用于制备多糖纤维的组合物

摘要

本发明已示出，由通过在含水碱金属氢氧化物溶液中混合聚(α(1→3)葡聚糖)与CS2形成的溶液制得黄化形式的聚(α(1→3)葡聚糖)。已示出，如此形成的溶液可用于溶液纺丝成聚(α(1→3)葡聚糖)纤维，此时所述纺丝纤维在酸性凝固浴中凝固。如此制得的纤维表现出所期望的物理特性。所述使用的聚(α(1→3)葡聚糖)通过发酵合成。

权利要求

1.一种溶液，所述溶液包含0.75至2摩尔浓度碱金属氢氧化物水溶液和5至20重量％固含量的黄原酸化聚(α(1→3)葡聚糖)；其中所述黄原酸化聚(α(1→3)葡聚糖)的数均分子量为至少10,000道尔顿；并且其中所述聚(α(1→3)葡聚糖)的黄原酸化度在0.1至1的范围内。

2.根据权利要求1所述的溶液，其中黄原酸化聚(α(1→3)葡聚糖)的固含量在7.5至

15％的范围内。

3.根据权利要求1所述的溶液，其中所述碱金属氢氧化物为NaOH。

4.根据权利要求3所述的溶液，其中NaOH的浓度为1.0至1.7摩尔浓度。

5.根据权利要求1所述的溶液，其中所述黄原酸化聚(α(1→3)葡聚糖)中葡萄糖重复单元间100％的键为α(1→3)配醣键。

6.根据权利要求1所述的溶液，其中所述黄原酸化聚(α(1→3)葡聚糖)的数均分子量在

40,000-100,000道尔顿的范围内。

7.一种用于提供聚(α(1→3)葡聚糖)纤维的方法，所述方法包括：通过在0.75至2摩尔浓度碱金属氢氧化物水溶液中溶解CS2和按所得溶液总重量计5至15重量％的聚(α(1→3)葡聚糖)，形成溶液，所述聚(α(1→3)葡聚糖)的特征在于数均分子量为至少10,000Da，使所述溶液流经喷丝头，从而形成纤维；以及使所述纤维接触酸性液体凝结剂；其中在所述方法中，CS2与聚(α(1→3)葡聚糖)的重量比在0.1至1.0的范围内。

8.根据权利要求7所述的方法，其中7.5至15重量％的聚(α(1→3)葡聚糖)溶于所述溶液中。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述碱金属氢氧化物为NaOH。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述NaOH的浓度为1.0至1.7摩尔浓度。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚(α(1→3)葡聚糖)中100％的重复单元为葡萄糖，并且重复单元间100％的键为α(1→3)配醣键。

12.根据权利要求7所述的方法，还包括在纺丝前使所述溶液静置1至8小时的时间段。

13.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚(α(1→3)葡聚糖)的特征在于数均分子量在40,000-100,000道尔顿范围内。

14.根据权利要求7所述的方法，其中所述CS2最后加入。

说明书

用于制备多糖纤维的组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及通过将黄化聚(α(1→3)葡聚糖)在含水碱金属氢氧化物中的溶液溶液纺丝形成聚(α(1→3)葡聚糖)纤维的方法，并且涉及所述溶液自身。所述使用的聚(α(1→3)葡聚糖)通过发酵合成。

背景技术

[0002] 从文明之初就已知多糖(主要以纤维素的形式)，一种由葡萄糖通过自然的方法经由β(1→4)配醣键形成的聚合物；参见，例如Applied Fibre Science,F.Happey,Ed.，第8章，E.Atkins,Academic Press,New York,1979。其中也公开了许多其它多糖聚合物。

[0003] 在许多已知多糖中仅纤维素作为纤维获得了商业的突出地位。具体地，棉花是一种高纯度形式的天然存在的纤维素，它在纺织品应用方面的有益特性是熟知的。

[0004] 还已知纤维素在溶液中表现出充分的链延伸和主链刚度，以形成液晶溶液；参见，例如O'Brien，美国专利4,501,886。本领域的教导内容提出只有在β(1→4)链连接的多糖中才能获得足够的多糖链延伸，并且来自主链几何形状的任何显著偏差会降低分子长宽比(分子长宽比是形成有序态所必需的)。

[0005] 近来，其特征在于α(1→3)配醣键的葡聚糖聚合物，已经通过将蔗糖水性溶液与GtfJ葡糖基转移酶接触来分离，该酶分离自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)，Simpson等人，Microbiology，141卷，1451-1460页(1995)。已经制成了用于X射线衍射分析目的的α(1→3)-D-葡聚糖的高度结晶的、高度取向的、低分子量膜，Ogawa等人，Fiber Diffraction Methods，47，353-362页(1980)。在Ogawa的论文中，不溶解的葡聚糖聚合物被乙酰化，所述乙酰化的葡聚糖溶解以形成5％的氯仿溶液并且所述溶液浇铸成膜。然后所述膜在150℃甘油中经受拉伸，其定向所 述膜并且拉长至所述溶液浇铸膜的初始长度的6.5倍的长度。在拉伸后，所述膜被去乙酰化并在压力容器中通过在140℃超热水中退火而结晶。在本领域中熟知的是，将多糖暴露在此类热含水环境导致链裂解和分子量的损耗，并同时增加机械性能的劣化。

[0006] 基于葡萄糖的多糖和葡萄糖本身是特别重要的，因为它们在光合作用和代谢过程中的突出作用。纤维素和淀粉，两者都是基于聚葡糖酐的分子链，是地球上最丰富的聚合物并且具有很大的商业重要性。此类聚合物提供了在其整个生命周期环境友好的材料，并且由可再生的能源和原材料源构造。

[0007] 术语“葡聚糖”是专门术语，指包含β-D萄糖单体单元(其以八种可能的方式连接)的多糖。纤维素是一种葡聚糖。

[0008] 在葡聚糖聚合物中，重复的单体单元可以多种构型继而以连接模式连接起来。所述连接模式的实质依赖于，部分地，当己醛糖环闭合以形成半缩醛时环如何闭合。葡萄糖(一种己醛糖)的开链形式具有四个不对称的中心(见下文)。因此，葡萄糖有24或16种可能的开链形式，其中D-和L-葡萄糖是两种。当所述环闭合时，在C1创建了新的不对称中心因此产生了5个不对称的碳。根据所述环如何闭合，对于葡萄糖，α(1→4)-连接的聚合物，如淀粉，或β(1→4)-连接的聚合物，如纤维素，能在进一步缩合时形成聚合物。聚合物中在C1处的构型确定了其为α或β连接的聚合物，并且在α或β后面的括号中的数字是指通过其连接发生的碳原子。

[0009]

[0010] 通过所述连接模式确定了葡聚糖聚合物表现出的特性。例如，纤维素和淀粉的非常不同的特性是由它们的连接模式的相应实质确定的。淀粉或直链淀粉包含α(1→4)连接的葡萄糖，此外不形成纤维，因为它会被水溶胀或溶解。另一方面，纤维素包含β(1→4)连接的葡萄糖，并且形成优异的同时结晶的和疏水的结构材料，常常被用于纺织物应用如棉纤维，以及被用于木材形式的结构中。

[0011] 与其他天然纤维类似，棉花发展受到制约，其中多糖结构和物理特性没有经过针对纺织物用途的优化。具体地，棉花纤维是短长度纤维，在截面和纤维细度的变化有限，并且是以高度劳动力和土地密集型的过程生产的。

[0012] O’Brien，美国专利7,000,000公开了用于从乙酰化的聚(α(1→3)葡聚糖)的液晶溶液制备纤维的方法。然后将由此制得的纤维去乙酰化产生聚(α(1→3)葡聚糖)纤维。

发明内容

[0013] 相当多的有益效果归于本文的所述方法，其通过来自本文的新型溶液的纤维溶液纺丝提供了高度取向的和结晶的聚(α(1→3)葡聚糖)纤维而未牺牲分子量。

[0014] 在一个方面，本发明涉及溶液，所述溶液包含0.75至2摩尔含水碱金属氢氧化物和5至20重量％固含量的黄化聚(α(1→3)葡聚糖)；其中黄化聚(α(1→3)葡聚糖)的数均分子量为至少10,000道尔顿；并且其中所述黄化聚(α(1→3)葡聚糖)的黄化度在0.1至1的范围内。

[0015] 在另一方面，本发明涉及方法，所述方法包括在0.75至2摩尔含水碱金属氢氧化物中溶解CS2和按所得溶液总重量计5至20重量％的聚(α(1→3)葡聚糖)，形成溶液，所述聚(α(1→3)葡聚糖)的特征在于至少10,000Da的数均分子量，使所述溶液流经喷丝头，从而形成纤维；以及使所述纤维接触酸性液体凝结剂；其中在所述方法中，CS2与聚(α(1→3)葡聚糖)的重量比在0.1至1.0的范围内。

附图说明

[0016] 图1为适于气隙或湿纺本文PAGX的含水碱金属氢氧化物溶液的设备的示意图。

具体实施方式

[0017] 除非另外特别说明，当本文提供数值范围时，其旨在涵盖所述范围的端点。本文所用数值具有提供的有效数字位数的精确度，其遵循ASTME29-08部分6中所述的化学有效数字标准协定。例如，数字40涵盖35.0至44.9的范围，而数字40.0涵盖39.50至40.49的范围。

[0018] 术语“固含量”是专门术语。它在本文中用于指在本文含水碱金属氢氧化物溶液(MOH(aq))中黄化聚(α(1→3)葡聚糖)(PAGX)的重量百分比。它是由下式计算：

[0019]

[0020] 其中SC表示“固含量”，并且Wt(PAGX)、Wt(MOH(aq))分别为聚(α(1→3)葡聚糖)黄酸盐(PAGX)和含水碱金属氢氧化物的重量。术语“固含量”与相对于溶液的总重量的黄化聚(α(1→3)葡聚糖)的按重量计的浓度是同义的。

[0021] 重量％用术语“wt-％”表示。

[0022] 式“MOH”应用于表示适于本发明实施的碱金属氢氧化物。式“MOH(aq)”应用于表示适于本发明实施的含水碱金属氢氧化物溶液。应当理解，表达“MOH(aq)浓度”应是指本文含水碱金属氢氧化物溶液的摩尔浓度。

[0023] 聚合物，具体地包括葡聚糖和聚(α(1→3)葡聚糖)(PAG)，是由彼此共价地连接起来的多个所谓的重复单元组成的。在聚合物链中的所述重复单元是双自由基，所述基团形式在重复单元间提供了化学粘合。出于本发明的目的，术语“葡萄糖重复单元”是指葡萄糖的双自由基形式，其与聚合物链中的其它双自由基连接从而形成所述聚合物链。

[0024] 术语“葡聚糖”是指聚合物，包括不适于纤维形成的低聚物和低分子量聚合物。出于本发明的目的，适于本发明实施的葡聚糖聚合物为特征在于至少10,000道尔顿，优选至少40,000-100,000道尔顿数均分子量的聚(α(1→3)葡聚糖)或黄化聚(α(1→3)葡聚糖)。

[0025] 适宜的PAGX的特征在于0.1至1范围内的黄化度。术语“黄(原酸)化”是专门术语，涉及依照以下反应的羟基与碱金属氢氧化物中CS2的反应：

[0026]

[0027] 就适用于本发明方法中的PAG而言，根据上述反应方案，每个环状己糖重复单元为潜在的反应提供三个羟基以形成黄酸盐。术语“黄(原酸) 化度”是指已实际经历与黄酸盐反应的每个重复单元中可用羟基位点的平均百分比。适宜PAG聚合物分子可经历的黄化度理论最大值为3–即所述聚合物中每个单独羟基位点将经历反应。

[0028] 根据本发明，适宜的PAGX聚合物经历0.1至1的程度的黄化。这意味着，平均介于一个羟基位点每十个重复单元与10个羟基位点每十个重复单元之间已经历黄化反应，而理论最大值将为30个羟基位点每十个重复单元。

[0029] 在一个方面，本发明涉及溶液，所述溶液包含0.75至2摩尔含水碱金属氢氧化物，和5至20重量％固含量的PAGX；其中所述PAGX的数均分子量为至少10,000道尔顿；并且其中所述PAGX的黄化度在0.1至1的范围内。

[0030] 在一个实施例中，所述碱金属氢氧化物(MOH)为氢氧化钠。在另一个实施例中，所述NaOH的浓度在1.0至1.7M的范围内。

[0031] 在一个实施例中，所述固体浓度在7.5至15％的范围内。

[0032] 适于本发明方法中的PAG为特征在于至少10,000Da数均分子量(Mn)的葡聚糖，其中所述聚合物中至少90摩尔％的重复单元为葡萄糖重复单元，并且葡萄糖重复单元之间至少50％的键为α(1→3)配醣键。重复单元优选地至少95摩尔％，最优选地100摩尔％是葡萄糖重复单元。葡萄糖单元间的连接优选地至少90％，最优选地100％是α(1→3)配醣键。

[0033] 多种多糖的分离和纯化在例如The Polysaccharides，G.O.Aspinall，卷1，第2章，Academic Press，New York，1983中有所描述。适用于本发明的以满意的收率和90％的纯度制备α(1→3)多糖的任何装置是合适的。在一个此类方法中，公开于美国专利7,000,000，根据本领域提出的方法通过将蔗糖的水性溶液与分离自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)的gtfJ葡糖基转移酶接触以形成聚(α(1→3)-D-葡萄糖)。在一个其他此类方法中，gtfJ是由经基因修饰的大肠杆菌(E.Coli)生成的，如下文详述。

[0034] 适用于本发明中的PAG还可包含不是以α(1→3)配醣键连接的重复单元，包括α(1→4)、α(1→6)、β(1→2)、β(1→3)、β(1→4)或β(1→6)或它们的任何组合。根据本发明，聚合物中至少50％的配醣键是α(1→3)配醣键。葡萄糖单元间连接的优选地至少90％，最优选地100％是α(1→3)配醣键。

[0035] 本文所述溶液优选通过将适宜的PAG加入到包含二硫化碳的MOH(aq)中并且搅拌以实现充分混合来制得。PAGX在这些条件下原位形成。溶液中PAGX的固含量在相对于溶液总重量的5至20重量％的范围内。当PAGX的固含量低于5％时，所述溶液的纤维形成能力大幅下降。形成固含量高于15％的溶液越来越成问题，需要不断细化的溶液形成技术。

[0036] 在任何给定实施例中，PAGX的溶解度极限是PAGX分子量、MOH(aq)浓度、黄化度、混合持续时间、形成溶液时溶液的粘度、溶液经受的剪切力和混合发生时的温度的函数。一般来讲，更高的剪切混合和更高的温度与更高的溶解度相关联。混合的最高温度限于CS2的沸点46℃。从溶解度和可纺性角度上看，MOH(aq)和CS2的最佳浓度可根据混合过程中的其它参数而变化。

[0037] 在本发明的实施中已发现，在室温下在约一至三小时内定量发生CS2与PAG的反应形成黄酸盐。还已观测到，如此形成的黄酸盐是化学不稳定的，在约36小时溶液时间后完全降解成多种副产物。因此本文实施者必须在形成黄酸盐的所需时间之后，但是在显著降解可能发生之前使用本文溶液纤维纺丝。因此对于在室温下制得的本文溶液，根据黄酸盐形成的反应时间，优选在介于1至3小时溶液时间之间实施纺丝。术语“溶液时间”是指自溶液成分首次混合起所经历的时间。因此，在本文所述方法的一个优选实施例中，将成分混合，使其静置1至3小时，然后如下文详细描述的，纺成纤维。在一个化学方面稍微次优选，但是在实践方面更优选的实施例中，大约1-5小时的溶液时间也是适宜的。

[0038] 本发明还涉及一种方法，所述方法包括在0.75至2摩尔含水碱金属氢氧化物中溶解CS2和按所得溶液总重量计5至15重量％的PAG，形成溶液，所述PAG的特征在于至少10,000Da的数均分子量；使所述溶液流经喷丝头，从而形成纤维；以及使所述纤维接触酸性液体凝结剂；其中在所述方法中，CS2与PAG的重量比在0.1至1.0的范围内。

[0039] 在一个实施例中，所述碱金属(M)为钠。

[0040] 在本文所述方法的另一个实施例中，适宜的PAG为其中重复单元100％为葡萄糖，并且葡萄糖重复单元间的键100％为α(1→3)配醣键的一种PAG。

[0041] 在本文所述方法中，为实现稳定的纤维形成，溶液中所需的PAGX最小固含量根据PAGX分子量以及黄化度而变化。在本发明的实践中发现5％固含量逼近稳定的纤维形成所需浓度的下限。在>15％，尤其是大于20％固体下，存在过量的未溶解PAGX，造成纤维纺丝性能下降。优选具有至少7.5％固含量的溶液。更优选1.0至1.7M NaOH溶液中约7.5％至约15％范围内的固含量。优选其特征在于40,000-100,000道尔顿范围内数均分子量和0.1-1范围内黄化度的PAGX。

[0042] 可通过本领域已知并且如O'Brien(上文引用)中所述的方法，实施由本文溶液进行纺丝。可通过如活塞推动或泵作用的途径，迫使粘稠的纺丝溶液通过单孔或多孔喷丝头或其它模具形式。如本领域已知的，所述喷丝孔可为任何横截面形状，包括圆的、平坦的、多叶形的等等。然后可经由普通装置将挤出的股段传递至其中包含液体凝结剂的凝固浴，所述液体凝结剂将PAGX转变回PAG，致使所述聚合物凝结成根据本发明所述的纤维。

[0043] 适宜的液体凝结剂包括但不限于冰乙酸，含水乙酸，硫酸，硫酸、硫酸钠和硫酸锌的组合。在一个实施例中，所述液体凝结剂保持在0-100℃范围内，还优选15-70℃范围内的温度下。

[0044] 在一个实施例中，所述凝固浴包含冰乙酸。在本发明的实践中发现使用过量的冰乙酸作为凝结剂液体获得了满意的结果。在纺丝期间，冰乙酸中和含水NaOH，并且在纺丝纤维通过凝固浴时由PAGX重新生成PAG。

[0045] 在一个优选的实施例中，使挤出物直接进入凝固浴。在此情况下，本领域称为“湿纺”，喷丝头部分或完全浸没于凝固浴中。喷丝头和相关配件应由耐蚀合金如不锈钢或铂/金构成。

[0046] 在一个实施例中，接着使由此凝固的纤维通入到所提供的第二浴液中，以中和并且稀释来自凝固浴的残余的酸。第二浴液优选包含H2O、甲醇、或5％含水NaHCO3、或它们的混合物。优选含水NaHCO3。在一个实施例中，使卷绕纤维包装件浸泡在一个或多个中和洗涤浴中，每个浴液中浸泡至多四小时时间。已发现，分别包含5％含水NaHCO3、甲醇和H2O的浴液系列是令人满意的。

[0047] 本发明还由本文以下具体实施例描述，但不限于此。

[0048] 实例

[0049] 葡糖基转移酶(gtfJ)的制备

[0050] 材料

[0051] 透析管(Spectrapor 25225-226，12000截留分子量)购自VWR(Radnor,PA)。

[0052] 葡聚糖和乙醇购自Sigma Aldrich。蔗糖购自VWR。

[0053] Suppressor 7153消泡剂购自Cognis Corporation(Cincinnati,OH)。

[0054] 所有其它化学制品购自常用供应商。

[0055] 种子培养基

[0056] 用于发酵罐培养起始培养物的种子培养基，包含：酵母提取物(Amberx 695，5.0克/升(g/L))，K2HPO4(10.0g/L)，KH2PO4(7.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.0g/L)，(NH4)2SO4(4.0g/L)，MgSO4七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。培养基pH使用5N氢氧化钠或H2SO4调节至6.8，并且培养基在烧瓶中灭菌。灭菌后加入葡萄糖(20mL/L的50％重量/重量溶液)和氨苄青霉素(4mL/L的25mg/mL原液)。

[0057] 发酵罐培养基

[0058] 在发酵罐中使用的生长培养基包含：KH2PO4(3.50g/L)，FeSO4七水合物(0.05g/L)，MgSO4七水合物(2.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)，Suppressor 7153消泡剂(0.25毫升/升，mL/L)，NaCl(1.0g/L)，CaCl2二水合物(10g/L)，和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。NIT痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO4水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO4七水合物(0.5g/L)，ZnSO4七水合物(0.2g/L)，CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入葡萄糖(12.5g/L的50％重量/重量溶液)和氨苄青霉素(4mL/L的25mg/mL原液)。

[0059] 构建葡糖基转移酶(gtfJ)表达菌株

[0060] 使用针对在大肠杆菌(E.Coli)中表达优化过的密码子合成来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(ATCC 25975)的编码成熟葡糖基转移酶(gtfJ；EC 2.4.1.5；AAA26896.1，SEQ ID NO:3)的基因(DNA 2.0，Menlo Park CA)。将核酸产物
(SEQ ID NO:1)亚克隆进  (DNA 2.0，Menlo Park CA)以生成标识为pMP52
(SEQ ID NO:2)的质粒。质粒pMP52用于转化大肠杆菌(E.coli)MG1655(ATCC47076)以生成标识为MG1655/pMP52的菌株。

[0061] 本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且描述于Sambrook,J.和Russell,D.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第五版Current Protocols，John Wiley和Sons，Inc.，N.Y.，2002。

[0062] 适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下列实例的技术可在如下文献列出的内容中找到：Manual ofMethods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Manual ofIndustrial Microbiology and Biotechnology，第三版(Richard H.Baltz，Julian E.Davies和Arnold L.Demain编辑)，ASM Press，Washington，DC，2010。

[0063] 在发酵中制备重组gtfJ

[0064] 在发酵罐中制备重组gtfJ酶起始于表达gtfJ酶，如上文所述构造。将种子培养基的10mL等分试样加入到125mL一次性带挡板烧瓶中，并且用1.0mL于20％甘油中的上文制得的大肠杆菌(E.coli)MG1655/pMP52培养物接种。使这一培养物在37℃、300转/分钟(rpm)振荡条件下生长3小时。

[0065] 发酵罐中起始的种子培养物通过将0.5L种子培养基加到2L振荡烧瓶中进行制备。将1.0mL前种子培养物无菌转移到烧瓶中的0.5L种子培养基中，并且在37℃和300rpm条件下培养5小时。在光密度550nm(OD550)>2时将种子培养物转移到14L发酵罐(Braun,Perth Amboy,NJ)中，该发酵罐包含8L上述发酵罐培养基，温度为37℃。

[0066] 使大肠杆菌(E.coli)MG1655/pMP52的细胞在发酵罐中生长，并且当培养基中的葡萄糖浓度降至0.5g/L时开始葡萄糖进料(50％重量/重量葡萄糖溶液，包含1％重量/重量MgSO4·7H2O)。进料开始时为0.36克进料/分 钟(g进料/分钟)，并且每小时分别逐渐提高到0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.411.63、1.92、2.2g进料/分钟。速率保持恒定，之后当葡萄糖浓度超过0.1g/L时减少或暂时停止葡萄糖进料。使用YSI葡萄糖分析仪(YSI,Yellow Springs,Ohio)监控培养基中的葡萄糖浓度。

[0067] 当细胞达到OD550为70时，通过加入9mL 0.5M IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)开始诱导葡糖基转移酶活性。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速率(400至1200rpm)并且随后通过通风速率(2至10标准升/分钟，slpm)控制DO。将pH控制在6.8。NH4OH(14.5％重量/体积，w/v)和H2SO4(20％w/v)用于pH控制。将回压保持在0.5巴。在不同的间隔(20、25和30小时)，将5mLSuppressor 7153消泡剂加入到发酵罐中以抑制发泡。在加入IPTG后通过离心8小时收获细胞并将其储存在-80℃作为细胞浆。

[0068] 由细胞浆制备gtfJ粗制酶提取物

[0069] 将上文获得的细胞浆悬浮在pH7.2的50mM磷酸钾缓冲液中，浓度为150g/L，制备浆液。在12,000psi(Rannie型设备，APV-1000或APV16.56)下将浆液匀化并且将匀浆冷却至4℃。伴随着适中的有力的搅拌，每升细胞匀浆加入50g絮凝物溶液(Aldrich no.409138，在pH7.0的5％的50mM磷酸钠缓冲液中)。将搅拌降低至轻度搅拌，保持15分钟。随后通过在5-10℃，在4500rpm下离心3小时澄清细胞匀浆。包含粗制gtfJ酶提取物的上清液用30千道尔顿(kDa)的截留膜进行浓缩(大约5X)。gftJ酶溶液中的蛋白浓度用二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定法(Sigma Aldrich)测定为4-8g/L。

[0070] 聚合物、纺丝溶液和纤维的制备

[0071] 纺丝设备和方法

[0072] 图1是适用于本文的纤维纺丝方法的设备的示意图。蜗轮驱动装置，1，驱动活塞，2，以受控的速率至活塞，装配至纺丝仓3中。纺丝仓可容纳过滤器组件。合适的过滤器组件包括100和325目不锈筛。纺丝组合件4包括所述喷丝头5和任选的不锈钢筛作为喷丝头的预过滤器。将由其制得的挤出的长丝6导入到液体凝固浴7中。在表1中所列的所有实例中，将长丝由喷丝头直接挤入到液体凝固浴中–喷丝头底部浸没于所述浴中。

[0073] 挤出物可以是，但不一定是，定向往复通过导轨间的浴槽8，其通常是由PTFE制成的。图1中只示出了一个穿过浴槽的通道。离开凝固浴7，由此淬火的长丝9可任选独立地使用驱动辊10定向通过拉伸区，由此淬火的长丝围绕在所述驱动辊上。淬火的长丝可任选定向通过拉伸浴11，其允许进一步处理，诸如额外的溶剂提取、洗涤或拉伸挤出的长丝。然后使用卷绕辊13，将由此制得的长丝定向通过遍历机构12，以使纤维均匀分布在线轴上，并且收集在塑料线轴上。在一个实施例中，所述方法包括多个独立驱动的辊。

[0074] 在一个实施例中，将驱动辊10从纤维途径中去除，但是仍然将纤维浸没于拉伸浴中。二者彼此独立。在所有下文实例中，将驱动辊10从纤维途径中去除。

[0075] 在一个实施例中，通过多孔喷丝头挤出多根长丝，然后会聚这样制备的长丝形成纱。在另一个实施例中，所述方法还包括多个多孔喷丝头使得可以同时制备多根纱。

[0076] 在每个实例中，将所制得的纤维卷绕线轴在一桶表1中所示液体中浸泡过夜。然后将由此浸泡的纤维线轴风干至少24小时。接着根据ASTMD2101-82，测定纤维拉伸特性。

[0077] 纺丝仓、活塞、连接管材和喷丝头均由不锈钢构成。

[0078] 纤维物理特性测量.

[0079] 使用符合ASTM标准D 2101-82的方法和器械测量物理特性诸如韧度、伸长和初始模量，不同的是试样长度为10英寸。记录的结果是3至5个单独纱线测试的平均值。

[0080] 测定每个所制得纤维的物理特性。结果示于表1中。包括所制得纤维的旦尼尔和物理特性，诸如以克/旦尼尔(gpd)为单位的韧度(T)、断裂伸长率(E，％)、和以gpd为单位的初始模量(M)。

[0081] 术语表

[0082]列标签 实际项 解释
JetVel.(fpm) 喷射速度 从喷丝头离开时纤维的线速度
fpm 英尺/分钟  
Coag. 凝结  
Temp. 温度  

[0083]NA 不适用 参数不适用于该实例
NT 未测试  
S.S.F. 纺丝拉伸因子 纺丝拉伸因子＝(卷绕速度)/(喷射速度)
MeOH 甲醇  

[0084] 材料

[0085]

[0086] 实例1

[0087] 聚合物P1的制备

[0088] 通过在约18L水中混合1000g蔗糖(VWR#BDH8029)、20g葡聚糖T-10(Sigma#D9260)和370.98g硼酸(Sigma#B6768)，制备二十升含水溶液。使用4N NaOH(EMD#SX0590-1)溶液将pH调节至7.5。然后加入额外的水以使总体积达到20L。然后向由此制得的溶液中加入180mL上文制得的酶提取物，并且使其在环境温度下静置48小时。在40微米滤纸上使用325目筛网，将所得聚(α(1→3)葡聚糖)固体收集于布氏漏斗上。滤饼用去离子水洗涤，并且如上过滤。将去离子水洗涤再重复三次。最后用甲醇再进行两次洗涤；在漏斗上挤压所述滤饼，并且在室温下真空干燥。收率：237.68g白色片状固体。

[0089] 分子量是使用GPCV/LS 2000TM(Waters Corporation,Milford,MA)的色谱图、通过尺寸排阻色谱法测定的(SEC)(装备了两个Zorbax PSM双峰二氧化硅柱(Bimodal-s silica column)(Agilent,Wilmington,DE)，采用含3.0％LiCl(Aldrich,Milwaukee,WI)的DMA(来自J.T Baker，Phillipsburg，NJ)作为流动相)。样品溶解于含5.0％LiCl的DMA中。发现数均和重均分子量(Mn和Mw)分别是139,000和279,000道尔顿。

[0090] 实例1纺丝溶液

[0091] 向250mL广口玻璃瓶中加入25g聚合物P1和225g 5重量％氢氧化钠。然后经由注射器加入CS2(7.5g)。所述容器配有顶盖和隔膜，穿过所述顶盖和隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用搅拌棒手动混合内容物，然后使其在室温下静置过夜。第二天将部分溶解的溶液(澄清但包含少量可见颗粒)转移到包含筛网组合件的纺丝仓和活塞中，所述筛网组合件包括100目和325目不锈钢筛网。活塞安装在粘稠的混合物上方。然后使用电动蜗轮驱动活塞将所述混合物来回泵送13个循环，进入通过由1/4英寸不锈钢管材加工成形的连接器与第一仓头对头连接的同等配置的纺丝仓中。

[0092] 实例2-4：纤维纺丝

[0093] 制备实例1溶液后约20小时，将由此制得的溶液送入到如上文所述的纺丝设备中，参见图1。将溶液送入到20孔喷丝头中，其中每个孔的特征在于0.003英寸直径和0.006英寸长的圆形横截面。表1提供了用于实例2-4中所制得纤维的纺丝条件。如上所述，通过从实例1-3中的长丝途径中移除驱动辊10，改进图1中所示设备。通过比喷射速度更快地进行卷绕，获得所示纺丝拉伸。计量表1所示速率下通过纺丝组合件至喷丝头的实例1的溶液，所述纺丝组合件具有由100目和325目筛网组成的过滤器组件。将所述喷丝头浸没于水凝固浴中，按重量计，所述水凝固浴包含8％的H2SO4、23％的Na2SO4、和0.5％的ZnSO4。在表1中所示温度下，将长丝直接垂直挤出到淬火浴中。如所示出的，通过使纤维在附加定位销(8)上运送4.1或11英尺的总浸没距离，增加在6英尺长凝固浴中的额外停留时间。在实例2和3中，在从凝固浴中取出后，以表1中所示的卷绕速度，将由此凝固的长丝导向具有遍历导杆的速度受控的卷绕机。在实例4中，以表1中所示的长度和温度，将凝固的长丝导向第二甲醇浴。在每个实例中，数百英尺的纤维卷绕在线轴上。卷绕后，将实例2-4中的纤维线轴分别相继浸泡于
5％NaHCO3、MeOH和H2O浴中，每个浴液中浸泡约4小时时间。使纤维风干，然后进行物理测量。测定物理特性；结果示于表1中。

[0094]

[0095]

[0096]

[0097] 实例5-11

[0098] 聚合物P2的制备

[0099] 使用实例1中用于制备聚合物P1的材料和方法，合成、洗涤和分离聚(α(1→3)葡聚糖)聚合物，不同的是将200mL而不是180mL酶提取物加入到pH调节的蔗糖/葡聚糖/硼酸溶液中。收率：246.08g白色片状固体。

[0100] 如聚合物P1一样，测得Mn和Mw分别为129,000和270,000。

[0101] 实例5：纺丝溶液

[0102] 向250mL广口玻璃瓶中加入18g聚合物P2和225g 4.5重量％氢氧化钠。然后经由注射器加入CS2(2.7g)。所述容器配有顶盖和隔膜，穿过所述顶盖和隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用搅拌棒手动地搅拌内容物，然后使其在室温下静置过夜。72小时后，将部分溶解的溶液转移到包含筛网组合件的纺丝仓和活塞中，所述筛网组合件包括325目不锈钢筛网。活塞安装在粘稠的混合物上方。然后使用电动蜗轮驱动活塞将所述混合物来回泵送13个循环，进入通过由1/4英寸不锈钢管材加工成形的连接器与第一仓头对头连接的同等配置的纺丝仓中。

[0103] 实例6-11：纤维纺丝

[0104] 在表1所示条件下，以上文实例2-4中纤维的方式，由实例5的纺丝溶液将实例6-11的纤维纺丝。在实例6-9中，将长丝直接挤出到包含5％H2SO4(含水)的凝固浴中。在实例10中，将纤维直接挤出到包含冰乙酸的凝固浴中。在实例11中，将纤维直接挤出到50/50乙酸/水(v/v)中。通过使纤维在附加定位销(8)上运送3、4.3或4.5英尺的总浸没距离，提供额外的凝固浴长度。在实例7-11而不是在实例6中，在从凝固浴取出后，以表1中所示的长度和温度，将由此凝固的长丝定向通过第二甲醇浴(11)。将实例6的纤维直接导向卷绕机。将实例7-11的凝固纤维以表1中所示的卷绕速度，从第二浴导向卷绕机。如实例2-4中一样，浸泡纤维线轴。

[0105] 测定物理特性；结果示于表1中。

[0106] 实例12-15

[0107] 实例12纺丝溶液

[0108] 向250mL广口玻璃瓶中加入20g聚合物P2和180g 4.5重量％氢氧化钠。然后经由注射器加入CS2(3.0g)。所述容器配有顶盖和隔膜，穿过所述顶盖和隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用塑性搅拌棒手动地搅拌内容物，然后使其静置2天。将部分溶解的溶液转移至300mL不锈钢圆筒中，所述圆筒配有2×100目、1×325目和2×20目不锈钢筛网。活塞安装在粘稠的混合物上方。然后使用电动蜗轮驱动活塞将所述混合物来回泵送13个循环，进入通过由1/4英寸不锈钢管材加工成形的连接器与第一仓头对头连接的同等配置的纺丝仓中。

[0109] 实例13-15：纤维纺丝

[0110] 在表1所示条件下，以上文实例2-4中纤维的方式，由实例12的纺丝溶液将实例13-15的纤维纺丝。在表1中所示温度下，将纤维直接挤出到5％H2SO4(含水)中。以表1中所示的卷绕速度，将从凝固浴中取出后由此凝固的纤维导向卷绕机。如表1中所示，使实例14和15的凝固纤维首先通过第二浴。如实例2-4中一样，将纤维线轴浸泡并且干燥。

[0111] 测定物理特性；结果示于表1中。

[0112] 实例16

[0113] 聚合物P3的制备

[0114] 使用实例1中用于制备聚合物P1的材料和方法，合成、洗涤和分离聚(α(1→3)葡聚糖)聚合物，不同的是将200mL而不是180mL酶提取物加入到pH调节的蔗糖/葡聚糖/硼酸溶液中。收率：228.52g白色片状固体。Mn为132,000道尔顿；Mw为301,000道尔顿。

[0115] 实例16纺丝溶液

[0116] 向250mL广口玻璃瓶中加入18g聚合物P3和225g 4.5重量％氢氧化钠。所述容器配有顶盖和隔膜，穿过所述顶盖和隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用搅拌棒手动地搅拌内容物，然后使其在室温下静置过夜。第二天早晨，接着经由注射器加入CS2(5.4g)。加入CS2后，将部分溶解的溶液立即转移到包含筛网组合件的纺丝仓和活塞中，所述筛网组合件包括100目不锈钢筛网。活塞安装在粘稠的混合物上方。然后使用电动蜗轮驱动活塞将所述混合物来回泵送13个循环，进入通过由1/4英寸不锈钢管材加工成形的连接器与第一仓头对头连接的同等配置的纺丝仓中。

[0117] 实例17-23纤维纺丝

[0118] 表1给出纺丝条件，其用于在实例17-23中制备的纤维。如上所述，通过从长丝途径中移除驱动辊10，改进图1中所示设备。通过比喷射速度更快地进行卷绕，获得纺丝拉伸。计量表1所示速率下通过纺丝组合件至20孔喷丝头的由此制得的纺丝溶液，所述纺丝组合件具有由100目和325目不锈钢筛网组成的过滤器组件，所述20孔喷丝头具有.003英寸直径和.006英寸长的孔。在表1中所示的凝固浴温度下，对于实例17-19，将长丝直接挤出到5％H2SO4中，而对于实例20-23，将长丝直接挤出到10％H2SO4中。从凝固浴中取出后，以表1中所示的长度和温度，将由此凝固的长丝定向通过第二甲醇浴(11)，之后定向至卷绕机。将实例17、20和21的长丝直接导向卷绕机。就实例23而言，用水填充第二浴。在加入二硫化碳起8小时内，完成纤维纺丝。

[0119] 将纤维线轴在5％NaHCO3中浸泡15分钟，然后在水中浸泡过夜。然后取出线轴并且使其风干，之后进行物理测试。

[0120] 实例24

[0121] 纺丝溶液

[0122] 向250mL广口玻璃瓶中加入32.9g聚合物P3和220g 5重量％氢氧化钠。所述容器配有顶盖和隔膜，穿过所述顶盖和隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用搅拌棒手动地搅拌内容物，然后使其在室温下静置过夜。第二天早晨，接着经由注射器加入CS2(9.9g)。加入CS2后，将部分溶解的溶液立即转移到包含筛网组合件的纺丝仓和活塞中，所述筛网组合件包括100目不锈钢筛网。活塞安装在粘稠的混合物上方。然后使用电动蜗轮驱动活塞将所述混合物来回泵送11个循环，进入通过由1/4英寸不锈钢管材加工成形的连接器与第一仓头对头连接的同等配置的纺丝仓中。

[0123] 实例25-31

[0124] 纤维纺丝

[0125] 表1给出纺丝条件，其用于在实例25-31中制备的纤维。如上所述，通过从实例25-27的长丝途径中移除驱动辊10，改进图1中所示设备。通过比喷射速度更快地进行卷绕，获得纺丝拉伸。计量表1所示速率下通过纺丝组合件至20孔喷丝头的由此制得的纺丝溶液，所述纺丝组合件具有由100目和325目不锈钢筛网组成的过滤器组件，所述20孔喷丝头具有.003英寸直径和.006英寸长的孔。在表1中所示的凝固浴温度下，对于实例25- 30，将长丝直接挤出到10％H2SO4中，而对于实例31，将长丝直接挤出到冰乙酸中。从凝固浴中取出后，以表1中所示的长度和温度，将实例26、27和30中由此凝固的长丝定向通过第二水浴(11)，之后定向至卷绕机。实例25、28、29和31中的长丝直接导向卷绕机，并且不通过第二浴。在将二硫化碳加入至纺丝溶液起8小时内，完成纤维纺丝。

[0126] 使纤维线轴在5％NaHCO3中浸泡过夜，然后在水中再浸泡一天。然后取出线轴并且使其风干，之后进行物理测试。

[0127] 实例32-44和比较例A-W

[0128] 制备36个溶液，以限定获得适于纤维纺丝溶液的溶液参数。对于实例32-44和比较例A-W中的每一个，向40mL玻璃小瓶中加入表2中所示的含水碱金属氢氧化物。碱金属氢氧化物溶液浓度(以重量％为单位)和所述碱金属氢氧化物溶液的量也示于表2中。然后将2g聚合物P1加入到每个小瓶中。加入表2中所示量的二硫化碳(CS2)，并且所述小瓶配有隔膜，穿过所述隔膜配有聚丙烯搅拌棒。用塑性搅拌棒手动地搅拌内容物，然后使其在室温下静置至少12小时，间歇搅拌。表2中指定的溶解度通过目视检测确定。认为澄清溶液是完全溶解的；认为四周具有一些悬浮小颗粒的澄清溶液是也溶解的；因为认为可通过更强烈的搅拌，驱使部分溶解的溶液变成完全溶解。认为具有未溶解大颗粒的浑浊溶液是未溶解的。

[0129]

[0130]

[0131] 实例45：使用NMR光谱测定葡聚糖黄酸盐的形成和分解

[0132] 将2g聚(α(1→3)葡聚糖)溶于25mL氢氧化钠水溶液(4.5重量％)中。完全溶解后，加入0.6g二硫化碳，然后将如此形成的混合物机械搅拌，并且使用注射器和针头，立即转移到由New Era Enterprises，Inc出售的特定4.1mm OD样品管中。将所述管封端并且落入到标准7英寸5mm NMR管中，所述NMR管包含60μL的D2O作为NMR锁场溶剂。将这些同心管放入小型台式离心机中，并且旋转几分钟，以使样品到达内管底部，并且消除样品中所有的气泡。将NMR管从离心机中取出，并且放入到Bruker500MHz Avance II频谱仪的磁场中，所述频谱仪配备具有z梯度的5mmCPDUL冷冻探针。将探针调谐，并且调整磁场，之后开始一系列连续实验，以研究聚(α(1→3)葡聚糖)的形成和分解。使用Bruker zgig脉冲序列，33333.3Hz(265.0ppm)谱宽，160ppm发射器偏置，和32768个时域点， 每个实验采集0.4916秒采集时间。脉冲之间采用3秒延迟，并且每个实验采集3000次扫描，每个实验总时间为2小时56分钟。

[0133] 为了消除基线滚动并且获得更佳的峰积分，将每个实验的数字数据转化成模拟数据，使得可进行反向线性预测。基于前1024个数据点，采用Bruker线性预测数据处理，替代每个数据组的前12个点。转化前，还将自由感应衰减乘以2.0Hz指数函数。为了测定黄酸盐取代度，将中心位于232.5ppm处的黄酸盐碳的积分面积与用作内部校正的95.6-100.9ppm处葡聚糖C1异头碳的积分面积(设为1.00)进行比较。在该系列实验中，没有在任何点观察到游离CS2的13C信号(193.7ppm)，但存在为葡聚糖黄酸盐随时间推移降解的副产物的三硫代碳酸钠(269.4ppm)和碳酸钠(168.4ppm)的信号。结果示于表3中。

[0134]