，绘制标准曲线，拟合线性方程式为y＝1245.6x-3.8988，R＝0.9998；具体结果如表2所示：

[0072] 表2：线性考察

[0073]

[0074]

[0075] (四)准确度

[0076] 分别精密称取替勃龙片(未添加6-棕榈酰-L-抗坏血酸，规格为2.5mg)2.5片，5片，2.5片分别置于25ml，50ml，25ml量瓶中，加水振摇，使药片崩解后，再依次精密加入实施例1中制得的6-棕榈酰-L-抗坏血酸储备液2.0ml，5.0ml，3.0ml，分别加入适量提取溶剂(根据实施例1的方法制得的1mg/mL异抗坏血酸甲醇溶液)，超声10min使溶解，放置室温，加提取溶剂定容至刻度，摇匀，分别精密吸取制备得到的溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算相应的含量，测定结果如表3所示：

[0077] 表3：方法准确度考察

[0078]