黄氏响声丸制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱

摘要

本发明涉及黄氏响声丸制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱，其中所述测定方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、注入气相色谱仪进行测定，在标准指纹图谱的基础上，用上述测定方法得到的黄氏响声丸质量是否合格的数据，本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄氏响声丸样品的质量控制，能更加全面、客观、科学地评价黄氏响声丸的质量，保证该制剂的有效性。

权利要求

1.一种黄氏响声丸指纹图谱测定方法，其特征在于，步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水100～300ml，按照中国药典2010年版一部附录XD挥发油测定法试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸2～5小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液，(2)对照品溶液的制备：取薄荷脑及藁本内酯对照品适量，加入环己烷制成对照品溶液，(3)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，测定，并记录色图谱，

(4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行比较，相符为合格，不相符为不合格，其中，所述气相色谱的色谱条件如下：

5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；气相毛细管柱的型号为HP-5，规格为30m×0.32m,0.25um，柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；

载气为氮气，

柱流速1ml/min；

进样口温度200～300℃；

检测器FID，温度200～400℃；

分流进样，分流比：10:1。

2.根据权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，

其中，供试品制备方法如下：取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照中国药典2010年版一部附录XD挥发油测定法试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液，其中，对照品溶液的制备方法如下：取薄荷脑及藁本内酯对照品适量，加入环己烷制成对照品溶液；所述藁本内酯对照品浓度为0.80mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml，其中，气相色谱系统条件如下：以5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；检测器FID；分流进样，分流比：10:1，其中，气相色谱所用的气相毛细管柱的型号为HP-5，规格为30m×0.32m,0.25um，气相色谱进样口温度为250℃，检测器温度为250℃。

说明书

黄氏响声丸制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱

技术领域

[0001] 本发明涉及中药指纹图谱分析方法，具体涉及黄氏响声丸制剂指纹图谱测定方法，及其所得到的黄氏响声丸制剂指纹图谱。技术背景

[0002] 我国传统中药及中药制剂成分复杂，一般质量标准的含量测定均只涉及其中的1～3个成分，难以有效的控制其内在质量，从而无法保证用药的安全性、有效性。由于无法阐明基础物质成分，造成中药及中药制剂不符合国际医药市场的要求，无法打开国外市场。因此，只有不断进行科学的质量标准研究，才能逐步符合中药及中药发展的要求，真正的做到“安全、有效、稳定、可控”。

[0003] 黄氏响声丸是根据著名喉科老中医黄莘农主任医师奉献的九代祖传秘方研制而成，其主要用于急、慢性喉炎等证。其质量标准收载于《中国药典》2010版一部第164页，其中鉴别试验包括大黄、川芎、甘草，含量测定检测浙贝母中的贝母素甲和贝母素乙。

[0004] 该制剂处方包括薄荷、浙贝母、连翘、蝉蜕、胖大海、酒大黄、川芎、儿茶、桔梗、诃子肉、甘草和薄荷脑十二种原材料中的有效成分。从文献可知，新建的含量方法主要测定来源酒大黄的7种成分，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、番泻苷A和番泻苷B，且该品种的质量标准研究集中于高效液相色谱方法，而无气相色谱法方法。

[0005] 黄氏响声丸制剂工艺复杂，部分药材需提取挥发性成分，各类研究均为涉及挥发性成分的测定方法。气相指纹图谱不仅可以对该制剂中的挥发性成分进行鉴别优劣，同时，可以初步的定量，满足质量控制的需求。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于：提供一种黄氏响声丸制剂的指纹图谱测定方法及其特征指纹图谱。

[0007] 本发明通过对黄氏响声丸气相指纹图谱的研究，提供了一种快速评价该制剂中挥发性成分质量的方法，弥补了现有质量控制技术的不足的缺点，使黄氏响声丸制剂质量控制技术更为完善，也更为科学。

[0008] 为此，本发明提供一种黄氏响声丸气相色谱标准指纹图谱的建立以及使用该指纹图谱对生产和销售中的黄氏响声丸进行测定的方法。

[0009] 本发明所述的黄氏响声丸气相色谱标准指纹图谱的建立，步骤如下：

[0010] (1)黄氏响声丸供试品溶液的制备；

[0011] (2)对照品溶液的制备；

[0012] (3)将供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，得到色图谱；

[0013] (4)用指纹图谱软件对多批次(5批‐30批)合格的黄氏响声丸所得的气象色谱图进行处理，获得黄氏响声丸制剂标准图谱。

[0014] 其中，所述气相色谱仪的色谱条件如下：

[0015] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；

[0016] 柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；

[0017] 载气为氮气，

[0018] 柱流速1ml/min；

[0019] 进样口温度200～300℃；

[0020] 检测器FID，温度200～400℃；

[0021] 分流进样，分流比：10:1。

[0022] 本发明在得到黄氏响声丸制剂标准图谱后，应用该图谱对生产和销售中的黄氏响声丸进行测定，测定方法如下：

[0023] (1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水100～300ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸2～5小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0024] (2)对照品溶液的制备：取薄荷脑及藁本内酯对照品适量，加入环己烷制成对照品溶液。

[0025] (3)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，测定，并记录色图谱。

[0026] (4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行比较，相符为合格，不相符为不合格，[0027] 其中，所述气相色谱的色谱条件如下：

[0028] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；

[0029] 柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；

[0030] 载气为氮气，

[0031] 柱流速1ml/min；

[0032] 进样口温度200～300℃；

[0033] 检测器FID，温度200～400℃；

[0034] 分流进样，分流比：10:1。

[0035] 优选的，所用的气相毛细管柱的型号为HP-5(30m×0.32m,0.25um)。且进样口温度为250℃，检测器温度为250℃。

[0036] 优选的，步骤(1)供试品制备方法为：取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0037] 优选的，步骤(2)对照品制备浓度分别为：所述藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0038] 本发明的技术方案是经过筛选获得的，筛选过程如下：

[0039] 1.仪器与试剂

[0040] 1.1仪器

[0041] 十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO)、安捷伦7890A气相色谱仪、安捷伦HP-5(30m×0.32m,0.25um)毛细管柱。

[0042] 1.2试剂

[0043] 藁本内酯对照品、薄荷脑对照品、环己烷、乙醇

[0044] 2.气相色谱系统条件：

[0045] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；进样口温度250℃；检测器FID，温度250℃；分流进样，分流比：10:1。

[0046] 3.供试品溶液制备

[0047] 取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0048] 4.对照品溶液制备

[0049] 取薄荷脑及藁本内酯对照品适量，加入环己烷制成对照品溶液。其中藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0050] 5.方法学验证

[0051] 5.1提取时间考察

[0052] 平行称取本品3份，各20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸，分别保持微沸2h、3h、4h、5h，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容即得样品溶液。过滤，取续滤液，即得。

[0053] 通过比较实验结果发现回流4h效果较好。因此，选择回流4h作为提取时间。

[0054] 5.2精密度试验

[0055] 取同一份供试品溶液，连续重复进样6针，考察精密度。结果表明，共有峰相对保留时间RSD均小于0.03％，相对峰面积RSD均不大于2.16％，重复进样6针间的相似度均为1.000，精密度良好。表1、表2为精密度考察结果。

[0056] 表1精密度试验结果(相对保留时间)

[0057]

[0058]

[0059] 表2精密度试验结果(相对峰面积)

[0060]

[0061] 5.3重复性

[0062] 称取同一批供试品6份，按照供试品溶液制备方法，平行操作，考察重复性。结果表明，共有峰相对保留时间RSD均小于0.05％，相对峰面积RSD均不大于3.57％，6份样品间的相似度均为1.000，重复性良好。表3、表4为重复性考察结果。

[0063] 表3重复性试验结果(相对保留时间)

[0064]

[0065]

[0066] 表4重复性试验结果(相对峰面积)

[0067]

[0068] 5.4稳定性考察

[0069] 取同一供试品溶液，分别于0h,2h,4h,6h,8h,10h注入液相色谱仪。结果表明，共有峰相对保留时间RSD均小于0.04％，相对峰面积RSD均小于3.60％，相似度为1.000，供试品溶液在10h内稳定。表5、表6为重复性考察结果。

[0070] 表5稳定性试验结果(相对保留时间)

[0071]

[0072]

[0073] 表6稳定性试验结果(相对峰面积)

[0074]

[0075] 5.5样品测定

[0076] 将10批黄氏响声丸按供试品提取方法提取，并按该指纹图谱测定方法进行测定，记录各色谱图。

[0077] 6.数据分析

[0078] 按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，获得每个批次相似度值。样品相似度在0.75～0.99。

[0079] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0080] 1、本发明采用气相色谱法，建立的黄氏响声丸指纹图谱中共有峰总结15个，能有效的表征黄氏响声丸挥发性成分的质量，补充了HPLC含量测定以外的成分。

[0081] 2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而造成的整体质量片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

[0082] 本发明方法所得黄芪颗粒指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。

[0083] 3、本方法具有精密度、稳定性、重复性好的优点，且简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄氏响声丸质量控制。

[0084] 4、该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

[0085] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

附图说明

[0086] 图1黄氏响声丸标准指纹图谱

[0087] 图2黄氏响声丸对照品图谱

[0088] 图3黄氏响声丸提取比较图谱

[0089] 图4黄氏响声丸10批指纹图谱

具体实施方式

[0090] 以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。

[0091] 实施例1

[0092] 步骤(1)供试品溶液制备方法为：取黄氏响声丸，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0093] 步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：所述藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0094] 步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。

[0095] 气相色谱系统条件：

[0096] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；进样口温度250℃；检测器FID，温度250℃；分流进样，分流比：10:1。

[0097] 按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在0.75～0.99为合格，低于0.75为不合格。

[0098] 实施例2

[0099] 对黄氏响声丸130501批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：

[0100] 步骤(1)供试品溶液制备方法为：取黄氏响声丸130501，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0101] 步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：所述藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0102] 步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。

[0103] 气相色谱系统条件：

[0104] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；进样口温度200℃；检测器FID，温度300℃；分流进样，分流比：10:1。按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。

[0105] 试验结果：130501批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.81，符合不低于0.75的要求。

[0106] 实施例3

[0107] 对黄氏响声丸130911批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：

[0108] 步骤(1)供试品溶液制备方法为：取黄氏响声丸130911，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0109] 步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：所述藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0110] 步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。

[0111] 气相色谱系统条件：

[0112] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；进样口温度250℃；检测器FID，温度400℃；分流进样，分流比：10:1。按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。

[0113] 试验结果：130911批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.85，符合不低于0.75的要求。

[0114] 实施例4

[0115] 对黄氏响声丸131201批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：

[0116] 步骤(1)供试品溶液制备方法为：取黄氏响声丸131201，粉碎，取约20g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入水200ml，按照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录XD)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分并溢出流入烧瓶时为止，加环己烷3ml，连续回流冷凝管，加热至沸并保持微沸4小时，放冷，将测定器中的环己烷层移至10ml容量瓶中，冷凝管、挥发油测定器内壁及水层再用环己烷多次洗涤并移至容量瓶中，环己烷定容得样品溶液，即得供试品溶液。

[0117] 步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：所述藁本内酯对照品浓度为0.8086mg/ml，薄荷脑对照品的浓度为7.38mg/ml。

[0118] 步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。

[0119] 气相色谱系统条件：

[0120] 5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定性的毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为90℃，保持16分钟，继以每分钟4℃的速率升温至150℃，保持15分钟，继以每分钟5℃的速率升温至180℃，保持8分钟，继以每分钟20℃的速率升温至200℃，保持9分钟；载气为氮气，柱流速1ml/min；进样口温度300℃；检测器FID，温度250℃；分流进样，分流比：10:1。按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。

[0121] 试验结果：131201批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.87，符合不低于0.75的要求。

[0122] 与液相色谱法比较的优点：

[0123] (1)液相色谱方法一般用于高沸点难挥发且相对分子质量大的有机物的含量测定。而气相色图谱法可用于具有挥发性的小分子物质的测定。黄氏响声丸中部分药材采用挥发性成分入药，该专利气相指纹图谱就是针对该部分成分进行的质量评估，是对黄氏响声丸质量标准的有效补充。

[0124] (2)液相色谱一般一种方法只可针对一类物质的进行测定，由于中药成分复杂，需建立多个高效液相色谱方法才可评价其质量。但是气相色谱指纹图谱法可通过一种测定方法就能评价其质量。