一种地椒快速增殖的方法

摘要

本发明公开了一种地椒快速增殖的方法，包括取单核靠边期的花药进行消毒处理；接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；继代增殖培养，将不污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代4次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；接种生根培养基，筛选获得单体植株。本发明的培养结果为：愈伤组织的诱导率达到89％，生根率达到85％，移栽成活率达到80％，10代变异率在6％以下。

权利要求

1.一种地椒快速增殖的方法，其特征在于，包括1)取单核靠边期的花药进行消毒处理，将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒8-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～6次；2)接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；3)继代增殖培养，将不污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代4次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；4)接种生根培养基，筛选获得单体植株；所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖50g/L；培养基的pH6.6，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度1700Lx；所述的第一继代培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖15g/L；所述第二继代培养基为：1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖35g/L+琼脂粉7.3g/L；所述空白培养基为：

1/2MS+磷酸二氢钾150mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，继代培养过程中，培养基的pH6.5，培养温度为25±1℃，16h/d的光周期，光照强度1200Lx；所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂2～3g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；培养条件为：培养基的pH6.5，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度1600Lx。

2.根据权利要求1所述的地椒快速增殖的方法，其特征在于， 还包括，炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗4d，待地椒苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。

说明书

一种地椒快速增殖的方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业技术领域，涉及组织培养技术，具体涉及一种地椒快速增殖的方法。

背景技术

[0002] 地椒，又名地花椒(《海上名方》)，百里香(《植物学大辞典》)，山椒(《中国药植图鉴》)，山胡椒(《辽宁经济植物志》)。为唇形科植物。主要分布于内蒙、宁夏、青海、山西等地。在中药应用中可以祛风解表，行气止痛，用于感冒、头痛、牙痛、腹胀冷痛。

[0003] 地椒全株具有浓郁香味，采几片叶子，在手中揉搓，就可发出淡淡的芳香，香气温和可人。芳香油占茎梢和叶的3％，主要成分有芳香樟醇、龙脑、对一聚伞花素、麝香草酚、胺油醇、单宁蒜、皂角苷、苦味物质和各种矿物质，其中钾、钙含量较高。具有良好的美容、保僵防腐、杀菌、帮助消化、解酒、利尿、抗风湿等作用，其特别之处是可强化免疫系统。因此地椒具有十分重要的药用价值。地椒的药用价值早在《本草纲目》中就有记载。在前苏联的医学研究中,对其叶花的防腐杀菌特性也有记载。近年来，已将百里香属植物的化学成分用于医疗、保健、化妆、食品,其开发利用的潜在价值日趋明显。目前,地椒大多是野生的,未得到充分利用。

[0004] 地椒可以播种、扦插、压条、分株法繁殖，除了夏季之外，都很适合繁殖。但是这些繁殖方法速度较慢，难以达到快速增殖的目的。为发掘其药用价值,用组培快速繁殖方法于短期内获得大量无菌苗以供提取有效药用成分的前景是可能的。“地椒的组织培养及植株再生”(赵庆臻，植物生理学通讯，第38卷第4期，2002年8月)一文中公开了用带腋芽的嫩茎段作为无性繁殖的材料进行组织培养来快速获得地椒植株的方法，“地椒组织培养及防止玻璃化研究”(徐美隆，安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(1):114-116)一文中也公开了带腋芽的茎段作为无性繁殖的材料进行组织培养并对其培养条件进行了筛选，虽然繁殖率也较高，但是发明人在长期的操作过程中发现连续继代培养4代以后容易出现变异，因此，需要不断接种培养获得愈伤组织才能繁殖更多植株，对快速繁殖不利。

发明内容

[0005] 针对目前存在的问题，本发明提供一种地椒快速增殖的方法，可以快速有效的繁殖地椒，并且解决其继代培养变异的问题，成活率较高，不受季节的影响，大幅度降低增殖成本，满足规模化生产需要。

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种地椒快速增殖的方法，包括

[0008] 1)取单核靠边期的花药进行消毒处理；

[0009] 2)接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；

[0010] 3)继代增殖培养，将不污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代4次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；

[0011] 4)接种生根培养基，筛选获得单体植株。

[0012] 所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒8-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～6次。

[0013] 所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS+6-BA 1.2mg/L+NAA0.12mg/L+蔗糖50g/L；培养基的PH6.6，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度1700Lx左右。

[0014] 所述的第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖15g/L；所述第二继代培养基为1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖35g/L+琼脂粉7.3g/L；所述空白培养基为1/2MS+磷酸二氢钾150mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，继代培养过程中，培养基的PH6.5，培养温度为25±1℃，16h/d的光周期，光照强度1200Lx左右。

[0015] 所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂2～3g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；培养条件为：培养基的PH6.5，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度1600Lx左右。

[0016] 在培养过程中还包括，炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗4d，待地椒苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。

[0017] 发明人通过一系列实验来证明本发明的有效性。

[0018] (一)外植体的选择

[0019] 于5、6月份，将采收的花药、带腋芽的茎段、茎尖、花瓣分别作为外植体进行对比，其余条件相同，并且按照本发明的步骤进行，见表1，从对比可以看出，采用花药作为外植体，不仅愈伤组织的诱导率和生根率最高，分别可以达到80％、76％，而且经过5代继代培养变异率最低，可以解决地椒繁殖过程中容易出现变异的难题。

[0020] 表1

[0021]

[0022] (二)继代培养培养基的选择

[0023] 方法1：将50个愈伤组织接种到1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖15g/L培养基上，继续继代培养过程中始终不换培养基。

[0024] 方法2：另外50个愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代4次，转入第二继代培养基继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖15g/L；第二继代培养基为1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖35g/L+琼脂粉7.3g/L。

[0025] 方法3：还有50个愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代4次，转入不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖。第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖15g/L；空白培养基为1/2MS+磷酸二氢钾150mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L。

[0026] 经过10代继代培养后比较其变异率，对比结果见表2，从比较结果来看，在经过4代培养后开始转换培养基，可以大大减少其变异率，对地椒快速增殖具有决定性的作用。

[0027] 表2

[0028]对比 变异率(％)
方法1 43
方法2 4％
方法3 6％

[0029] 有益效果：

[0030] (1)本申请以花药作为外植体，发明人经过大量长期实践操作，发现将花药作为外植体可以长期保持其优良的性状，不易产生变异；

[0031] (2)发明人发现，在工厂化育苗过程中，继代超过4代左右，开始出现变异，经研究发现，上述原因是激素累积导致，因此，在继代过程中，采用了转换培养基的方法，减少激素的累积给地椒苗的影响，这也是本发明的重点之一；

[0032] (3)在整个培养过程中，都采用1/2MS培养基代替常规的MS培养基，避免组培苗徒长影响芽分化；在空白培养基中增加了能够促进芽分化的磷酸二氢钾和水解乳蛋白；在继代过程中，提高了光强，培养基中减少了无机盐含量，增加了磷酸二氢钾和水解乳蛋白，从而抑制了组培苗徒长，促进了芽分化，取得了意料不到的效果；

[0033] (4)本发明具有花粉萌发成胚时间短、加倍效率高、产量大及较容易获得优良育种中间材料等优点，在育种材料提纯复壮、种质资源创新、多倍体育种及花粉发育进程研究等方面内容，具有较大的实用价值；

[0034] (5)本发明培养过程速度快，再生频率较高，变异率较低，周期相对较短，能较好地保持地椒的遗传稳定性。

具体实施方式

[0035] 实施例1：一种地椒快速增殖的方法，包括

[0036] 1、外植体的选择：6月底在盛花期，在早晨9:00～10:00)取单核靠边期的花药。

[0037] 2、消毒处理：将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒8-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～6次。