一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法

摘要

本发明公开了一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法。其公开了一种生产莽草酸的发酵培养基，该培养基包括碳源，所述的碳源为0.1～5%山梨醇，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的山梨醇的克数。本发明的用于生产莽草酸的发酵培养基中以山梨醇作为碳源，其显著提高了菌株发酵生产莽草酸的产量，其产量较传统的以葡萄糖作为碳源提高至750%。本发明的工艺简单有效，原料价格低廉，可应用于生物合成莽草酸的产业化生产中，且对其它的以大肠杆菌发酵生产代谢产物的过程优化具有积极的指导作用。

权利要求

1.一种生产莽草酸的发酵培养基，其包括碳源，其特征在于，所述的碳源为0.1～2％山梨醇，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的山梨醇的克数。

2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基还包括1～5％氮源和0.1～5％无机盐，所述的氮源选自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NH4NO3和KNO3中的一种或多种，所述的无机盐选自MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、MnCl2、CuSO4和NaCl中的一种或多种，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

3.如权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，所述大豆蛋白胨的添加量为0.1～

2％，所述胰蛋白胨的添加量为0.1～2％，所述酵母粉的添加量为0.1～2％，所述(NH4)2SO4的添加量为0.1～3％，所述NH4NO3的添加量为0.1～3％，所述KNO3的添加量为0.1～3％，所述MgSO4的添加量为0.1～0.6％，所述K2HPO4的添加量为0.1～0.7％，所述KH2PO4的添加量为

0.05～0.7％，所述Na2HPO4的添加量为0.05～0.6％，所述MnCl2的添加量为0.05～0.6％，所述CuSO4的添加量为0.1～0.6％，所述NaCl的添加量为0.05～0.6％，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

4.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述的氮源为大豆蛋白胨和/或NH4NO3，所述的无机盐为MgSO4、K2HPO4、KH2PO4和NaCl的组合。

5.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基还包括酪氨酸、柠檬酸、苯丙氨酸和谷氨酸钠中的一种或多种，所述酪氨酸的添加量为0.05～2％，所述柠檬酸的添加量为0.01～0.2％，所述苯丙氨酸的添加量为0.05～2％，所述谷氨酸钠的添加量为0.05～0.5％，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

6.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基包括0.1～2％山梨醇、0.1～2％大豆蛋白胨、0.1～3％NH4NO3、0.1～0.6％MgSO4、0.05～0.5％酪氨酸、0.05～

0.15％柠檬酸、0.1～0.7％K2HPO4、0.05～0.7％KH2PO4和0.05～0.6％NaCl，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

7.如权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基包括0.1～2％山梨醇、0.5％大豆蛋白胨、0.6％NH4NO3、0.2％MgSO4、0.1％酪氨酸、0.1％柠檬酸、0.3％K2HPO4、

0.1％KH2PO4和0.1％NaCl，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

8.一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法，其包括步骤：以如权利要求1～7任一项所述的发酵培养基培养大肠杆菌，即可。

9.如权利要求8所述的以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coli JW0379-1。

说明书

一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法。

背景技术

[0002] 莽草酸（Shikimic acid），化学名为[3R-(3α,4α,5β)]-3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，分子式为C7H10O5，相对分子量为174.15。

[0003] 随着流感病毒H5N1和H1N1亚型以及2013年在中国首次发现的H7N9亚型的连续爆发，罗氏公司的专利药“达菲”（磷酸奥司他韦，Oseltamivir）成为世界各国争相贮备的首选抗流感病毒药物。作为“达菲”合成的关键手性起始原料，莽草酸也引起人们的广泛关注。目前，合成“达菲”所需的莽草酸大部分来自于木兰科植物八角（Illicium verum），但利用八角提取莽草酸，生产工艺复杂，得率较低，原料易受季节气候等因素限制，难以满足大规模生产所需，而且大量砍伐植物对环境也造成了巨大危害。而利用微生物生产莽草酸具有极广阔的应用前景，近些年的研究中，利用大肠杆菌发酵生产莽草酸也逐渐成为热点。

[0004] 然而，本领域目前利用大肠杆菌生产莽草酸的效率仍然不高，难以满足市场对莽草酸的需求，因此，有必要通过一定的技术对发酵过程进行改进，以提高发酵生产莽草酸的产量。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对目前发酵生产莽草酸的效率不高的现状，而提供一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法。目前本领域还未见有利用山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的报道，本发明属于首创，本发明通过将碳源由普通的葡萄糖改为山梨醇，使菌株的生长性能得到了改善，最终使莽草酸的产量有了出乎意料的大幅提高。

[0006] 本发明提供的技术方案之一是：一种生产莽草酸的发酵培养基，其包括碳源，所述的碳源为0.1～5%山梨醇，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的山梨醇的克数，如1%表示每100毫升发酵培养基中山梨醇的质量为1克。

[0007] 本发明中，所述的发酵培养基还包括本领域常规的生产莽草酸的发酵培养基所包含的组分，即所述的发酵培养基还包括本领域常规的生产莽草酸的发酵培养基所包含的氮源、无机盐等组分。

[0008] 较佳地，所述的发酵培养基还包括1～5%氮源和0.1～5%无机盐，所述的氮源选自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NH4NO3和KNO3中的一种或多种，所述的无机盐选自MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、MnCl2、CuSO4和NaCl中的一种或多种，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0009] 其中，优选地，所述大豆蛋白胨的添加量为0.1～2%，所述胰蛋白胨的添加量为0.1～2%，所述酵母粉的添加量为0.1～2%，所述(NH4)2SO4的添加量为0.1～3%，所述NH4NO3的添加量为0.1～3%，所述KNO3的添加量为0.1～3%，所述MgSO4的添加量为0.1～0.6%，所述K2HPO4的添加量为0.1～0.7%，所述KH2PO4的添加量为0.05～0.7%，所述Na2HPO4的添加量为0.05～0.6%，所述MnCl2的添加量为0.05～0.6%，所述CuSO4的添加量为0.1～0.6%，所述NaCl的添加量为0.05～0.6%，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0010] 所述的氮源更优选大豆蛋白胨和/或NH4NO3，最优选大豆蛋白胨；所述的无机盐更优选MgSO4、K2HPO4、KH2PO4和NaCl的组合。

[0011] 本发明中，所述的发酵培养基还可以包括本领域常规的可添加于发酵培养基中的有机酸。

[0012] 较佳地，所述的发酵培养基还包括酪氨酸、柠檬酸、苯丙氨酸和谷氨酸钠中的一种或多种，优选包括酪氨酸和柠檬酸，所述酪氨酸的添加量为0.05～2%，所述柠檬酸的添加量为0.01～0.2%，所述苯丙氨酸的添加量为0.05～0.2%，所述谷氨酸钠的添加量为0.05～0.5%，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0013] 本发明优选地，所述的发酵培养基包括0.1～5%山梨醇、0.1～2%大豆蛋白胨、0.1～3%NH4NO3、0.1～0.6%MgSO4、0.05～0.5%酪氨酸、0.05～0.15%柠檬酸、0.1～0.7%K2HPO4、0.05～0.7%KH2PO4和0.05～0.6%NaCl，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0014] 进一步优选地，所述的发酵培养基包括0.1～5%山梨醇、0.5%大豆蛋白胨、0.6%NH4NO3、0.2%MgSO4、0.1%酪氨酸、0.1%柠檬酸、0.3%K2HPO4、0.1%KH2PO4和0.1%NaCl，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0015] 最佳地，所述的发酵培养基包括2%山梨醇、0.5%大豆蛋白胨、0.6%NH4NO3、0.2%MgSO4、0.1%酪氨酸、0.1%柠檬酸、0.3%K2HPO4、0.1%KH2PO4和0.1%NaCl，所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0016] 本发明提供的技术方案之二是：一种添加山梨醇提高发酵生产莽草酸产量的方法，其包括步骤：以前述发酵培养基培养大肠杆菌，即可。

[0017] 本发明中，所述的大肠杆菌为本领域常规所述，只要其能够发酵生产莽草酸即可，如E.coli BL21、E.coli JW0379-1等，本发明优选大肠杆菌E.coliJW0379-1。

[0018] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

[0019] 本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。

[0020] 本发明的积极进步效果在于：

[0021] 本发明的用于生产莽草酸的发酵培养基以山梨醇作为碳源，其显著提高了菌株发酵生产莽草酸的产量，其产量较传统的以葡萄糖作为碳源提高至750%。本发明的工艺简单有效，原料价格低廉，可应用于生物合成莽草酸的产业化生产中，且对其它的以大肠杆菌发酵生产代谢产物的过程优化具有积极的指导作用。

附图说明

[0022] 图1为对比例1和实施例1～7发酵产物中莽草酸含量的测定结果，其中0为对比例1，1～7分别为实施例1～7。

具体实施方式

[0023] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0024] 下述实施例中所用的菌株为重组大肠杆菌JW0379-1（Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol2006.2:1-11），其基因型为F-，Δ(araD-araB)567，ΔlacZ4787（::rrnB-3），ΔaroL753::kan，λ-，rph-1，Δ(rhaD-rhaB)568，hsdR514。该重组大肠杆菌JW0379-1菌株由本发明人于2010年1月从E.coli Genetic Stock Center（New Haven,USA）购买获得。

[0025] 下述实施例中：

[0026] 发酵培养基：具体如各实施例和对比例1所述，除发酵培养基不同之外，各实施例和对比例1的其余条件均相同。

[0027] 种子培养基：各实施例和对比例均相同。其组成为：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl1%（Luria-Bertani培养基，参照《分子克隆实验指南》第三版，（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著））。

[0028] 培养条件：各实施例和对比例均相同。将甘油管保藏的菌种接种到装有20mL/250mL种子培养基（含有25mg/L卡那霉素）的三角瓶中，在37℃、220rpm摇床上过夜培养，将种子液按（体积比）3%接种量接种至20mL/250mL发酵培养基（含有25mg/L卡那霉素）中，在37℃、220rpm摇床上培养24小时后取样1mL，5000rpm离心5分钟取上清进行莽草酸含量的测定。

[0029] 莽草酸含量的测定方法：各实施例和对比例均相同。采用专利CN1351711中披露的高碘酸氧化法对莽草酸的含量进行测定。取0.25mL发酵上清液加入0.25mL高碘酸盐试剂（0.5%H5IO6：0.5%NaIO4=1：1），37℃保温0.5h后加入0.5mL Na2SO3和NaOH混合溶液（0.056M Na2SO3：1MNaOH=2：3）终止反应，混匀后在382nm波长下测量吸光度。根据标准品吸光度曲线计算样品中所含莽草酸的产量。

[0030] 实施例1

[0031] 发酵培养基：山梨醇0.1%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0032] 实施例2

[0033] 发酵培养基：山梨醇0.5%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0034] 实施例3

[0035] 发酵培养基：山梨醇1%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0036] 实施例4

[0037] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0038] 实施例5

[0039] 发酵培养基：山梨醇3%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0040] 实施例6

[0041] 发酵培养基：山梨醇4%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0042] 实施例7

[0043] 发酵培养基：山梨醇5%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0044] 实施例8

[0045] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.05%、酪氨酸1.0%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.02%、NaCl0.03%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0046] 实施例9

[0047] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.05%、柠檬酸0.01%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0048] 实施例10

[0049] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸2.0%、柠檬酸0.2%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0050] 实施例11

[0051] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.05%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.05%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0052] 实施例12

[0053] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.6%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0054] 实施例13

[0055] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.1%、NH4NO33%、MgSO40.2%、酪氨酸0.5%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.7%、KH2PO40.7%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0056] 实施例14

[0057] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨2%、NH4NO30.1%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.15%、K2HPO40.3%、KH2PO40.05%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0058] 实施例15

[0059] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.5%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.05%、K2HPO40.1%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0060] 实施例16

[0061] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO41%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO41%、KH2PO41%、NaCl2%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0062] 实施例17

[0063] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0064] 实施例18

[0065] 发酵培养基：山梨醇2%、胰蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0066] 实施例19

[0067] 发酵培养基：山梨醇2%、胰蛋白胨0.1%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0068] 实施例20

[0069] 发酵培养基：山梨醇2%、胰蛋白胨2%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0070] 实施例21

[0071] 发酵培养基：山梨醇2%、酵母粉0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0072] 实施例22

[0073] 发酵培养基：山梨醇2%、酵母粉0.1%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0074] 实施例23

[0075] 发酵培养基：山梨醇2%、酵母粉2%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0076] 实施例24

[0077] 发酵培养基：山梨醇2%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0078] 实施例25

[0079] 发酵培养基：山梨醇2%、(NH4)2SO40.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0080] 实施例26

[0081] 发酵培养基：山梨醇2%、KNO30.1%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0082] 实施例27

[0083] 发酵培养基：山梨醇2%、(NH4)2SO43%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0084] 实施例28

[0085] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0086] 实施例29

[0087] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0088] 实施例30

[0089] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0090] 实施例31

[0091] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、苯丙氨酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0092] 实施例32

[0093] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、谷氨酸钠0.05%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0094] 实施例33

[0095] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、谷氨酸钠0.2%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0096] 实施例34

[0097] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、Na2HPO40.3%、KH2PO40.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0098] 实施例35

[0099] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、CuSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0100] 实施例36

[0101] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、MnCl20.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0102] 实施例37

[0103] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、CuSO40.05%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。实施例28

[0104] 实施例38

[0105] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、K2HPO40.3%、CuSO40.6%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。实施例29

[0106] 实施例39

[0107] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0108] 实施例40

[0109] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0110] 实施例41

[0111] 发酵培养基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%、NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0112] 对比例1（除碳源为葡萄糖外，其余组分均与实施例4相同）

[0113] 发酵培养基：葡萄糖2%、大豆蛋白胨0.5%、NH4NO30.6%、MgSO40.2%、酪氨酸0.1%、柠檬酸0.1%，K2HPO40.3%，KH2PO40.1%，NaCl0.1%。所述的百分比为每100毫升发酵培养基中所含有的各组分的克数。

[0114] 将基于对比例1工艺下的发酵法生产莽草酸的产量定为100%，作为其他实施例的参照。

[0115] 对实施例1～31和对比例1的发酵产物进行莽草酸含量的检测，结果如表1和图1所示。从图1可以看出，发酵培养基以山梨醇作为碳源，相比对比例1（传统的培养方法以葡萄糖作为碳源）所用菌株生产莽草酸的能力有了明显提升。在山梨醇含量为2%时，其产量较葡萄糖作为碳源提高至750%，当山梨醇添加量超过2%时，莽草酸产量不再增加。若考虑到培养基的成本问题，则2%的山梨醇即为本发明培养基的最佳添加量。

[0116] 表1各实施例和对比例发酵产物中莽草酸相对含量的测定结果

[0117]编号 莽草酸相对含量 编号 莽草酸相对含量
实施例1 148% 实施例22 114%
实施例2 232% 实施例23 336%
实施例3 397% 实施例24 134%
实施例4 750% 实施例25 132%
实施例5 747% 实施例26 107%

[0118]实施例6 745% 实施例27 129%
实施例7 746% 实施例28 703%
实施例8 740% 实施例29 708%
实施例9 733% 实施例30 643%
实施例10 645% 实施例31 584%
实施例11 725% 实施例32 528%
实施例12 746% 实施例33 575%
实施例13 258% 实施例34 732%
实施例14 374% 实施例35 728%
实施例15 637% 实施例36 730%
实施例16 677% 实施例37 723%
实施例17 702% 实施例38 724%
实施例18 573% 实施例39 683%
实施例19 232% 实施例40 645%
实施例20 315% 实施例41 704%
实施例21 732% 对比例1 100%