一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法转让专利
申请号 : CN201410596456.9
文献号 : CN104374839B
文献日 : 2016-03-23
发明人 : 房伟伟 , 翟勇 , 郭桂秋 , 王荔强
申请人 : 荣昌制药(淄博)有限公司
摘要 :
本发明公开了一种治疗月经不调中药组合物特征图谱的检测方法，属于中药制剂质量检测的技术领域。本发明采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，以新橙皮苷为参照，对样品中所含成分进行定性分析。本检测方法简便、快捷、灵敏度好、稳定性高、提高了对药品质量的有效控制，保证了质量。
权利要求 :
1.一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法，其特征在于：
采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱；以乙腈为流动相A，以0.5%醋酸溶液为流动相B；检测波长为270nm；流速为1.0ml/min；柱温25℃的色谱条件下，按下表的洗脱程序进行梯度洗脱，以新橙皮苷为参照，对组合物中橙皮苷、芍药苷、盐酸益母草碱、柚皮苷、丹酚酸B进行特征定性分析，。
2.按照权利要求1所述的一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法，其特征在于：所述检测方法按下述步骤进行：（1）参照物溶液的制备： 取新橙皮苷样品适量，精密称定，加甲醇制成参照物溶液；
（2）供试品溶液的制备：量取本品，加甲醇，取续滤液，即得；
（3）测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.按照权利要求2所述的一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法，其特征在于：所述的步骤（1）参照物溶液的制备：取新橙皮苷样品适量，精密称定，加70%的甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
4.按照权利要求2所述的一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法，其特征在于：所述的步骤（2）供试品溶液的制备：取本品10ml置50ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
说明书 :
一种治疗月经不调中药组合物特征的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种治疗月经不调中药组合物特征图谱的构建方法，属于中药制剂质量检测的技术领域。
背景技术
[0002] 本发明涉及的中药组合物由益母草、当归、赤芍等多味中药组成，是治疗气滞血瘀型月经不调的良好药物。文献中对此类中药组合物配方组成的研究较多，而用特征图谱来检测组合物中多种组分的却未见报道；现有的产品检测方法较为简单，不能对产品质量进行全面控制，有必要对该中药组合物的质量检测方法进行相关探索研究，制定确实可行的质量检测方法以保证产品质量和临床功效。此前，申请人已经申请了申请号为201410222870.3的中国专利，公开了一种治疗功能性子宫出血中药组合物的检测方法，包括内容物的鉴别和成分的含量测定。内容物的鉴别是薄层色谱法鉴别芍药苷、原儿茶醛、齐墩果酸、橙皮苷、茜草，含有成分的含量测定是高效液相色谱测定盐酸水苏碱的含量。
[0003] 由于中药组合物成分复杂，含有许多目前未知的成分；上述靠检测单一成分的方法很容易给造假者以可乘之机；因此，申请人又在此基础上进行大胆设想，积极研究改进，以已知成分为参照，对未知成分进行特征检测，形成组合物特征图谱，达到全面检测组合物所含物质目的。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于：解决现有技术的不足，提供一种精密度高，重复性和稳定性好，能客观、准确、全面的检测一种治疗月经不调中药组合物特征成分的检测方法。能更有效的保证产品质量，对控制中药组合物的质量具有重要作用。
[0005] 本发明中的检测方法由以下步骤组成：其中，采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，以新橙皮苷为参照，以液相色谱中的各色谱峰的相对保留时间为指标，对相关成分进行定性分析。
[0006] 其中，所述成分含量测定方法按下述步骤进行：
[0007] （1）色谱条件：色谱柱为C18柱；以乙腈为流动相A，以0.5%醋酸溶液为流动相B；检测波长为270nm；流速为1.0ml/min；柱温25℃。
[0008] （2）参照物溶液的制备：取新橙皮苷样品适量，精密称定，加70%的甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
[0009] （3）供试品溶液的制备：取本品10ml置50ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0010] （4）测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0011] 其中，所述的步骤（1）色谱条件及系统适用性试验：色谱柱：waters-C18色谱柱（250×4.6mm），依利特-C18色谱柱（250×4.6mm）；流动相：以乙腈为流动相A，以0.5%醋酸溶液为流动相B；按表1中的规定进行梯度洗脱；流速： 1.0ml/min；检测波长：270nm；柱温：25℃；
[0012] 表1流动相梯度洗脱表
[0013]时间（min） 流动相A ( % ) 流动相B（%）
0～10 0→10 100→90
10～11 10→7 90→93
11～20 7→15 93→85
20～25 15→20 85→80
25～40 20→29 80→71
40～55 29→40 71→60
0～10 0→10 100→90
10～11 10→7 90→93
11～20 7→15 93→85
20～25 15→20 85→80
25～40 20→29 80→71
40～55 29→40 71→60
[0014] 供试品特征图谱中应有10个峰，与参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，其相对保留时间应在规定值的±10%之内，相对保留时间都在相对保留时间值的10%以内，相对峰面积都符合峰1为S峰的0.15倍以上，峰2为S峰的0.04倍以上，峰3为S峰的0.15倍以上，峰4为S峰的0.15倍以上，峰5为S峰的1倍以上，峰6为S峰的0.8倍以上，峰8为S峰的0.08倍以上，峰9为S峰的0.6倍以上，峰10为S峰的0.1倍以上，其他各特征峰的相对保留时间规定值为：0.45（峰1）、0.49（峰2）、0.73（峰3）、0.90（峰4）、0.94（峰5）、0.96（峰6）、1.00[峰7（S）]、1.24（峰8）、1.35（峰9）、1.43（峰10），确定对照特征图谱。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0016] 本发明简便、快捷、准确，利用高效液相色谱法对中药组成物特征进行定性分析，提高了对组合物质量的有效控制，确保用药安全。
附图说明
[0017] 图1为对照特征图谱。
[0018] 图2为程序的确定试验结果。
[0019] 图3为盐酸益母草碱的确定试验结果。
[0020] 图4为芍药苷、橙皮苷的确定试验结果。
[0021] 图5为柚皮苷、新橙皮苷的确定试验结果。
[0022] 图6为丹酚酸B的确定试验结果。
[0023] 图7为阴性对照试验结果。
具体实施方式
[0024] 下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
[0025] 一、色谱条件及系统适用性试验
[0026] 仪器：美国戴安高效液相色谱仪（P680泵，UVD170U紫外检测器，CHROMELEON数据处理软件）；
[0027] 色谱柱：waters-C18色谱柱（250×4.6mm），依利特-C18色谱柱（250×4.6mm）；
[0028] 流动相：以乙腈为流动相A，以0.5%醋酸溶液为流动相B；按表1中的规定进行梯度洗脱。
[0029] 流速：1.0ml/min；
[0030] 检测波长：270nm；
[0031] 柱温：25℃；
[0032] 表1流动相梯度洗脱表
[0033]时间（min） 流动相A ( % ) 流动相B（%）
0～10 0→10 100→90
10～11 10→7 90→93
11～20 7→15 93→85
20～25 15→20 85→80
25～40 20→29 80→71
40～55 29→40 71→60
0～10 0→10 100→90
10～11 10→7 90→93
11～20 7→15 93→85
20～25 15→20 85→80
25～40 20→29 80→71
40～55 29→40 71→60
[0034] 参照物溶液的制备：取新橙皮苷样品适量，精密称定，加70%的甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
[0035] 供试品溶液的制备： 取本品10ml置50ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0036] 测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0037] 供试品特征图谱中应有10个峰，与参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，其相对保留时间应在规定值的±10%之内，相对保留时间都在相对保留时间值的10%以内，相对峰面积都符合峰1为S峰的0.15倍以上，峰2为S峰的0.04倍以上，峰3为S峰的0.15倍以上，峰4为S峰的0.15倍以上，峰5为S峰的1倍以上，峰6为S峰的0.8倍以上，峰8为S峰的0.08倍以上，峰9为S峰的0.6倍以上，峰10为S峰的0.1倍以上，其他各特征峰的相对保留时间规定值为：0.45（峰1）、0.49（峰2）、0.73（峰3）、0.90（峰4）、0.94（峰5）、0.96（峰6）、1.00[峰7（S）]、1.24（峰8）、1.35（峰9）、1.43（峰10）确定对照特征图谱为图1。
[0038] 二、方法的选择试验
[0039] 1、进行一些列优化试验后，较好的结果如下：
[0040]时间（min） 流动相A ( % ) 流动相B（%）
10 10 90
11 7 93
20 15 85
25 20 80
40 29 71
55 40 60
10 10 90
11 7 93
20 15 85
25 20 80
40 29 71
55 40 60
[0041] 从上表和图2可以看出，无论峰的数量、峰型还是分离度方面都较好，故选择此程序作为色谱流动相梯度洗脱程序。
[0042] 2、吸收波长的选择
[0043] 根据药典与检索的文献与上述程序，进行波长的选择试验。
[0044] 试验选取了210nm-310nm作为波长，分别测定供试品的吸收峰，从试验结果可以看出，在270nm下，基线较平稳，依据峰的数量、峰型、峰面积及峰的分离度，效果较好，故选择吸收波长为270nm。
[0045] 3、稀释溶剂的确定
[0046] 按照程序的优化试验和吸收波长的试验结果，分别用70%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇稀释样品，从试验结果可以看出，70%甲醇稀释的样品，峰的数量、峰型及峰的分离度都较好，所以确定稀释溶剂为70%甲醇。
[0047] 4、稀释量的确定
[0048] 按照上述试验结果，用70%甲醇稀释样品，从试验结果可以看出，样品10ml稀释到50ml,效果较好，所以确定稀释量为10ml稀释到50ml。
[0049] 5、流速的选择
[0050] 按照上述试验的结果，改变流速进行测定，从试验结果可以看出，流速为1.0ml/min时，峰的数量及其峰型较好，所以确定流速为1.0ml/min。
[0051] 6、流动相的选择
[0052] 按照上述试验结果，用70%甲醇稀释样品，从试验结果可以看出，流动相为乙腈-0.5%醋酸水时，峰的数量及其峰型较好，所以确定流动相为乙腈-0.5%醋酸水。
[0053] 7、色谱柱的选择：
[0054] 按照上述试验的结果，用70%甲醇稀释样品，从试验结果可以看出，色谱柱为waters柱时，峰的数量及其峰型较好，所以确定色谱柱为waters柱。
[0055] 8、根据上述试验结果的色谱条件进行试验，并配置供试品进行测定，确定结果如下：
[0056] （1）样品中含有盐酸益母草碱，（如图3）。
[0057] （2）样品中含有芍药苷、橙皮苷，（如图4）。
[0058] （3）样品中含有柚皮苷和新橙皮苷（如图5）。
[0059] （4）样品中含有丹酚酸B（如图6）。
[0060] 三、方法学试验
[0061] 1、精密度试验
[0062] 按照上述稀释溶剂和稀释量的标准配制供试样品，进行试验，结果如下：
[0063]保留时间
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 15.89 15.97 15.75 15.83 15.73 15.94 15.85 0.63
峰2 17.04 17.05 16.83 16.89 16.81 16.99 16.94 0.61
峰3 25.31 25.43 25.32 25.41 25.35 25.51 25.39 0.30
峰4 31.33 31.32 31.26 31.33 31.29 31.39 31.32 0.15
峰5 32.59 32.57 32.50 32.58 32.53 32.65 32.57 0.16
峰6 33.28 33.28 33.09 33.22 33.11 33.33 33.22 0.29
峰7 34.60 34.62 34.55 34.65 34.60 34.73 34.62 0.18
峰8 42.99 42.83 42.88 42.80 42.82 42.79 42.85 0.17
峰9 47.11 46.69 47.16 46.60 46.84 46.37 46.80 0.65
峰10 49.25 49.27 49.33 49.34 49.37 49.36 49.32 0.10
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 15.89 15.97 15.75 15.83 15.73 15.94 15.85 0.63
峰2 17.04 17.05 16.83 16.89 16.81 16.99 16.94 0.61
峰3 25.31 25.43 25.32 25.41 25.35 25.51 25.39 0.30
峰4 31.33 31.32 31.26 31.33 31.29 31.39 31.32 0.15
峰5 32.59 32.57 32.50 32.58 32.53 32.65 32.57 0.16
峰6 33.28 33.28 33.09 33.22 33.11 33.33 33.22 0.29
峰7 34.60 34.62 34.55 34.65 34.60 34.73 34.62 0.18
峰8 42.99 42.83 42.88 42.80 42.82 42.79 42.85 0.17
峰9 47.11 46.69 47.16 46.60 46.84 46.37 46.80 0.65
峰10 49.25 49.27 49.33 49.34 49.37 49.36 49.32 0.10
[0064]相对峰面积
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 0.20 0.20 0.20 0.20 0.21 0.21 0.20 2.48
峰2 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.00
峰3 0.21 0.20 0.22 0.20 0.20 0.20 0.20 4.14
峰4 0.16 0.17 0.17 0.18 0.18 0.17 0.17 4.07
峰5 1.12 1.13 1.11 1.16 1.11 1.16 1.13 2.23
峰6 0.82 0.83 0.77 0.80 0.79 0.80 0.80 2.87
峰7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰8 0.66 0.66 0.67 0.71 0.66 0.68 0.67 3.22
峰9 0.75 0.72 0.67 0.76 0.71 0.72 0.72 4.25
峰10 0.11 0.11 0.11 0.12 0.11 0.11 0.11 3.57
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 0.20 0.20 0.20 0.20 0.21 0.21 0.20 2.48
峰2 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.00
峰3 0.21 0.20 0.22 0.20 0.20 0.20 0.20 4.14
峰4 0.16 0.17 0.17 0.18 0.18 0.17 0.17 4.07
峰5 1.12 1.13 1.11 1.16 1.11 1.16 1.13 2.23
峰6 0.82 0.83 0.77 0.80 0.79 0.80 0.80 2.87
峰7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰8 0.66 0.66 0.67 0.71 0.66 0.68 0.67 3.22
峰9 0.75 0.72 0.67 0.76 0.71 0.72 0.72 4.25
峰10 0.11 0.11 0.11 0.12 0.11 0.11 0.11 3.57
[0065] 从上表结果可以看出，保留时间和相对峰面积的RSD﹤5%，精密度良好。
[0066] 2、重复性试验
[0067] 按照上述稀释溶剂和稀释量的标准配制供试样品，进行试验，结果如下：
[0068]保留时间
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 15.95 15.57 15.55 15.43 15.47 15.61 15.60 1.17
峰2 17.07 16.67 16.64 16.53 16.55 16.67 16.69 1.19
峰3 25.32 25.23 25.25 25.18 25.24 25.33 25.26 0.22
峰4 31.19 31.14 31.17 31.14 31.19 31.25 31.18 0.13
峰5 32.43 32.37 32.41 32.38 32.43 32.49 32.42 0.13
峰6 33.13 32.99 33.01 32.88 32.96 33.08 33.01 0.27
峰7 34.45 34.42 34.47 34.44 34.50 34.57 34.47 0.15
峰8 42.37 42.29 42.27 42.31 42.31 42.29 42.31 0.09
峰9 45.43 45.15 44.97 45.27 45.05 44.81 45.11 0.49
峰10 49.12 49.17 49.23 49.29 49.31 49.31 49.24 0.16
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 15.95 15.57 15.55 15.43 15.47 15.61 15.60 1.17
峰2 17.07 16.67 16.64 16.53 16.55 16.67 16.69 1.19
峰3 25.32 25.23 25.25 25.18 25.24 25.33 25.26 0.22
峰4 31.19 31.14 31.17 31.14 31.19 31.25 31.18 0.13
峰5 32.43 32.37 32.41 32.38 32.43 32.49 32.42 0.13
峰6 33.13 32.99 33.01 32.88 32.96 33.08 33.01 0.27
峰7 34.45 34.42 34.47 34.44 34.50 34.57 34.47 0.15
峰8 42.37 42.29 42.27 42.31 42.31 42.29 42.31 0.09
峰9 45.43 45.15 44.97 45.27 45.05 44.81 45.11 0.49
峰10 49.12 49.17 49.23 49.29 49.31 49.31 49.24 0.16
[0069]相对峰面积
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 0.20 0.19 0.20 0.20 0.19 0.20 0.20 2.58
峰2 0.06 0.07 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 4.45
峰3 0.19 0.20 0.20 0.18 0.20 0.20 0.19 4.27
峰4 0.17 0.17 0.16 0.17 0.16 0.17 0.17 4.28
峰5 1.17 1.11 1.11 1.15 1.11 1.11 1.13 2.48
峰6 0.75 0.69 0.69 0.73 0.68 0.69 0.71 4.27
峰7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰8 0.61 0.64 0.64 0.64 0.64 0.62 0.63 2.47
峰9 0.75 0.70 0.68 0.71 0.68 0.67 0.70 4.15
峰10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.10 0.10 0.10 4.02
1 2 3 4 5 6 AVERAGE RSD
峰1 0.20 0.19 0.20 0.20 0.19 0.20 0.20 2.58
峰2 0.06 0.07 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 4.45
峰3 0.19 0.20 0.20 0.18 0.20 0.20 0.19 4.27
峰4 0.17 0.17 0.16 0.17 0.16 0.17 0.17 4.28
峰5 1.17 1.11 1.11 1.15 1.11 1.11 1.13 2.48
峰6 0.75 0.69 0.69 0.73 0.68 0.69 0.71 4.27
峰7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
峰8 0.61 0.64 0.64 0.64 0.64 0.62 0.63 2.47
峰9 0.75 0.70 0.68 0.71 0.68 0.67 0.70 4.15
峰10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.10 0.10 0.10 4.02
[0070] 从上结果可以看出，保留时间和相对峰面积的RSD﹤5%，重现性良好。
[0071] 3、稳定性试验
[0072] 色谱条件及方法按照上述稀释溶剂和稀释量的标准配制供试样品，制备样品分别测定0h、2h、4h、8h、12h、24h的色谱峰和保留时间，结果如下：
[0073]保留时间
0h 2h 4h 8h 12h 24h AVERAGE RSD
峰1 15.93 15.89 15.98 16.15 16.05 16.09 16.02 0.62
峰2 17.03 16.99 17.06 17.23 17.16 17.19 17.11 0.57
峰3 25.35 25.41 25.46 25.56 25.47 25.54 25.46 0.31
峰4 31.29 31.33 31.39 31.47 31.42 31.48 31.40 0.24
峰5 32.53 32.59 32.65 32.74 32.68 32.74 32.65 0.25
峰6 33.15 33.25 33.34 33.48 33.37 33.48 33.35 0.38
峰7 34.57 34.63 34.69 34.78 34.71 34.79 34.70 0.24
峰8 42.70 42.73 42.77 42.81 42.89 42.86 42.79 0.17
峰9 46.18 46.04 45.97 45.81 46.37 45.97 46.06 0.42
峰10 49.28 49.31 49.35 49.37 49.38 49.39 49.35 0.08
0h 2h 4h 8h 12h 24h AVERAGE RSD
峰1 15.93 15.89 15.98 16.15 16.05 16.09 16.02 0.62
峰2 17.03 16.99 17.06 17.23 17.16 17.19 17.11 0.57
峰3 25.35 25.41 25.46 25.56 25.47 25.54 25.46 0.31
峰4 31.29 31.33 31.39 31.47 31.42 31.48 31.40 0.24
峰5 32.53 32.59 32.65 32.74 32.68 32.74 32.65 0.25
峰6 33.15 33.25 33.34 33.48 33.37 33.48 33.35 0.38
峰7 34.57 34.63 34.69 34.78 34.71 34.79 34.70 0.24
峰8 42.70 42.73 42.77 42.81 42.89 42.86 42.79 0.17
峰9 46.18 46.04 45.97 45.81 46.37 45.97 46.06 0.42
峰10 49.28 49.31 49.35 49.37 49.38 49.39 49.35 0.08
[0074]
[0075] 从上表结果可以看出，保留时间和相对峰面积的RSD﹤5%，稳定性良好。
[0076] 4、阴性对照试验
[0077] 色谱条件及方法按照上述试验方法，70%甲醇为阴性对照液，从图7结果可以看出，阴性对照对结果没有影响。
[0078] 5多批次样品的验证试验
[0079] 色谱条件及方法按照上述试验方法，制备各批次样品，分别测定，结果如下：
[0080]
[0081]
[0082] 通过多批批次样品检测，显示相对保留时间都在标准值的10%以内，相对峰面积都符合峰1为S峰的0.15倍以上，峰2为S峰的0.04倍以上，峰3为S峰的0.15倍以上，峰4为S峰的0.15倍以上，峰5为S峰的1倍以上，峰6为S峰的0.8倍以上，峰8为S峰的0.08倍以上，峰9为S峰的0.6倍以上，峰10为S峰的0.1倍以上的结论。