来源于双色蜡蘑的漆酶基因及其应用

摘要

本发明公开了一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶LbLAC3I序列及其表达应用。所述漆酶LbLAC3I的核苷酸序列如SEQ ID No 1，全长1518bp，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No2，共501个氨基酸。通过将该序列构建到毕赤酵母表达载体并转化入毕赤酵母中表达，可用于漆酶的生产及染料脱色。

权利要求

1.漆酶LbLAC3I，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

2.权利要求1所述核苷酸序列用于毕赤酵母表达的应用，其特征在于，所表达的漆酶可以使染料橙黄G、孔雀绿和结晶紫脱色。

说明书

来源于双色蜡蘑的漆酶基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属微生物技术领域，具体涉及一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶LbLAC3I序列及其应用。

背景技术

[0002] 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属于蓝色多铜氧化酶家族。它的作用底物相当广泛，包括：酚类、芳胺、羧酸及其衍生物、生物色素与甾体激素、金属有机化合物等，并且催化反应条件温和、无毒副产物生成。可用于废水处理、有机合成、造纸、生物检测及食品加工等。但目前工业化生产的漆酶少、价格高，制约着漆酶的产业化应用。

[0003] 将外源的漆酶通过毕赤酵母高效表达，是生产漆酶的理想方法。毕赤酵母表达系统是真核表达系统，可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰，还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌；表达产量高、背景蛋白质少、表达产物易于纯化等优点。

[0004] 双色蜡蘑（Laccaria bicolor）属于真菌界，白蘑科，蜡蘑属。分布在我国的西藏、云南、四川等地。目前尚无大规模人工种植。本发明所述的漆酶基因既来源于这种真菌，对其野生型基因进行优化后，可以在毕赤酵母中表达。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于毕赤酵母表达的漆酶LbLAC3I序列及其应用。基于野生型基因序列，删除组成N端信号肽的18个氨基酸的基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子，避免基因中出现 ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40-60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins等原则优化基因，并消除内部酶切位点。

[0006] 所述经优化的漆酶LbLAC3I的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

[0007] 所述经优化的漆酶LbLAC3I的核苷酸序列编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。

[0008] 本发明按照毕赤酵母偏爱密码子对原始的LbLAC3进行优化，优化后的基因序列与原序列（GenBank: FJ432086.1）同源性为75.5%（参见图1），其编码的蛋白质共501个氨基酸。其基因由南京金斯瑞公司合成。

[0009] 将基因片段与T/A克隆载体相连（Takara），转化DH5α感受态，获得阳性克隆。抽取该阳性克隆质粒，经Bam H1和Sac  1双酶切后，通过T4 DNA连接酶与毕赤酵母表达载体pPIC9K（invitrogen）连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因的重组质粒pPIC9K-LbLAC3I（参见图2）。

[0010] 利用电击法将上述pPIC9K-LbLAC3I质粒转入毕赤酵母GS115菌中，筛选到的阳性菌株经1wt%甲醇摇瓶诱导48 h后，上清中表达量达到0.005mg/mL。最适pH为2.2 2.6，在pH ~2.2 6.0范围内比较稳定。最适反应温度为50℃。在介体（ABTS: 2,2’-联氨-双-(3-乙基苯~
并噻唑-6-磺酸)二胺盐）存在的条件下，能有效脱色染料橙黄G、孔雀绿和结晶紫。

[0011] 有益效果：

[0012] 按本发明合成的LbLAC3I基因可以在毕赤酵母中表达出漆酶，在废水处理、有机合成、造纸、生物检测及食品加工等诸多领域有广泛的应用潜力。

附图说明

[0013] 图1为LbLAC3I和原始LbLAC3基因序列比对。

[0014] 图2为用于毕赤酵母表达的pPIC9K-LbLAC3I载体。

[0015] 图3为该酶的最适温度。

[0016] 图4为该酶的温度稳定性。

[0017] 图5为该酶的最适pH。

[0018] 图6为该酶的pH稳定性。

[0019] 图7为漆酶对染料的脱色效果。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施方式来进一步阐述本发明。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

[0021] 本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版（黄培堂等译，中国，科学出版社，2002）和毕赤酵母表达手册（invitrogen）中方法进行。未注明的化学药品为分析纯级，购自上海国药集团有限公司。

[0022] 实施例 1

[0023] LbLAC3I基因在毕赤酵母中的分泌表达

[0024] 一、毕赤酵母表达载体的构建

[0025] 基于野生型基因序列，删除组成N端信号肽的23个氨基酸的基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子，避免基因中出现 ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40-60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins等原则优化基因，并消除内部酶切位点。序列如SEQ ID NO 1所示，全基因由南京金斯瑞公司合成。

[0026] 将基因片段与与T/A克隆载体相连（Takara）。转化DH5α感受态，获得阳性克隆。抽取阳性克隆质粒，经Bam H1和Sac  1双酶切后，以正确的阅读框插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，测序验证，得到重组质粒pPIC9K-LbLAC3I（参见图 2）。相关的DNA回收试剂盒、载体、连接酶、核酸内切酶均购自Takara公司，DH5α感受态由本实验室保存。

[0027] 二、毕赤酵母的转化

[0028] 挑取划线培养的GS115（mut+his-，invitrogen）单克隆接种到10 mL YPD，30℃，225 rpm培养过夜，取1 mL转接到100 mL新鲜YPD中继续培养，继续培养3-5h至OD600=0.5，5000 rpm离心收集菌体。用等体积重蒸水洗涤两次后，加入1 mL预冷的山梨醇悬浮菌体，即可作为毕赤酵母感受态。

[0029] 大量抽取pPIC9K-LbLAC3I质粒DNA，经bglII 线性化后，用电击法转入感受态细胞。用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数2.5kV，25µF。电击结束后，立即加入1.0 mL 预冷的1.0 mol/L 山梨醇，取200 µL涂布于SD-his培养基平板，30℃培养3-4天至转化子出现。由于受体酵母为His 缺陷型（His-），在不加His 的基本培养基上不生长，只有整合得到的重组酵母才能正常生长。通过这一标记，筛选得到各质粒大量的His+转化子。

[0030] 三、毕赤酵母的筛选与诱导表达

[0031] 采用小规模发酵筛选活性高的转化子，具体操作方法为：接种单个转化子到含有50 μL BMMY（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、13.4 g/L YNB、0.4 mg/L 生物素、1wt%甲醇）的96孔板中，28℃，225 rpm振荡培养24h，加入10 μL反应底物1% 愈创木酚、20 μL 
40mM 硫酸铜及120 μL缓冲液（pH 4.0 ，0.2M 柠檬酸-磷酸氢二钠）。37℃反应2 h，变为棕褐色的为阳性菌株。

[0032] 选取活性相对较高的转化子，接种到50 mL BMGY（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、13.4 g/L YNB、0.4 mg/L 生物素、10 g/L甘油），培养至OD600=2-3时，离心收集菌体，然后加入等体积BMMY诱导48 h，其间每隔24 h补加甲醇至终浓度1wt%。表达的目的蛋白分泌在上清液中，因此诱导完成后，12000 rpm，离心10 min收集上清。分析得到蛋白质的表达量为 0.005 mg/mL。

[0033] 实施例 2

[0034] LbLAC3I漆酶的性质测定：分析过程是在下述的酶反应体系中进行的：10μL 1mM ABTS、20 μL 40mM 硫酸铜和120 μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液。反应以加入50 μL的酶液开始，反应在37℃的酶切仪中进行30 min，以加入50 μL的1 M NaF终止反应。然后在420 nm处测量对ABTS的氧化量，本发明将一定数量的酶在每分钟催化1μmol的ABTS的活力定义为1U，蛋白浓度是使用Bradford试剂盒来分析的。

[0035] 最适反应温度及温度稳定性：在最适pH，不同温度（20-70℃）下进行酶促反应，测得LbLAC3I漆酶的最适反应温度为40℃（参见图3）。酶液在不同温度下处理1h，每10 min取样测活，比较不同温度下酶活力下降的程度，在30℃以下该酶较稳定（参见图4）。

[0036] 最适pH值及pH稳定性的测定：在不同pH缓冲液下进行酶促反应（pH 2.2-7.0），测得LbLAC3I漆酶的最适pH值为5.0（参见图5）。将酶与不同pH缓冲液混合，置于4℃，24h后加入底物与硫酸铜检测酶活，与未处理酶活性比较，在pH 3.6 7.0范围内比较稳定（参见图~6）。

[0037] 实施例 3

[0038] LbLAC3I漆酶的对染料的脱色作用：在反应体系（10μL 1mM ABTS、20 μL 40mM 硫酸铜和110 μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液）中分别加入10μL 1mM孔雀绿。反应以加入50μL的酶液开始，反应在37℃的酶切仪中进行4 h。比较反应前后，孔雀绿在波长620 nm下的吸光度变化，该漆酶显著脱色效果。结晶紫和橙黄G的检测方法与孔雀绿相同，检测波长分别为580 nm和480nm，能显著脱色（参见图7）。

[0039] 附：本发明涉及到的核苷酸序列表如下：

[0040] <110>上海市农业科学院

[0041] <120>来源于双色蜡蘑的漆酶基因及其应用

[0042] <160>1

[0043] <170>PatentIn version 3.3

[0044] <210> SEQ ID No 1

[0045] <211> 1518

[0046] <212> DNA

[0047] <213>Laccaria bicolor

[0048] <400>1

[0049] 1        GGATCCATGA TTGGACCTAT CGCTAACGTC CACATCGTCA ACAACTACAT[0050] 51       CCAACCAGAT GGCTACAACA GAAGTGCTGT CCTTGCTGGC AACTCCTCTA[0051] 101      CTGCTGGCAC CTTCCCTGGT CCACTGATTG TTGGTACTAA GGGTTCCACC[0052] 151      TTCTTCCTGA ATGTTGCTGA CCATCTGACT GACACCACCA TGCTGAGATC[0053] 201      CACTTCCATC CACTGGCATG GCATGTTCCA GCACAACTCC TCTTGGGCAG[0054] 251      ATGGTCCAGT TGGAGTTGCT CAGTGTCCTA TCGCTCCTGG CAACTCCTTT[0055] 301      CTGTACCAGT TCTCTGTTCC TGATCAAGCT GGCACCTTCT GGTATCACTC[0056] 351      TCATCACTCT ACTCAGTACT GTGATGGTCT GAGAGGTGCT ATGGTCGTCT[0057] 401      ACGATCCACT TGATCCATAC AGATACCTGT ACGACTACGA TGACGAGTCC[0058] 451      ACTGTCATCA CTCTGGCTGA CTGGTATCAT ACTCCTGCTC CATCTGCTGG[0059] 501      TCTGGTTCCA ACTGCTGACT CCACTCTGAT CAATGGCAAG GGTAGATACT[0060] 551      CTGGTGGACC ATCCTCTGAT CTGGCTGTCA TCAACGTCAA GAGAAACGCT[0061] 601      AGATACAGAT TCAGACTGGT CTCCATCTCC TGTGATCCTA ACTTCACCTT[0062] 651      CTCTATTGAC GGACATAACA TGACCATCAT CGAAGTTGAT GGCAACAACG[0063] 701      TCCAGAGAAC CACTGTTGAC TCCATTCAAA TCTTTGCTGG TCAGAGATAC[0064] 751      TCCTTCATTC TGACTGCTAA CCAAGCTGTC TCCAACTACT GGATCAGAGC[0065] 801      ACTGCCTAAC GTTGGCACTC AAGGCTTCTC TGGTGGAGTC AACTCTGCCA[0066] 851      TCCTCAGATA CTCTGGTGCC AACTCTTCCG ACCCAACCAC CAACCAGACT[0067] 901      ACCTCTGTTG TTCCTATGCT GGAGACCTCT CTGCATCCTC TGACTAACCC[0068] 951      TGGTGCTCCT GGCAAGCCAG TTGCTGGTGG TGCTGACGTC AACATCAACC[0069] 1001     TGAACATCAC CTTCAACGCT ACTGAACTGC TGTTCACTGT CAATGGTGCC[0070] 1051     TCCTTCCAAC CACCAACTGT TCCTGTCCTG CTTCAGATCC TGTCTGGTGC[0071] 1101     CAAGACTGCA CAGGATCTGT TGCCATCTGG ATCTGTCTAC ACTCTGCCTA[0072] 1151     GAAACAAGGT CGTTGAAGTC ACCATGCCTG GAGGTGCTGC TGGCTCTCCT[0073] 1201     CATCCTATCC ATCTGCATGG ACATGCCTTT GCTGTTGTCA GAAGTGCAGG[0074] 1251     AAACTCCACC TACAACTACG TCAACCCTGT CAGAAGAGAC GTCGTCTCCA[0075] 1301     TCGGAGCCTC CACCGACAAC GTCACCATCA GATTCAACAC CAACAACCCT[0076] 1351     GGTCCTTGGA TCATGCACTG TCACATCGAC TGGCATCTGA ATCTTGGACT[0077] 1401     GGCTATCGTC TTCGCTGAAG ACGTCCCTAC CATCGCTACC TCTACTCATC[0078] 1451     CAACTGCTTG GGACAAGCTG TGTCCTACCT ACGATGCTCT GCCTACTGAG[0079] 1501     TCCTTCACCT AAGAGCTC

[0080] <210> SEQ ID No2

[0081] <211> 501

[0082] <212>PRT

[0083] <213>Laccaria bicolor

[0084] <400>2

[0085] 1        MIGPIANVHI VNNYIQPDGY NRSAVLAGNS STAGTFPGPL IVGTKGSTFF[0086] 51       LNVADHLTDT TMLRSTSIHW HGMFQHNSSW ADGPVGVAQC PIAPGNSFLY[0087] 101      QFSVPDQAGT FWYHSHHSTQ YCDGLRGAMV VYDPLDPYRY LYDYDDESTV[0088] 151      ITLADWYHTP APSAGLVPTA DSTLINGKGR YSGGPSSDLA VINVKRNARY[0089] 201      RFRLVSISCD PNFTFSIDGH NMTIIEVDGN NVQRTTVDSI QIFAGQRYSF[0090] 251      ILTANQAVSN YWIRALPNVG TQGFSGGVNS AILRYSGANS SDPTTNQTTS[0091] 301      VVPMLETSLH PLTNPGAPGK PVAGGADVNI NLNITFNATE LLFTVNGASF[0092] 351      QPPTVPVLLQ ILSGAKTAQD LLPSGSVYTL PRNKVVEVTM PGGAAGSPHP[0093] 401      IHLHGHAFAV VRSAGNSTYN YVNPVRRDVV SIGASTDNVT IRFNTNNPGP[0094] 451      WIMHCHIDWH LNLGLAIVFA EDVPTIATST HPTAWDKLCP TYDALPTESF[0095] 501      T