梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法，涉及梅毒螺旋体。试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、6种不同浓度的梅毒螺旋体特异性抗体校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、6种不同浓度的梅毒螺旋体特异性抗体校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内。制备方法：先后制备梅毒螺旋体特异性重组抗原、重组抗原包被微孔板、天然膜蛋白单克隆抗体、单克隆抗体的碱性磷酸酶标记、发光底物、洗涤液、校准品，最后组装梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒。可用于临床标本中梅毒特异性的定量检测，可作为梅毒治疗效果和预后的客观指标。
1.梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、
500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶内装有碱性磷酸酶标记单克隆抗体，发光底物瓶内装有发光底物，梅毒螺旋体特异性抗体
1000mIU/mL校准品瓶内装有梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品，500mIU/mL校准品瓶内装有500mIU/mL校准品，200mIU/mL校准品瓶内装有200mIU/mL校准品，50mIU/mL校准品瓶内装有50mIU/mL校准品，10mIU/mL校准品瓶内装有10mIU/mL校准品，0mIU/mL校准品瓶内装有0mIU/mL校准品，洗涤液瓶内装有洗涤液；
采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47；
将步骤1)中的梅毒螺旋体重组抗原TPN17和TPN47用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒，制备重组抗原包被微孔板，密封备用；
提取梅毒螺旋体标准株Nichols株的膜蛋白，免疫Babl/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术，筛选梅毒螺旋体特异性蛋白TPN17和TPN47的单克隆抗体；所述梅毒螺旋体标准株Nichols株为Treponema pallidum ssp.pallidum strain Nichol；
碱性磷酸酶经过碘酸钠活化，分别与步骤3)单克隆抗体分子的-NH2偶联，形成碱性磷酸酶标记单克隆抗体；
人工合成金刚烷胺类发光底物及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液；
洗涤液为溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.01％；
将高值梅毒螺旋体特异性抗体用校准品稀释液稀释，用国家标准品重复标定三次，三次标定值，取均值作为标定的梅毒螺旋体特异性抗体浓度；所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠和3％牛血清白蛋白组成，pH值7.4；
梅毒螺旋体特异性抗体标准品浓度系列1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃或-20℃存放备用；
将碱性磷酸酶标记单克隆抗体、发光底物、洗涤液、校准品装入瓶中，再将碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、洗涤液瓶、校准品瓶和重组抗原包被微孔板装入外包装盒中，组成梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒，所述校准品包括1000mIU/mL、500mIU/mL、
200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度。
2.如权利要求1所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤8)中，所述瓶采用聚乙烯瓶。
梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及梅毒螺旋体，尤其是涉及梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率逐年上升，梅毒的防控已列为我国公共卫生服务的主要任务之一。
[0003] 梅毒螺旋体不能体外培养，而直接病原学暗视野显微镜检查阳性率不高，血清学实验包括心磷脂抗体和特异性抗体检测，心磷脂抗体的假阳性率高，灵敏度低。而梅毒特异性抗体检测方法包括荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、免疫印迹法(Western-blot)等，其特异性均较高，但不能进行定量检测，无法判断患者体内抗体的消长规律，不能提供疾病的治疗效果和预后的客观指标。
[0004] 中国专利CN101881772A公开一种基于流式微球载体技术的梅毒螺旋体(TP)抗体检验试剂盒及其制备和检测方法，具体包括用TP重组抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封闭空白结合点，制成特异性TP探针-高聚分子微球；与待测标本共培养捕获TP抗体，洗涤离心除去未结合的TP抗体，再加入荧光标记的抗人IgG或IgM抗体；使用流式细胞仪检测微球的荧光强度，对受测抗体进行定性或定量分析。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供能实现检测梅毒螺旋体特异性的定量，为梅毒特异性抗体检测提供定量检测的梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法。具体是采用双抗体竟争免疫分析模式进行梅毒螺旋体特异性抗体定量。
[0006] 所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体
1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、
10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶内装有碱性磷酸酶标记单克隆抗体，发光底物瓶内装有发光底物，梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶内装有梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品，500mIU/mL校准品瓶内装有500mIU/mL校准品，200mIU/mL校准品瓶内装有200mIU/mL校准品，50mIU/mL校准品瓶内装有50mIU/mL校准品，10mIU/mL校准品瓶内装有10mIU/mL校准品，0mIU/mL校准品瓶内装有0mIU/mL校准品，洗涤液瓶内装有洗涤液瓶。
[0007] 所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：
[0009] 采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47。
[0010] 2)制备重组抗原包被微孔板
[0011] 将步骤1)中的梅毒螺旋重组抗原TPN17和TPN47用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒，制备重组抗原包被微孔板，密封备用。
[0012] 3)制备天然膜蛋白单克隆抗体
[0013] 提取梅毒螺旋体标准株Nichols株的膜蛋白，免疫Babl/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术，筛选梅毒螺旋体特异性蛋白TPN17和TPN47的单克隆抗体。
[0014] 在步骤3)中，所述梅毒螺旋体标准株Nichols株为Treponema pallidum ssp.pallidum strain Nichol。
[0015] 4)单克隆抗体的碱性磷酸酶标记
[0016] 碱性磷酸酶经过碘酸钠活化，分别与步骤3)单克隆抗体分子的-NH2偶联，形成碱性磷酸酶标记单克隆抗体。
[0017] 5)发光底物制备
[0018] 人工合成金刚烷胺类发光底物(AMPPD)及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液。
[0019] 6)洗涤液制备
[0020] 洗涤液为溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.01％。
[0021] 7)校准品
[0022] 将高值梅毒螺旋体特异性抗体用校准品稀释液稀释，用国家标准品(购自中国生物制品检定所)重复标定三次。三次标定值，取均值作为标定的梅毒螺旋体特异性抗体浓度。所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的3％牛血清白蛋白组成，pH值7.4。
[0023] 梅毒螺旋体特异性抗体标准品浓度系列1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃(12个月)或-20℃(4年)存放备用。
[0024] 8)制备梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒
[0025] 将碱性磷酸酶标记单克隆抗体、发光底物、洗涤液、校准品装入瓶中，再将碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、洗涤液瓶、校准品瓶和重组抗原包被微孔板装入外包装盒中，组成梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒，所述校准品包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度。
[0026] 在步骤8)中，所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0027] 本发明提供了一种梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒，可用于临床标本中梅毒特异性的定量检测，可作为梅毒治疗效果和预后的客观指标，操作简单，结果准确，环保无污染，具有长远的好处。
[0028] 本发明采用梅毒螺旋体重组抗原TPN15、TPN17作为梅毒诊断抗原，实现梅毒螺旋体特异性定量检测，可作为梅毒治疗效果和预后的客观指标。本发明的产品不仅可对梅毒患者体内的螺旋体抗体进行定量，并且操作简单，结果准确，环保无污染，具有长远的好处。
附图说明
[0029] 图1为本发明所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的结构组成示意图。
[0030] 图2为标准品检测结果示意图。
具体实施方式
[0031] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0032] 实施例1
[0033] 参见图1，所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒实施例设有外包装盒1、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶2、发光底物瓶3、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶4、500mIU/mL校准品瓶5、200mIU/mL校准品瓶6、50mIU/mL校准品瓶7、10mIU/mL校准品瓶8、
0mIU/mL校准品瓶9、洗涤液瓶10、重组抗原包被微孔板11；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶2、发光底物瓶3、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶4、500mIU/mL校准品瓶5、
200mIU/mL校准品瓶6、50mIU/mL校准品瓶7、10mIU/mL校准品瓶8、0mIU/mL校准品瓶9、洗涤液瓶10、重组抗原包被微孔板11设在外包装盒1内；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶2内装有碱性磷酸酶标记单克隆抗体，发光底物瓶3内装有发光底物，梅毒螺旋体特异性抗体
1000mIU/mL校准品瓶4内装有梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品，500mIU/mL校准品瓶5内装有500mIU/mL校准品，200mIU/mL校准品瓶6内装有200mIU/mL校准品，50mIU/mL校准品瓶7内装有50mIU/mL校准品，10mIU/mL校准品瓶8内装有10mIU/mL校准品，0mIU/mL校准品瓶9内装有0mIU/mL校准品，洗涤液瓶10内装有洗涤液瓶。
[0034] 以下给出所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0035] (1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：
[0036] 采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47。
[0037] (2)制备重组抗原包被微孔板
[0038] 将步骤(1)中的梅毒螺旋重组抗原TPN17和TPN47用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒，制备重组抗原包被微孔板，密封备用。
[0039] (3)制备天然膜蛋白单克隆抗体
[0040] 提取梅毒螺旋体标准株Nichols株的膜蛋白，免疫Babl/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术，筛选梅毒螺旋体特异性蛋白TPN17和TPN47的单克隆抗体。
[0041] 步骤(3)所述梅毒螺旋体标准株Nichols株为Treponema pallidum ssp.pallidum strain Nichol。
[0042] (4)单克隆抗体的碱性磷酸酶标记
[0043] 碱性磷酸酶经过碘酸钠活化，分别与步骤(3)单克隆抗体分子的-NH2偶联，形成碱性磷酸酶标记单克隆抗体3。
[0044] (5)发光底物制备
[0045] 人工合成金刚烷胺类发光底物(AMPPD)及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液。
[0046] (6)洗涤液制备
[0047] 洗涤液为溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.01％。
[0048] (7)校准品
[0049] 将高值梅毒螺旋体特异性抗体用校准品稀释液稀释，用国家标准品(购自中国生物制品检定所)重复标定三次。三次标定值，取均值作为标定的梅毒螺旋体特异性抗体浓度。所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的3％牛血清白蛋白组成，pH值7.4。
[0050] 梅毒螺旋体特异性抗体标准品浓度系列1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃(12个月)或-20℃(4年)存放备用。
[0051] (8)制备梅毒螺旋体抗体高通量检测试剂盒
[0052] 重组抗原包被微孔板、碱性磷酸酶标记单克隆抗体、发光底物、洗涤液、校准品和外包装盒共同组成的梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒。
[0053] 所述校准品包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度。
[0054] 步骤(8)所述碱性磷酸酶标记单克隆抗体、发光底物、洗涤液、校准品均装在相应的聚乙烯瓶中。
[0055] 实施例2
[0056] 以下给出采用梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒检测患者的临床标本中的梅毒螺旋体特异性抗体：
[0057] 1、标本处理：血清：静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。
[0058] 2、加样：各加100μL的标本和标准品1～6于反应板中，同时作空白对照；
[0059] 3、加酶标记单克隆抗体：碱性磷酸酶标记单克隆抗体100μL，37℃孵育30min；
[0060] 4、洗涤：37℃反应30min后，被测定的梅毒特异性抗体与碱性磷酸酶标记单克隆抗体和微孔板上包被的梅毒特异性重组抗原竟争结合，洗涤分离未结合的游离成分；
[0061] 5、加入发光底物工作液，碱性磷酸酶催化底物脱磷酸基,并发出463nm的可见光。于第10min测定各加样品孔的相对发光强度单位(relative light units，RLU)。样品的RLU与待测梅毒特异性抗体浓度负相关。样品中的待测物浓度依据由待测物标准品浓度和对应的RLU建立的数学方程进行定量，图2所示为标准品检测曲线，其中横坐标为标准品浓度值，纵坐标为RLU值，可以通过样品也相应的RLU值，算出待测样本的梅毒特异性抗体浓度。
