氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品及其应用

摘要

本发明公开了氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品及其应用，氨氯地平与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：氨氯地平＝1:8(μg/ml)；氟桂利嗪与氟康唑联合应用时有效浓度配比氟康唑：氟桂利嗪＝1:16(μg/ml)。联合应用时氨氯地平与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：8μg/ml、1μg/ml；氟桂利嗪与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：16μg/ml、1μg/m。钙离子通道阻滞剂在临床上广泛应用，其对FLC抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低FLC的最低有效浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生。

权利要求

1.一种氨氯地平联合氟康唑的抗真菌产品，其特征在于，氨氯地平与氟康唑的有效浓度配比：氟康唑：氨氯地平＝1:8，联合应用时氨氯地平与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：8μg/ml、1μg/ml，所述真菌为耐药白色念珠菌。

2.一种氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品，其特征在于，氟桂利嗪与氟康唑的有效浓度配比氟康唑：氟桂利嗪＝ 1:16，联合应用时氟桂利嗪与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：

16μg/ml、1μg/m，所述真菌为耐药白色念珠菌。

3.如权利要求1或2所述的产品在制备用于抗真菌的药物中的应用，所述真菌为耐药白色念珠菌。

说明书

氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着免疫力低下人群(恶性肿瘤、艾滋病、自身免疫病等患者)的增多，导管插管和器官移植等技术的开展，广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，真菌感染的发病率急剧上升(Odds FC.Pathogenesis of Candida infections.J Am Acad Dermatol.1994,31:S2–S5)。研究表明，AIDS(艾滋病)患者晚期遭受的真菌感染，其分离菌超过三分之一表现出耐药现象，特别是对唑类药物，耐药率高达65％(Saltanat H,Li H,Geng XH et al.Clinical distribution and drug resistance of candida infection.Journal of Xingjiang Medical University 2008,31(8):1058-1060)。

[0003] 新药研究与联合用药研究均是解决真菌耐药的途径。新药研究周期长，成本高，而联合用药其前期投入少、效果显著，受到国内外的关注。联合用药研究包括两种抗真菌药联合和非抗真菌药与抗真菌药联合。由于抗真菌药物品种有限，且新的具有抗真菌作用的药物价格昂贵且副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。氟康唑(FLC)作为安全、有效、价格低廉的唑类抗真菌药物，临床应用非常广泛，同时也导致真菌耐药率不断上升。因此，非抗真菌药与FLC联合应用对抗耐药真菌的作用成为研究的热点。

[0004] 目前抗真菌的机制包括：抑制真菌细胞壁的合成；抑制真菌细胞膜主要成分麦角甾醇的合成以及直接作用于麦角甾醇的结构，作用于真菌核酸代谢等。除此之外，从其他方面寻找新的抗真菌途径也成为研究者们持续关注的热点。

[0005] 中国专利CN102626415A，公开了一种四环素类药物联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品。其内容为抗真菌类药物氟康唑与四环素类抗菌药物多西环素(DOX)、米诺环素(MINO)联合应用可以产生协同抗真菌作用，非选择性钙通道阻滞剂贝尼地平(BEN)、选择性L型钙通道阻滞剂硝苯地平(NIF)及钙离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对上述两种用药具有增效作用。上述专利研究发现BEN、NIF及EDTA均能够明显增强FLC与DOX/MINO对白色念珠菌的联合抗真菌作用，明显降低FLC、MINO和DOX联合用药时的最低有效浓度，增强FLC与DOX/MINO的联合作用，即三种药物联合对耐药白色念珠菌有显著的杀伤作用。另外，已用于临床的药物中，很多例子表明同类药物不一定都具有同样的作用。如青霉素类药物，品种繁多，但只有部分品种，如哌拉西林具有抗铜绿假单胞菌的作用，而大部分品种对此菌无作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是为了提供一种氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种氨氯地平或氟桂利嗪联合氟康唑的抗真菌产品，氨氯地平与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：氨氯地平＝1:8(μg/ml)；氟桂利嗪与氟康唑联合应用时有效浓度配比氟康唑：氟桂利嗪＝1:16(μg/ml)。

[0009] 联合应用时氨氯地平与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：8μg/ml、1μg/ml；氟桂利嗪与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：16μg/ml、1μg/m。

[0010] 结果表明，大于8μg/ml氨氯地平与大于1μg/ml的氟康唑联合应用均有效；大于16μg/ml氟桂利嗪与大于1μg/ml的氟康唑联合应用均有效。

[0011] 所述真菌为白色念珠菌。

[0012] 上述产品在抗真菌中的应用。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] 本发明定量评价了临床常用的钙离子阻滞剂(氨氯地平和氟桂利嗪)与FLC的联合抗真菌作用，分析了其对FLC的增敏效果，并进行了静态与动态的系统评价。

[0015] 本发明采用耐药白色念珠菌细胞进行研究，利用液体定量法，测定FLC与AML和FNZ联合用药时最低有效浓度，并以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用；本发明还采用时间-杀菌曲线法评价药物联用动态抗真菌作用。

[0016] 本发明为临床提供了联合用药作为治疗耐药真菌感染的治疗方案。另外，不同类型的钙通道阻滞剂对氟康唑的增效作用，揭示其协同作用机制可能与细胞内钙离子有关，为研究抗真菌药物作用的新靶点提供思路。

[0017] 本发明表明，FLC与AML或FNZ联用时，可以产生协同抗真菌作用。对氟康唑耐药的白色念珠菌菌株(MICFLC>512μg/ml)，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，8μg/ml的AML或16μg/ml的FNZ与1μg/ml FLC合用均可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。

[0018] 本发明表明，破坏细胞内钙平衡可能是联合抗真菌作用的机制，为新药的开发及老药新用提供可能的研究方向。

[0019] 本发明表明，钙离子通道阻滞剂在临床上广泛应用，其对FLC抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低FLC的最低有效浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生。

附图说明

[0020] 图1为氟康唑联合氨氯地平应用时的抗真菌时间-杀菌曲线；

[0021] 图2为氟康唑联合氟桂利嗪应用时的抗真菌时间-杀菌曲线。

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。

[0023] 实施例1  FLC与CCB联合抗真菌作用测定

[0024] 1.材料

[0025] 1.1 药品与试剂

[0026] 氟康唑(fluconazole，FLC)，山东诚创医药科技发展有限公司；

[0027] 氨氯地平(minocycline，AML)，美仑生物有限公司；

[0028] 氟桂利嗪(flunarizine hydrochloride，FNZ)，中国食品药品检定研究院；

[0029] 科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；

[0030] TTC-沙保罗琼脂，杭州天和微生物试剂有限公司；

[0031] 氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；

[0032] 磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132；

[0033] 二甲基亚砜(DMSO)，天津市广成化学试剂有限公司；

[0034] RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；

[0035] 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，济南朋远生物技术有限公司；

[0036] 甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；

[0037] XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；

[0038] 乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；

[0039] 丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；

[0040] XTT(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100ml已灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μl的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为1μmol/L，摇匀，2℃～8℃避光保存。

[0041] 药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，其他药物用二甲基亚砜溶解，分别配成2560μg/ml的储备液，过滤(0.22μm)分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

[0042] PBS(磷酸盐缓冲液)：用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的PBS磷酸盐缓冲剂(粉剂)，小包装一袋溶于1L蒸馏水中，即配成0.01M，PH7.4的PBS磷酸盐缓冲液，121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却备用。

[0043] RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)粉6.906g，加蒸馏水至200ml，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

[0044] 1.2 仪器

[0045]

[0046] 1.3 实验菌株

[0047] 质控菌株：白念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；

[0048] 实验菌株：省立医院、千佛山医院临床分离的白色念珠菌；

[0049] 菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色所有菌株，再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。

[0050] 菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24～48h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为4.5×106CFU/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

[0051] 2.内容与方法

[0052] 2.1 氟康唑与氨氯地平或氟桂利嗪的联合抗真菌作用测定

[0053] 2.1.1 微量稀释法

[0054] 根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选AML和FNZ或FLC浓度应用范围，即AML和FNZ的终浓度分别为32～0.5μg/ml，FLC为64～0.125μg/ml。按浓度从低到高的顺序吸取唑类药液50μl，分别加入96孔平板的第2～12列，按浓度从低到高的顺序吸取氨氯地平和氟桂利嗪药液50μl，分别加入96孔平板的第G～A行，除A12外各孔再分别加100μl菌液，其余不足200μl的孔用RPMI-1640培养液补足。
其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，A12为空白对照，只含药液不含菌液。将96孔平板置
35℃恒温培养箱中培养24h后，用XTT负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。

[0055] 2.1.2 时间-杀菌曲线法

[0056] 将浓度为2560μg/ml的氟康唑和氨氯地平、氟桂利嗪药物储备液以RPMI 1640液体培养基稀释成10倍工作浓度。

[0057] 取TTC-沙保罗琼脂培养基上传代两次的实验菌株(CA10)，挑取单个较大菌落，以PBS制成菌悬液，采用中国细菌浊度标准进行比浊，当标准管与样品管浓度一致时，菌液初始浓度约为4.5×106CFU/ml，以RPMI-1640稀释菌液为10倍工作浓度，并通过活菌计数法进行浓度验证。

[0058] 取上述制备的药液500μl加入到相应试管内，再加入RPMI 1640液体培养基至液体总体积为4.5ml；此时取按上述方法制备的菌液500μl加入到此4.5ml含(或不含)药物的培养基内，震荡混匀。本实验分为四组，即：生长对照组(不加药)、氨氯地平药物单用组、氟桂利嗪药物单用组、氟康唑单用组、氨氯地平和氟桂利嗪药物与氟康唑联合用药组，共10个体系。每个体系总体积为5ml，体系内氟康唑、氨氯地平和氟桂利嗪的终浓度分别为2μg/ml、8μg/ml和16μg/m，体系内菌液终浓度约为4.5×103CFU/ml。将制备完毕的体系于35℃静置培养，于药物作用的第0、6、12、24、48h的时间点取样测定。

[0059] 2.2 评价方法与结果判定

[0060] 2.2.1 LA理论

[0061] Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述如下：

[0062] ΣFIC＝FICA+FICB＝CA/MICA+CB/MICB

[0063] MICA和MICB分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，CA与CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI＞4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。

[0064] 2.2.1 XTT法(二甲氧唑黄比色法)

[0065] 在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上混匀，吸取100μl某体系内的菌悬液加入到96孔平底培养板内，在以100μl无菌RPMI 1640液体培养基为空白对照的情况下，再分别向每个加样后的孔内加入100μl配制好的XTT-甲萘醌溶液，培养板在35℃下避光培养2小时，酶标仪设置单孔空白，在492nm处测各孔的OD值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。

[0066] 3.结果

[0067] 3.1 氟康唑与非抗菌药物的联合抗真菌作用结果

[0068] 3.1.1 氟康唑与非抗菌药物联合的最低有效菌浓度

[0069] 各孔中真菌生长百分数的计算方法为：

[0070] 真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值

[0071] 按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点，如果真菌生长率不恰好等于20％，取与之最接近的药物联合孔为判读终点。

[0072] FLC与AML和FNZ的联合抗真菌作用，对敏感株来说不明显，多为无关，而对耐药株，则呈现强协同作用。其中耐药株CA10平板中的生长百分数实验结果如表1所示。

[0073] 表.1.用棋盘表示FLC与AML和FNZ的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

[0074]

[0075]

[0076]

[0077] 3.1.2 FICI法评价FLC/AML或FNZ的协同作用

[0078] 三次重复性实验所得结果见表2。由测定结果可见，AML或FNZ与FLC联合应用时，对耐药白色念珠菌的作用FICI均<0.5，呈现协同作用，其中FLC/AML的联用效果更好。而对敏感白色念珠菌的FICI值则在0.5和2之间，呈现无关作用。

[0079] 表2  以FICI法评FLC/AML或FNZ联合用药抗真菌作用

[0080]

[0081]

[0082] 3.1.3 时间杀菌曲线法评价FLC/AML或FNZ协同作用结果

[0083] 将各个时间点联合抗真菌作用的结果连接成曲线，可观察联合用药后的动态作用效果，如图1、2所示：在4.5×103的菌液中在6h之前加药组和对照组OD值的变化不大，与对照组相比，6h之后含有氟康唑的各组开始出现生长延迟，其中FLC/AML联用组处理的真菌生长延迟更明显。与氟康唑单用组相比，各联用组在作用24h对真菌的抑制效果最好，最终效果随着时间慢慢变弱。

[0084] 4.结论

[0085] 面对临床应用中抗真菌药物较少且出现耐药现象的现状，研制新型的抗真菌药物是解决这一问题的途径之一，同时通过联合用药的方式来增加真菌对药物的敏感性也是一种较好的选择。AML或FNZ作为临床常用心血管药物，其安全有效性已经得到广泛认可，其本身无抗真菌作用，但与FLC联用抗耐药白色念珠菌却能显著的降低FLC的MIC值，表现强协同作用。并且已有大量文献报道，钙信号传导系统在真菌耐药方面起着重要作用。作为钙通道阻滞剂的AML或FNZ与FLC的协同作用机制是否也与影响了钙信号传导有关，有待进一步研究。中国专利CN102626415A提到过钙通道阻滞剂硝苯地平和贝尼地平能够增强FLC与DOX/MINO的联合抗真菌作用。

[0086] 事实证明每一大类物质不一定都具有相同的作用，如头孢菌素类，一代头孢主要抗革兰氏阳性菌，三、四代头孢菌素主要抗革兰氏阴性菌，而只有部分的三代头孢品种与四代头孢才具有抗铜绿假单胞菌的作用；同理，也不能推断所有钙通道阻滞剂与FLC都具有联合抗真菌作用。中国专利CN102626415A,定性筛选时发现BEN、NIF及EDTA与FLC也有一定的联合抗真菌作用，但未进行系统定量评价。此次，我们定量评价了前期未试验过的两种钙拮抗剂(AML和FNZ)与FLC的联合作用。结果表明，虽然AML和FNZ与FLC都有联合抗真菌作用，但当联用的AML和FNZ浓度同时为8μg/ml时，分别能使FLC的浓度从MIC＞512μg/ml降到联用时的1μg/ml和32μg/ml，即8μg/ml的AML能使FLC变成敏感，而FNZ则只能使其变成中介。因此，从一种钙通道阻滞剂与FLC联合抗真菌作用并不能推断所有的钙通道阻滞剂均有相同的FLC增效作用。

[0087] 上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。