用于检测活性氧的经修饰的结合核酸的花青染料转让专利
申请号 : CN201380017402.6
文献号 : CN104395407B
文献日 : 2016-07-13
发明人 : 胡义镇 , 陈爱梅 , H.C.康 , K.吉 , B.曼达维利
申请人 : 生命科技公司
摘要 :
本文中公开了用于通过常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法来检测活性氧(ROS)的化合物、组合物、方法和试剂盒。本文中公开的化合物是新的还原的结合核酸的花青染料，所述染料是用于在体外和/或在体内在细胞中检测ROS和测量氧化性应激的探针。本文还描述了用于制备用在公开的组合物、方法和试剂盒中的新还原染料(即，ROS探针)的方法。
权利要求 :
1.一种具有结构式(I)的还原染料化合物：其中
每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中杂原子是O、N或S；或者R8和R9组合形成-(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR10，其中R10是H或C1-C6烷基；
t是1、2、3或4；
R2是饱和的或不饱和的C1-C6烷基；
X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，独立地为H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳组合形成5或6元饱和环；
Q具有式Q2：
其中
Y是-CR3＝CR4-；
p和m是0或1，使得p+m＝1；
R5是C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；或OMEGA；
R3和R4可以相同或不同，各自独立地为：H；卤素；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR8；-SR8；-(NR8R9)，如前面所定义；-OSO2R19，其中R19是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；
R11、R12、R13和R14可以相同或不同，各自独立地为：H；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；卤素；OMEGA；或-OH、-OR8、-SR8或-(NR8R9)，如前面所定义；
OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
W是处于R或S构型的H或D；且
n是0、1、2或3。
2.一种具有结构式(II)的还原染料化合物:其中
每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂
8 9
芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中杂原子是O、N或S；或者R和R 组合形成-(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR10，其中R10是H或C1-C6烷基；
t是1、2、3或4；
R2是饱和的或不饱和的C1-C6烷基；
5
R是：具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；或OMEGA；
R3、R4、R11、R12、R13和R14各自独立地是：H；卤素；具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；-OR8；-SR8；-(NR8R9)，如前面所定义；-OSO2R19，其中R19是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；
OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，独立地为H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳组合形成5或6元饱和环；
R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
W是处于R或S构型的H或D；且
n是0、1、2或3。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(VIII)：其中W是H或D，且n是0、1或2。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(IX)：其中W是H或D，且n是0、1或2。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(X)：其中W是H或D，且n是0、1或2。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(XI)：其中W是H或D，且n是0、1或2。
7.根据权利要求2所述的化合物，其中：
R2是甲基或乙基；
R4是C1-C6烷基；
R5是苯基；
X是S；且
n是0。
8.一种还原染料化合物，其选自：
(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2,3-二氢苯并[d]噻唑；
(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2-氘-3-氢苯并[d]噻唑；
(Z)-3-甲基-2-((1-丙基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-2,3-二氢苯并[d]噻唑；
(Z)-2-((2-甲氧基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2,3-二氢苯并[d]噻唑；
(Z)-N1,N1-二甲基-N3-(4-((3-甲基-2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚甲基)-1-苯基-
1,4-二氢喹啉-2-基)-N3-丙基丙烷-1,3-二胺；
N-乙基-N-(4-((Z)-4-((E)-3-(2-甲基-2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚丙烯基)-1-苯基-1,4-二氢喹啉-2-基)苄基)乙胺；和N-乙基-N-(4-((Z)-1-甲基-4-((E)-3-(3-甲基-2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚丙烯基)-1,4-二氢喹啉-2-基)苄基)乙胺。
9.一种用于检测活性氧(ROS)的组合物，所述组合物包含：a)一种或多种还原染料；和
b)载体，
其中所述还原染料是根据权利要求1-8中的任一项所述的化合物，且以在与ROS反应后有效地检测ROS的存在的量存在。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物适合用于体外应用。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物适合用于体内应用。
12.一种或多种根据权利要求1-8中的任一项所述的还原染料化合物用于制备用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒的用途，包括下述步骤：a)使所述样品与有效量的一种或多种根据权利要求1-8中的任一项所述的还原染料化合物接触；和b)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化。
13.权利要求9所述的组合物用于制备用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒的用途，包括下述步骤：a)使所述样品与有效量的根据权利要求9所述的组合物接触；和b)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述样品包括细胞、组织、生物流体或其组合。
15.根据权利要求12或13所述的用途，其中通过荧光光谱法检测所述还原染料化合物的氧化。
16.根据权利要求12或13所述的用途，其中通过荧光显微术检测所述还原染料化合物的氧化。
17.根据权利要求12或13所述的用途，其中通过共焦激光扫描荧光显微术检测所述还原染料化合物的氧化。
18.根据权利要求12或13所述的用途，其中通过全内部反射荧光显微术检测所述还原染料化合物的氧化。
19.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述活性氧(ROS)的检测用于诊断选自以下的疾病或障碍：颈动脉损伤、动脉粥样硬化、高血压、癌症、以炎症为特征的疾病和障碍、辐射诱导的晚期正常组织损伤；由化疗引起的组织损伤、缺血或移植后的再灌注；糖尿病，神经变性疾病；脑血管疾病、囊性纤维化、慢性肾脏疾病、心血管疾病、先兆子痫、眼科疾病、及其组合。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述糖尿病为I型糖尿病(TlD)。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述神经变性疾病为阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或亨廷顿病。
22.一种用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：a)一种或多种根据权利要求1-8中的任一项所述的还原染料化合物；和b)一个或多个容器。
23.一种用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：a)根据权利要求9所述的组合物；和
b)一个或多个容器。
24.根据权利要求22或23所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含关于执行测定的说明书，所述测定用于检测一种或多种活性氧(ROS)。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述测定在体内或在体外进行。
26.一种用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：a)一种或多种具有结构式(III)的未反应的花青染料化合物：b)一种或多种还原剂；和
c)一个或多个容器；
其中R1、R2、R20、R21、R22、Q、X、n和t如在权利要求1中所定义。
27.一种用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：a)一种或多种具有结构式(IV)的未反应的花青染料化合物：b)一种或多种还原剂；和
c)一个或多个容器；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R11、R12、R13、R14、R20、R21、R22、X、t和n如在权利要求2中所定义。
28.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含关于执行测定的说明书，所述测定用于检测一种或多种活性氧(ROS)。
29.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含关于制备一种或多种还原染料化合物的说明书。
30.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述一种或多种还原剂选自：LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、NaD、LiAlD4、NaBD4、Zn(BD4)2、含有Sn2+离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖
2+
醇(DTT)和含有Fe 离子的化合物。
31.一种用于制备具有结构式(I)的还原染料化合物的方法，所述方法包括：
a)使具有结构式(III)的花青化合物与还原剂反应，其中：
Q、W、X、R1、R2、R20、R21、R22、n和t如在权利要求1中所定义。
32.一种用于制备具有结构式(II)的还原染料化合物的方法：所述方法包括：
a)使具有结构式(IV)的花青化合物与还原剂反应，其中：
W、X、R1、R2、R3、R4、R5、R11、R12、R13、R14、R20、R21、R22、n和t如在权利要求2中所定义。
33.根据权利要求32所述的方法，其中：
X是S或O；
R2是甲基或乙基；
R4是C1-C6烷基；
R5是苯基；且
n是0。
34.根据权利要求31-33中的任一项所述的方法，其中所述还原剂选自：LiAlH4、NaBH4、
2+
Zn(BH4)2、LiAlD4、NaBD4、Zn(BD4)2、含有Sn 离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。
35.根据权利要求31-33中的任一项所述的方法，其中所述还原剂是NaBH4或NaBD4。
说明书 :
用于检测活性氧的经修饰的结合核酸的花青染料
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月30日提交的美国临时申请系列号61/617,862的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及可用于检测活性氧(ROS)的探针，特别是还原的结合核酸的花青染料探针，以及这样的探针在体外或在体内的用途。
背景技术
[0004] 氧化性应激源于活性氧(ROS)的产生和细胞的清除这样的自由基的能力之间的失衡。氧化性应激可以由许多不同的固有和非固有途径造成，由线粒体呼吸或者由膜结合的NADPH氧化酶介导。ROS在几种疾病的进展中起重要作用，所述疾病包括、但不限于炎症、动脉粥样硬化、老化和年龄相关的变性障碍。可以检测血清样品、活组织外植体、细胞培养物中和体内的ROS的探针具有用于医学诊断和研究工具的潜在用途，用于诊断以ROS产生增加为特征的疾病。
[0005] 成像术会实现在相同细胞中对与细胞毒性和细胞死亡相关的不同参数的多路分析、定位和定量。因此，通过常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法来检测ROS，相对于其它技术而言可能是有利的。超氧化物和羟基自由基诸如二氢乙啶(DHE)的荧光传感器已经被用作ROS探针。但是，由于其自发性自氧化、快速光漂白、高毒性和与ROS的多种反应产物，DHE具有有限的适用性。此外，DHE的较低发射波长使得它的体内应用是有问题的。二氢罗丹明(DHR)是已经被研究用于检测ROS的另一种还原染料，其遭受高氧化速率，由此限制了它的应用。迄今开发的作为ROS探针的还原花青染料(其基于Cy3/Cy5/Cy7)在不同程度上遭受溶解度问题和/或自氧化。基于磺酸酯的染料也已经被研究用作ROS探针。这些探针(通常需要费时且昂贵的多步合成规程)会经历快速水解，由此限制了它们的应用。
[0006] 因而，需要用于检测ROS的探针，其适合用于体外或体内应用，其不会遭受现有技术ROS探针的限制，诸如它们的发生由氧和/或光催化的自发性自氧化并伴随产生高水平的背景荧光的趋势。
发明内容
[0007] 本文描述了通过例如常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法来检测活性氧(ROS)的还原染料化合物、组合物、方法和试剂盒。本文中公开的还原染料化合物是新的还原的结合核酸的花青染料，所述染料是用于在体外或在体内在细胞中检测ROS和测量氧化性应激的探针。这些探针可以与其它活细胞染料一起用于多路应用中，使得它们可用于测量细胞毒性和细胞死亡的多种生物标志物，且可以用于评价由不同试剂在多种活细胞模型中产生的ROS，所述试剂包括、但不限于脂多糖、甲萘醌、血管紧张素II、奈法唑酮、离子霉素和谷氨酸盐。
[0008] 与对应的氧化染料相比，本文中公开的还原的结合核酸的花青染料(其通常是膜可透过的且因此可以在细胞中积累)不能结合核酸并且几乎不表现出或根本不表现出荧光。在与ROS发生细胞内反应(即，检测ROS)以后，本文中公开的还原染料被氧化，由此提供以高亲和力结合核酸的花青染料，其在暴露于足够波长的光以后具有显著的荧光强度。图1显示了使用噻唑橙(TO)作为一个例子，用还原的结合核酸的花青染料进行细胞内ROS检测的示意图。还原的噻唑橙(还原的TO)跨过细胞膜以进入细胞，在此处它可以被ROS氧化以释放以高亲和力结合核酸的染料(TO)并发射亮绿色荧光。与例如针对线粒体膜电位、质膜渗透性和/或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的探针组合的本文中公开的还原染料也可以用于区分肝毒性化合物与无毒化合物。本文还描述了制备用在本发明的公开的组合物、方法和试剂盒中的新还原染料(即ROS探针)的方法。
[0009] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(I)的新还原染料化合物(即，ROS探针)：
[0010]
[0011] 其中
[0012] 每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中杂原子是O、N或S；或者R8和R9组合形成-(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR10，其中R10是H或C1-C6烷基；
[0013] t是1、2、3或4；
[0014] R2是被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
[0015] X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，独立地为H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳组合形成5或6元饱和环；
[0016] Q具有式Q1或Q2：
[0017] 或者
[0018]
[0019] 其中
[0020] Y是-CR3＝CR4-；
[0021] p和m是0或1，使得p+m＝1；
[0022] R5是C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；或OMEGA；
[0023] R3、R4、R6和R7可以相同或不同，各自独立地为：H；卤素；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C68 8 8 9 19 19
多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR ；-SR ；-(NRR )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；或R6和R7组合形成-(CH2)v-，其中v是3或4，或者R6和R7形成根据式Q2的稠合芳族环；
多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR ；-SR ；-(NRR )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；或R6和R7组合形成-(CH2)v-，其中v是3或4，或者R6和R7形成根据式Q2的稠合芳族环；
[0024] R11、R12、R13和R14可以相同或不同，各自独立地为：H；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；卤素；OMEGA；或-OH、-OR8、-SR8或-(NR8R9)，如前面所定义；
[0025] OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
[0026] R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
[0027] W是处于R或S构型的H或D；且
[0028] n是0、1、2或3。
[0029] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(II)的新还原染料化合物(即，ROS探针)：
[0030]
[0031] 其中
[0032] 每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中所述杂原子是O、N或S；或者R8和R9组合形成-(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR10，其中R10是H或C1-C6烷基；
[0033] t是1、2、3或4；
[0034] R2是被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
[0035] R5是：具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；或OMEGA；
[0036] R3、R4、R11、R12、R13和R14各自独立地是：H；卤素；具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、8 8 8 9 19 19
炔基或多炔基；-OR ；-SR ；-(NR R )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；
炔基或多炔基；-OR ；-SR ；-(NR R )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；
[0037] OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
[0038] X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，独立地为H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳组合形成5或6元饱和环；
[0039] R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
[0040] W是处于R或S构型的H或D；且
[0041] n是0、1、2或3。
[0042] 在某些实施方案中，提供了用于检测活性氧(ROS)的组合物，所述组合物包含：
[0043] a)本文描述的还原染料化合物中的一种或多种；和
[0044] b)载体，
[0045] 其中所述还原染料化合物以在与ROS反应后有效地检测ROS的存在的量存在。
[0046] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的方法，所述方法包括下述步骤：
[0047] a)使所述样品与有效量的本文描述的还原染料化合物中的一种或多种或本文描述的组合物接触；和
[0048] b)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化。
[0049] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0050] a)本文描述的还原染料化合物中的一种或多种或本文描述的组合物；和
[0051] b)一个或多个容器。
[0052] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0053] a)本文描述的未还原的花青化合物(例如，具有结构式(III)或(IV)的化合物)中的一种或多种；
[0054] b)一种或多种还原剂；和
[0055] c)一个或多个容器。
[0056] 在某些实施方案中，本文提供的试剂盒还包含关于执行测定的说明书，所述测定用于检测样品中的一种或多种ROS。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒适合与体外测定一起使用。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒适合与体内测定一起使用。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒还包含关于制备一种或多种还原染料化合物的说明书。
[0057] 在某些实施方案中，提供了用于制备结构式(I)的还原染料化合物(即，ROS探针)的方法：
[0058]
[0059] 所述方法包括：
[0060] a)使具有结构式(III)的花青化合物与还原剂反应，
[0061]
[0062] 其中：
[0063] Q、W、X、R1、R2、R20、R21、R22、n和t如前文中所定义。
[0064] 在某些实施方案中，提供了用于制备具有结构式(II)的还原染料化合物(即，ROS探针)的方法：
[0065]
[0066] 所述方法包括：
[0067] a)使具有结构式(IV)的花青化合物与还原剂反应，
[0068]
[0069] 其中：
[0070] W、X、R1、R2、R3、R4、R5、R11、R12、R13、R14、R20、R21、R22、n和t如前文中所定义。
[0071] 从下述详细描述会明白本发明的其它实施方案和示例性方面、特征和优点。但是，应当理解，以下的详细描述和具体实施例尽管指示本发明的优选实施方案，但是仅仅作为例证来给出。预见到，本领域技术人员会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
[0072] 图1显示了使用噻唑橙(TO)作为一个例子，用还原的结合核酸的花青染料进行细胞内ROS检测的示意图。
[0073] 图2显示了根据本教导的某些实施方案，使用5μM化合物1检测人骨肉瘤细胞(U2-OS细胞)中的、甲萘醌诱导的ROS形成。
[0074] 图3显示了根据本教导的某些实施方案，使用5μM化合物1检测人主动脉平滑肌(HASM)细胞中的氧化性应激。
[0075] 图4显示了根据本教导的某些实施方案，使用化合物1定量检测牛肺动脉内皮(BPAE)细胞中的、甲萘醌诱导的氧化性应激。
[0076] 图5显示了根据本教导的某些实施方案，使用5μM化合物1，人骨肉瘤(U2-OS细胞)中对甲醛固定和去污剂透化的抗性。
[0077] 图6A和6B显示了根据本教导的某些实施方案，使用5μM化合物1检测Jurkat细胞中的A)叔丁基过氧化氢(TBHP)诱导的或B)甲萘醌诱导的氧化性应激。
[0078] 图7显示了在用叔丁基过氧化氢(TBHP)处理的培养物中，用化合物1对Jurkat细胞的染色。
[0079] 图8显示了使用化合物1时TBHP在Jurkat细胞中的剂量依赖性的ROS产生不需要进行染色后洗涤步骤即可使用Jurkat细胞显影(图A：对照，图B：200μM TBHP处理)。
[0080] 图9显示了在完全培养基(图A)相对于含有蛋白的缓冲液(图B)中，使用化合物1时TBHP在Jurkat细胞中的剂量依赖性的ROS产生。
具体实施方式
[0081] 本文中公开了用于通过常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法检测活性氧(ROS)的还原染料化合物、组合物、方法和试剂盒。本文中公开的还原染料化合物是新的还原的结合核酸的染料，所述染料是用于在体外或在体内在细胞中检测ROS和测量氧化性应激的探针。本文还提供了制备用在本文描述的组合物、方法和试剂盒中的、本文中公开的还原染料(即，ROS探针)的方法。
[0082] 本文中公开的还原染料化合物表现出增强的对自氧化的稳定性，具有可调节的发射波长、和纳摩尔至毫摩尔的对ROS的敏感性。令人意外的是，不象其它现有技术ROS探针，本文中公开的还原染料化合物还表现出对甲醛固定和去污剂透化的抗性。另外，不象其它现有技术ROS探针，本文中公开的还原染料化合物可以用在更生理性的条件下，诸如在完全培养基中。此外，当使用本文中公开的还原染料化合物时，不需要染色后洗涤步骤，而其它现有技术ROS探针具有这样的需要。
[0083] 定义：
[0084] 为了更清楚和简明地描述和指出本公开内容的主题，为特定术语提供以下定义，所述术语用在以下描述和所附权利要求中。贯穿本说明书，特定术语的举例说明应当视作非限制性例子。
[0085] 在详细描述本教导之前，应当理解，本公开内容不限于特定组合物或方法步骤，因为这些可以变化。应当指出，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，提及的“一种还原染料”包括多种染料，提及的“一个细胞”包括多个细胞等。短语“和/或”表示简写方式，其指示可替换地单独地和组合地预见到特定的组合。为了解释目的，但是不作为限制，“X和/或Y”可以是指“X”或“Y”、或“X”和“Y”。
[0086] 应当理解，在本公开内容中讨论的温度、浓度、时间等之前存在隐含的“约”，使得微小和非实质性的偏差是在本文中的本教导的范围内。并且，“包含”、“包括”、“含有”、“包含有”、“包括”和“包括有”的使用无意是限制性的。应当理解，前述一般描述和详细描述仅仅是示例性的和解释性的，而不限制教导。
[0087] 除非在上面的说明书中明确指出，否则上面说明书中引述“包含”各种组分的实施方案也被理解为“由所引述的组分组成”或“基本上由所引述的组分组成”；说明书中引述“由各种组分组成”的实施方案也被理解为“包含”所引述的组分或“基本上由所引述的组分组成”；说明书中引述“基本上由各种组分组成”的实施方案也被理解为“由所引述的组分组成”或“包含”所引述的组分(该可互换性不应用于这些术语在权利要求中的使用)。
[0088] 本文中使用的术语“或其组合”表示在该术语之前列出的术语的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，且如果次序在特定上下文中是重要的话，也包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续以本例子为例，明确地包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB、诸如此类。技术人员会理解，关于任意组合中的项目或术语的数目通常没有限制，除非从上下文中另外显而易见。
[0089] 在本文中使用的段落标题仅仅用于组织目的，不应解释为以任何方式限制期望的主题。在本说明书中引用的所有文献(包括、但不限于，专利、专利申请、文章、书籍和论文)明确地通过引用整体并入用于任意目的。在任意并入的文献与在本说明书中定义的任意术语矛盾的情况下，以本说明书为准。尽管结合不同实施方案描述了本教导，无意将本教导限于这样的实施方案。相反，本教导包括本领域技术人员会明白的不同替代方案、改进方案和等同方案。
[0090] 除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容相关领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。为了如本文中所述的教导的目的，定义以下术语。
[0091] 本文中使用的“还原染料”或“还原染料化合物”表示这样的染料分子，其中一个或多个π-键已经被还原，从而破坏扩展的π共轭，产生表现出可忽略的荧光或无荧光的分子。
[0092] 本文中使用的“结合核酸的花青染料”表示，能够结合核酸以形成荧光染料-核酸复合物的花青染料。结合核酸的染料本身通常是非荧光的或弱荧光的，但是在结合核酸以后变成强荧光的。
[0093] 本文中使用的“花青染料”表示闭链花青染料，即具有为环状部分的末端基团的花青染料，其中所述环状部分可以为芳族的或非芳族的且在一个或多个位置被取代或未被取代。
[0094] 本文中使用的“还原染料”、“还原的花青染料”、“氢花青”和“氘花青”可互换地且通常地表示，其中亚铵阳离子已经被还原的花青染料。本文中使用的“氘花青”表示这样的花青染料：其已经被氘化还原剂还原，因此将氘包含在还原的分子中。以下显示还原的亚铵阳离子的例子：
[0095]
[0096] 其中R1、R2、X和t如前文中所定义。
[0097] 本文中使用的“活性氧”和“ROS”可互换地表示含有氧离子、自由基、过氧化物或其组合的分子或离子。活性氧可以是有机的或无机的。活性氧的例子包括、但不限于：超氧化物；自由基，诸如羟基自由基和过氧化基；过氧化物、单态氧、臭氧、一氧化氮；阴离子，诸如羟基阴离子和超氧化物阴离子；次氯酸；和过氧亚硝酸盐以及任何这样的活性氧的组合。
[0098] 本文中使用的“还原剂”表示，能够将氢或氘贡献给其它分子的化合物。还原剂的2+
例子包括、但不限于：金属盐诸如LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、含有Sn 离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。这些中的任一种可以具有被氘替代的氢，例如，NaBD4、LiAlD4、Zn(BD4)2等。
例子包括、但不限于：金属盐诸如LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、含有Sn 离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。这些中的任一种可以具有被氘替代的氢，例如，NaBD4、LiAlD4、Zn(BD4)2等。
[0099] 本文中使用的“膜可透过的”表示，可通过被动扩散进入细胞的分子。
[0100] 本文中使用的“烷基芳基”表示被芳基取代的烷基(例如，芳族基团或杂芳族基团)。
[0101] 本文中使用的“烷基”表示这样的烃：其任选地是直链的或支链的，且可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的。类似地，全氟烷基、烷氧基、烷硫基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰氨基的烷基部分任选地是直链的或支链的，且可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的。另外，本文中使用的术语“烷基”进一步包括在烃链片段的一个或多个碳原子处的一个或多个取代。
[0102] 本文中使用的“芳基”表示具有单环或多个稠合环的芳族部分，其中每个环任选地和独立地被以下基团取代：H、卤素、氰基、叠氮基、磺酸、磺酸的碱或铵盐、羧酸、羧酸的生物学上相容的盐、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰氨基。
[0103] 本文中使用的“杂芳基”表示，任选地与一个额外6元芳族环或与一个5或6元杂芳族环稠合的5或6元芳族杂环，所述杂芳族环含有1-3个选自O、N和S的杂原子(以任何组合)。任何杂芳基取代基通过单键连接，并任选地和独立地被H、卤素、具有1-6个碳的烷基或具有
1-6个碳的烷氧基取代一次或多次。杂芳基取代基的选定例子为吡咯、噻吩或呋喃(单个环、单个杂原子)、噁唑、异噁唑、噁二唑或咪唑(单个环、多个杂原子)。多环杂芳基的例子包括苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑(多个环、多个杂原子)、苯并呋喃或吲哚(多个环、单个杂原子)。
1-6个碳的烷氧基取代一次或多次。杂芳基取代基的选定例子为吡咯、噻吩或呋喃(单个环、单个杂原子)、噁唑、异噁唑、噁二唑或咪唑(单个环、多个杂原子)。多环杂芳基的例子包括苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑(多个环、多个杂原子)、苯并呋喃或吲哚(多个环、单个杂原子)。
[0104] 本文中使用的“药学上可接受的盐”、“生物学上相容的盐”或“生物学上相容的抗衡离子”是原样使用时无毒且对生物分子不具有实质有害作用的抗衡离子。这样的盐或抗+ + + + ++ ++ - - - -衡离子的例子尤其包括K 、Na 、Cs、Li、Ca 、Mg 、Cl 、Br、I、AcO、硫酸盐、烷烃磺酸盐、芳基磺酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、四芳基硼化物、硝酸盐、烷基铵或烷氧基铵盐和芳族或脂族羧酸的阴离子。优选的抗衡离子是氯化物、碘化物、高氯酸盐和各种磺酸盐。
[0105] 本文中使用的“烷氧基”表示基团-O-烷基，其中烷基在本文中定义。烷氧基包括、例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。
[0106] 本文中使用的“烯基”表示具有2-22个碳原子、优选2-4个碳原子且具有至少1个、优选1-2个烯基不饱和位点的烯基。这样的基团的例子是，例如，乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基。
[0107] 本文中使用的“烯氧基”表示基团-O-烯基，其中烯基在本文中定义。烯氧基包括、例如，乙烯氧基、烯丙氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、2-戊烯氧基、3-戊烯氧基、4-戊烯氧基。
[0108] 本文中使用的“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”表示具有单个环或多个稠合环的饱和或不饱和基团，包括稠合的桥接和螺接环系统，所述环内具有1-10个碳原子和1-4个选自氮、硫或氧的杂原子，其中，在稠合的环系统中，一个或多个环可以为环烷基、芳基或杂芳基，前提条件是，连接点是通过非芳族环。在一个实施方案中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化以提供N-氧化物、亚磺酰基、磺酰基部分。
[0109] 本文中使用的“OMEGA”表示饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子(其中杂原子是O、N或S)，其通过单键直接键合至吡啶鎓或喹啉鎓环系统。作为脂环族环系统的OMEGA可以是连接的或稠合的。OMEGA的例子是被取代的或未被取代的环己基、环己烯基、吗啉基和哌啶基。芳族OMEGA的例子包括被取代的或未被取代的萘基、苯基、噻吩基、苯并噻唑基、呋喃基、噁唑基、苯并噁唑基和吡啶基。在OMEGA上的取代基独立地为：氢、卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，各自具有1-6个碳的烷基。OMEGA的优选实施方案是被取代的或未被取代的萘基、苯基、噻吩基、吗啉基和环己基，更优选被取代的或未被取代的苯基。
[0110] 本文中使用的“磺基”表示磺酸或磺酸盐。
[0111] 本文中使用的“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
[0112] 本文中使用的“ROS探针”、“ROS染料”和“ROS传感器”可互换地表示本文中公开的新还原染料化合物，所述化合物是用于在体外或在体内在细胞中检测活性氧(ROS)和测量氧化性应激的探针。
[0113] 本文中使用的术语“染料”表示这样的化合物：其发射光以产生可观察的可检测信号。
[0114] 本文中公开的还原染料化合物可以以未溶剂合形式以及溶剂合形式(包括水合形式)存在。这些还原染料化合物可以以多种结晶形式或无定形形式存在。一般而言，所有物理形式对于本文描述的用途而言是等效的，并且意欲落入本发明范围内。本文中公开的还原染料化合物可以具有不对称碳原子(即手性中心)或双键；本文描述的还原染料化合物的外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单一异构体落入本发明范围内。可以将本文描述的还原染料化合物制备为单一异构体或异构体的混合物。
[0115] 在通过它们的从左至右书写的常规化学式指定取代基的情况下，它们同样包括从右至左书写该结构而产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-意图也描述-OCH2-。
[0116] 应该理解，用于定义本发明的还原染料化合物的化学结构各自是每种给定的结构可以代表的可能共振结构之一的表现。此外，应该理解，通过定义，共振结构仅仅是本领域技术人员用于表示电子离域的图解表示，并且本发明绝不受显示任何给定结构的一种特定共振结构所限制。
[0117] 在公开的还原染料化合物包括共轭环系统的情况下，共振稳定可以允许形式上的电子电荷分布在整个分子上。尽管可以将特定电荷描述为位于特定环系统或特定杂原子上，通常理解，可以绘制可比较的共振结构，其中电荷可以在形式上位于化合物的替代部分上。例如，
[0118]
[0119] 还原染料化合物和组合物：
[0120] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(I)的新还原染料化合物(即，ROS探针)：
[0121]
[0122] 其中
[0123] 每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中杂原子是O、N或S；或者R8和R9组合形成-10 10
(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR ，其中R 是H或C1-C6烷基；
(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR ，其中R 是H或C1-C6烷基；
[0124] t是1、2、3或4；
[0125] R2是被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
[0126] X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，16 17
独立地为H或C1-C6烷基，或者R 和R 的碳组合形成5或6元饱和环；
独立地为H或C1-C6烷基，或者R 和R 的碳组合形成5或6元饱和环；
[0127] Q具有式Q1或Q2：
[0128] 或者
[0129]
[0130] 其中
[0131] Y是-CR3＝CR4-；
[0132] p和m是0或1，使得p+m＝1；
[0133] R5是C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；或OMEGA；
[0134] R3、R4、R6和R7可以相同或不同，各自独立地为：H；卤素；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C68 8 8 9 19 19
多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR ；-SR ；-(NRR )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；或R6和R7组合形成-(CH2)v-，其中v是3或4，或R6和R7形成根据式Q2的稠合芳族环；
多烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR ；-SR ；-(NRR )，如前面所定义；-OSO2R ，其中R 是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；或R6和R7组合形成-(CH2)v-，其中v是3或4，或R6和R7形成根据式Q2的稠合芳族环；
[0135] R11、R12、R13和R14可以相同或不同，各自独立地为：H；C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6多8 8 8 9
烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；卤素；OMEGA；或-OH、-OR；-SR；-(NRR )，如前面所定义；
烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；卤素；OMEGA；或-OH、-OR；-SR；-(NRR )，如前面所定义；
[0136] OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
[0137] R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
[0138] W是处于R或S构型的H或D；且
[0139] n是0、1、2或3。
[0140] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(II)的新还原染料化合物(即，ROS探针)：
[0141]
[0142] 其中
[0143] 每个R1可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；三氟甲基；卤素；-OR8、-SR8或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，独立地为：H；C1-C6烷基；或1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环，其具有共计3-16个环原子，其中杂原子是O、N或S；或者R8和R9组合形成-10 10
(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR ，其中R 是H或C1-C6烷基；
(CH2)2-L-(CH2)2-，其中L是：单键；-CH2-；-O-；或-NR ，其中R 是H或C1-C6烷基；
[0144] t是1、2、3或4；
[0145] R2是被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
[0146] R5是：具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；或OMEGA；
[0147] R3、R4、R11、R12、R13和R14各自独立地是：H；卤素；具有1-6个碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；-OR8；-SR8；-(NR8R9)，如前面所定义；-OSO2R19，其中R19是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA；
[0148] OMEGA是饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的环状取代基，所述环状取代基具有在1-2个脂环族、杂脂环族、芳族或杂芳族环中的共计2-16个环碳原子，含有1-4个杂原子，其中所述杂原子是O、N或S，所述环状取代基是未被取代的或任选地被以下取代基独立地取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，和所述环状取代基作为R3、R4、R5、R11、R12、R13或R14通过单键来连接，并且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R13和R14中的超过一个是OMEGA，每个OMEGA任选地相同或不同；
[0149] X是O；S；Se；NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或CR16R17，其中R16和R17可以相同或不同，独立地为H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳组合形成5或6元饱和环；
[0150] R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基；
[0151] W是处于R或S构型的H或D；且
[0152] n是0、1、2或3。
[0153] 在某些实施方案中，本文中提供的还原染料化合物包含选自以下的OMEGA：被取代的或未被取代的萘基、苯基、噻吩基、吗啉代和环己基，更优选地被取代的或未被取代的苯基。在一个示例性实施方案中，R5是OMEGA。
[0154] 在其它实施方案中，尽管在苯并噁唑鎓(benzazolium)环系统上的R1经常是H，但是可以使用非氢取代基R1的掺入来细调得到的染料的吸收和发射谱。在其它实施方案中，1
本文中公开的还原染料化合物含有不超过一个非氢取代基R。
本文中公开的还原染料化合物含有不超过一个非氢取代基R。
[0155] 在本文提供的还原染料化合物的其它实施方案中，取代基R2可以是C1-C6烷基，优选甲基或乙基，更优选甲基。在其它实施方案中，所述取代基R2可以是被取代的C1-C6烷基，优选被一个或多个芳基、铵基或三烷基铵基取代。
[0156] 次甲基桥由1、3或5个次甲基(-CR＝)基团组成，所述次甲基以允许广泛电子离域的方式桥连分子的苯并噁唑鎓(benzazolium)部分和吡啶鎓部分。当n＝0时，所述染料是通常染上绿色荧光的非对称的单次甲基染料；当n＝1时，所述染料是通常染上红色荧光的三次甲基染料；当n＝2时，所述染料是通常染上不可见的近红外荧光的五次甲基染料。在杂环系统上的额外非氢取代基可以进一步影响染料的光谱性能。
[0157] 次甲基取代基R20、R21和R22独立地为：H、C1-C6烷基、C3-C10环烷基、芳基或杂芳基，在n＝1或2的情况下，每个R21和R22独立地变化。在某些实施方案中，仅在次甲基桥的中央碳上的取代基是非氢的(在n＝0时，R20；在n＝1时，R21；和在n＝2时，位于中央的R22)。在某些实施方案中，在次甲基取代基是非氢的情况下，它是烷基。在某些实施方案中，在次甲基取代基是非氢的情况下，它是芳基。通常，R20、R21和R22是氢。在R20、R21和R22是非氢的情况下，优选地n＝1。
[0158] 在某些实施方案中，所述吡啶鎓或喹啉鎓环系统含有作为-CR3＝CR4-的环片段Y，其中下标p和m等于0或1，使得p+m＝1。在某些实施方案中，所述环含有根据结构(V)或(VI)的基于6元吡啶鎓的杂环：
[0159]
[0160] 或者
[0161]
[0162] 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R20、R21、R22、X、W、n和t如前文中所定义。在优选的实施方案中，m＝1和p＝0(4-吡啶鎓，结构(VI))。
[0163] 在某些实施方案中，在第二个杂环系统上的取代基R3、R4、R6和R7各自独立地是：H、卤素、烷基或-OR8、-SR8、-(NR8R9)，其中R8和R9是甲基或乙基；或OMEGA；或R6和R7组合形成稠合的6元芳族环。在某些实施方案中，R4可以是C1-C6烷基。在R6和R7组合形成稠合的6元芳族环的其它实施方案中，喹啉鎓衍生物含有根据结构(VII)的稠合芳族环：
[0164]
[0165] 其中R1、R2、R5、R11、R12、R13、R14、R20、R21、R22、W、X、Y、m、n、p和t如前文中所定义。
[0166] 在某些示例性实施方案中，所述还原的花青染料化合物是喹啉鎓，其中m＝1和p＝0(4-喹啉鎓，结构(VI))。在某些实施方案中，所述环取代基各自独立地为：H；卤素；烷基；
或-OR8、-SR8、-(NR8R9)，其中R8和R9是甲基或乙基；或OMEGA。
或-OR8、-SR8、-(NR8R9)，其中R8和R9是甲基或乙基；或OMEGA。
[0167] 在某些实施方案中，所述还原染料化合物含有刚好2个在第二个杂环上的非氢取代基，其中之一是OMEGA。在某些优选的实施方案中，R5是OMEGA。在某些实施方案中，R5是OMEGA，且与R5邻近的取代基(对于吡啶鎓，R6；对于喹啉鎓，R4；对于2-喹啉鎓，R11)是非氢取代基。在某些实施方案中，与R5邻近的取代基是：卤素；-OR8、-SR8、-(NR8R9)或-OSO2R19；更优5 8 8 8 9 8 9
选卤素。在某些实施方案中，R 是-OR 、-SR 或-(NR R )，优选-(NRR )。在某些实施方案中，与R5邻近的取代基是OMEGA。在某些实施方案中，R5是苯基。R8和R9如前面所定义。
选卤素。在某些实施方案中，R 是-OR 、-SR 或-(NR R )，优选-(NRR )。在某些实施方案中，与R5邻近的取代基是OMEGA。在某些实施方案中，R5是苯基。R8和R9如前面所定义。
[0168] 在还原染料化合物的某些实施方案中，R2是甲基或乙基，R4是C1-C6烷基，R5是苯基，X是S，且n是0。
[0169] 与对应的氧化染料相比，本文中公开的还原的结合核酸的花青染料(其通常是膜可透过的并因此积累在细胞中)不能结合核酸且几乎不表现出或根本不表现出荧光。在细胞内与ROS反应(即，检测ROS)后，本文中公开的还原染料被氧化，由此提供以高亲和力结合核酸的花青染料，其在暴露于足够波长的光以后以实质荧光强度将核酸染色。与例如针对线粒体膜电位、质膜渗透性和/或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的探针组合的本文中公开的还原染料可以用于区分肝毒性化合物与无毒化合物。
[0170] 本文中公开的还原染料化合物表现出增强的对自氧化的稳定性，具有可调节的发射波长、和纳摩尔至毫摩尔的对ROS的敏感性。令人意外的是，不象其它现有技术ROS探针，本文中公开的还原染料化合物还表现出对甲醛固定和去污剂透化的抗性。另外，不象其它现有技术ROS探针，本文中公开的还原染料化合物可以用在更生理性的条件下，诸如在完全培养基中。此外，当使用本文中公开的还原染料化合物时，不需要染色后洗涤步骤，而其它现有技术ROS探针具有这样的需要。
[0171] 在某些实施方案中，本文中公开的还原染料化合物的第一个和第二个杂环系统任选地进一步被多个取代基取代，或者与任选地进一步被取代的额外环稠合，所述取代细调得到的还原的花青化合物的吸收和发射谱，并且也间接地细调对应的氧化的(例如，被ROS氧化的)染料化合物的吸收和发射谱。
[0172] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(VIII)的还原染料化合物：
[0173]
[0174] 其中
[0175] Q、W、R1、R2、R20、R21、R22、n和t如前文中所述。
[0176] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(IX)的还原染料化合物：
[0177]
[0178] 其中
[0179] Q、W、R1、R2、R20、R21、R22、n和t如前文中所述。
[0180] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(X)的还原染料化合物：
[0181]
[0182] 其中
[0183] Q、W、R1、R2、R15、R20、R21、R22、n和t如前文中所述。
[0184] 在某些实施方案中，提供了具有结构式(XI)的还原染料化合物：
[0185]
[0186] 其中
[0187] Q、W、R1、R2、R16、R17、R20、R21、R22、n和t如前文中所述。
[0188] 结构式(I)、(II)、(III)和(IV)中X部分的选择以及所述杂环系统之间的聚次甲基桥的长度对本文中公开的还原染料化合物的吸收和荧光发射性能具有影响。通过小心地选择X，可以相应地调节得到的还原染料化合物的光谱性能。在某些示例性实施方案中，X是S。
[0189] 本文中公开的还原染料化合物是氢花青或氘花青，两个类型都适合用于本文描述的组合物、应用方法和试剂盒。这些还原染料表现出增强的对自氧化的稳定性，具有可调节的发射波长和纳摩尔至毫摩尔的对ROS的敏感性。此外，给定的氘花青的氧化会产生相同的花青作为它的氢花青类似物，由此允许这些探针与ROS传感器的现有方案互换使用。虽然与现有技术ROS探针(诸如DHE)相比，本文中公开的氢花青染料在水溶液中表现出改善的对自氧化的稳定性，但是它们在细胞培养物中的背景氧化超过了相应的氘花青染料的背景氧化，所述氘花青染料可以表现出更大的对自氧化的稳定性，并由此表现出更低水平的背景荧光。不希望受理论的约束，在氢花青分子中的适当位置的氘置换可以使得分子对自发氧化(在储存后，对空气，等)更稳定，同时仍然允许在实际的ROS感知事件中有适当的反应性，在所述ROS感知事件中，H和D之间的反应速率差异相对于背景氧化事件速率而言是微不足道的。
[0190] 在某些实施方案中，提供了用于检测活性氧(ROS)的组合物，所述组合物包含：
[0191] a)本文描述的还原染料化合物中的一种或多种；和
[0192] b)载体，
[0193] 其中所述还原染料化合物以在与ROS反应后有效地检测ROS的存在的量存在。
[0194] 本文中公开的还原染料化合物通常在室温为固体。因此，所述化合物通常将溶解或悬浮于载体中用于作为组合物来使用或施用。要使用的还原染料的确切浓度取决于实验条件和期望的结果，通常需要优化实验条件来确定要在给定应用中使用的还原染料的最佳浓度。还原染料的浓度通常是在纳摩尔至毫摩尔范围内，优选纳摩尔至微摩尔。从本领域已知的、在可比较的条件下为期望的光学应答使用类似化合物的方法，容易地确定还原染料化合物的浓度。
[0195] 在某些实施方案中，提供了用于检测ROS的组合物，所述组合物包含：
[0196] a)本文描述的还原染料化合物中的一种或多种；和
[0197] b)载体，
[0198] 其中所述还原染料化合物以在与ROS反应后有效地检测ROS的存在的量存在，且其中所述组合物适合用于体内使用。
[0199] 通常，对于体内使用，还原染料的浓度为在合理时间内得到样品中的可检测信号以及最小背景荧光所需要的最小量。要使用的还原染料的确切浓度取决于实验条件和期望的结果。在某些实施方案中，染料的量是约50μg/kg至约50g/kg，优选约50μg/kg至约10g/kg，更优选约50μg/kg至约1g/kg，最优选约50μg/kg至约0.1g/kg。
[0200] 对于体内使用，通常将本文提供的还原染料化合物与一种或多种载体组合。本文中使用的“载体”表示存在于组合物中的除了还原染料之外的所有组分。术语“载体”包括、但不限于：溶剂、助悬剂、分散剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗性调节剂、防腐剂、抗微生物剂、添加剂、赋形剂及其组合。添加剂包括可用于加工或制备组合物的那些、可帮助组合物的掺和或稳定的那些、或可用于改变组合物的性能的那些。赋形剂包括任意数目的其它医学上或药学上可接受的试剂，诸如防腐剂、脂质、脂肪酸、蜡、表面活性剂、塑化剂、致孔剂(porosigen)、抗氧化剂、填充剂、缓冲剂、螯合剂、共溶剂、水溶性试剂、不溶性试剂、金属阳离子、阴离子、盐、渗透剂、合成的聚合物、生物的聚合物、亲水的聚合物、多糖、糖、疏水的聚合物、亲水的聚合物及其组合。
[0201] 对于体内应用，通过多种途径可以施用该制剂。通常，将所述化合物配制用于胃肠外施用，包括、但不限于，静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、真皮内、输注、结膜下和导管内(例如，泌尿科(aurologic)递送)以及经由外置镜(external scopic)技术(例如，关节镜或内窥镜技术)施用。
[0202] 可以将本文中公开的的组合物施用至特定位置(例如，局部递送)，包括、但不限于：鞘内、心内、骨内(例如，骨髓)、立体定向引导递送、输注递送、CNS递送、立体定位施用的递送、矫形递送(例如，递送至关节或骨中)、心血管递送、眼间、眼内和眼旁递送(包括玻璃体内和巩膜、眼球后和sub-tenous递送)以及递送至任意多个其它部位、位置、器官等。
[0203] 在某些实施方案中，提供了用于检测ROS的组合物，所述组合物包含：
[0204] a)本文描述的还原染料化合物中的一种或多种；和
[0205] b)载体，
[0206] 其中所述还原染料化合物以在与ROS反应后有效地检测ROS的存在的量存在，且其中所述组合物适合用于体外使用。
[0207] 通常，对于体外使用，与细胞接触的还原染料化合物的浓度是约1μM至约100μM。但是，基于将要进行的测定，可以容易地调节具体浓度。一般而言，将本文中公开的还原染料化合物溶解或悬浮在适合于预期用途的适当溶剂中。合适的溶剂包括、但不限于：水性溶剂，诸如水、PBS、盐水，有机溶剂，诸如DMSO和醇，及其组合。本文中公开的还原染料化合物还可以或可替换地被包囊在不同的纳米结构中以改善细胞递送。合适的纳米结构包括、但不限于：脂质体、微粒(诸如聚合微粒)和胶束(诸如由嵌段共聚物形成的聚合胶束)。
[0208] 使用方法：
[0209] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的方法，所述方法包括下述步骤：
[0210] a)使所述样品与有效量的本文提供的还原染料化合物中的一种或多种或本文中提供的组合物接触；和
[0211] b)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化。
[0212] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的ROS的方法，所述方法包括：
[0213] a)使所述样品与有效量的本文提供的还原染料化合物中的一种或多种接触；
[0214] b)测量所述一种或多种染料化合物的荧光强度；和
[0215] c)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化；
[0216] 其中荧光强度的增加指示样品中ROS的存在。
[0217] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的ROS的方法，所述方法包括：
[0218] a)使所述样品与有效量的一种或多种组合物接触，所述组合物包含本文提供的还原染料化合物中的一种或多种；
[0219] b)测量所述一种或多种组合物的荧光强度；和
[0220] c)确定所述还原染料化合物是否已经被氧化；
[0221] 其中荧光强度的增加指示样品中ROS的存在。
[0222] 在某些实施方案中，本文中公开的还原染料化合物可以被用作诊断工具，以在体内评价或检测多种以ROS的产生或过度产生为特征的疾病和障碍或疾病或障碍的标志物，或在体外检测或定量样品中的ROS。取决于用途，使用荧光光谱法或荧光显微术，可以测量由氧化染料发射的荧光，所述染料在本文中公开的还原染料与ROS反应后产生。荧光显微术的示例性方法包括、但不限于：共焦激光扫描显微术、全内部反射荧光显微术、经由荧光的组织学分析、流式细胞计量术、使用平板读数器(诸如荧光微量培养板读数器、标准或小型荧光计或落射荧光显微镜)的分析。
[0223] 在某些实施方案中，本文中公开的还原染料化合物和包含那些染料的组合物可以被用作体内诊断工具，以评价或检测多种以ROS的产生或过度产生为特征的疾病和障碍。示例性的疾病和障碍包括、但不限于：颈动脉损伤、动脉粥样硬化、高血压、癌症、以炎症为特征的疾病和障碍、辐射诱导的晚期正常组织损伤、由化疗引起的组织损伤、缺血或移植后的再灌注、糖尿病(诸如I型糖尿病(T1D))、神经变性疾病(诸如阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨廷顿病)、脑血管疾病、囊性纤维化、慢性肾脏疾病、心血管疾病、先兆子痫和眼科疾病(即，眼的疾病)。另外，本文中公开的还原染料化合物可以用在正电子发射断层摄影术(PET)(作为造影剂)、生物分子成像和光声成像中。
[0224] 在某些实施方案中，本文中公开的还原染料化合物和包含那些染料的组合物可以用于多种体外或离体测定。例如，所述还原染料可以用于单细胞成像或测定细胞混悬液，在该过程中，将染料通过与细胞一起温育足够的时间段来加载进细胞中。具体的测定包括、但不限于，使用活器官培养物的那些以及细胞培养测定。
[0225] 使用本文中公开的还原染料的一般规程如下。在体内或在体外施用本文中公开的一种或多种还原染料化合物或者包含一种或多种还原染料化合物的组合物，以接触生物样品，即，细胞、细胞培养物、组织、器官、血清、体液、生物流体等。取决于测定，可以将本文中公开的一种或多种还原染料与一种或多种载体一起配制。将一种或多种还原染料化合物与样品一起温育足以使所述一种或多种还原染料与存在于样品中的活性氧(ROS)反应的时间段。在这样的时间之后，分析样品的荧光强度。将温育后的荧光强度与一种或多种还原染料的荧光强度进行对比。生物样品中的染料的荧光强度的增加指示染料的氧化并因此指示活性氧(ROS)的存在。使用以上列出的技术，可以测量或检测增加的荧光。
[0226] 试剂盒：
[0227] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0228] a)本文提供的还原染料化合物中的一种或多种；和
[0229] b)一个或多个容器。
[0230] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0231] a)包含本文中提供的还原染料化合物的组合物中的一种或多种；和
[0232] b)一个或多个容器。
[0233] 在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的活性氧(ROS)的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0234] a)本文中提供的未还原的花青染料化合物中的一种或多种；
[0235] b)一种或多种还原剂；和
[0236] c)一个或多个容器。
[0237] 在某些实施方案中，本文提供的试剂盒还包含关于执行测定的说明书，所述测定用于检测样品中的一种或多种活性氧(ROS)。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒适合与体内测定一起使用。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒适合与体外测定一起使用。可以使用的还原剂的非限制性例子包括、但不限于：金属盐诸如LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、含有Sn2+离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。这些中的任一种可以具有被氘替代的氢，例如，NaBD4、Zn(BD4)2、LiAlD4。在某些实施方案中，所述还原剂可以是NaBH4或NaBD4。
[0238] 本文中使用的术语“试剂盒”表示相关组分(通常一种或多种还原染料化合物或包含还原染料化合物的组合物)的包装组件。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒包含一种或多种本文描述的还原染料化合物或组合物、一种或多种适合用于体外或体内应用的载体、和一个或多个容器，在所述容器中储存所述一种或多种还原染料和/或一种或多种载体，诸如溶剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂等。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒包含一种或多种具有结构式(III)或(IV)的未反应的花青染料化合物、一种或多种还原剂、一种或多种适合用于体外或体内应用的载体、和一个或多个容器，在所述容器中储存所述一种或多种还原染料和/或一种或多种载体，诸如溶剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂等。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒任选地含有关于以下方面的说明书：如何制备一种或多种还原染料，或如何制备包含一种或多种还原染料的组合物，如何施用所述染料或含有所述染料的组合物，和如何检测染料的氧化(例如，激发波长和发射波长)。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒含有关于执行测定的说明书，所述测定检测一种或多种活性氧(ROS)的存在。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒还可以含有一件或多件设备以施用染料或含染料的组合物，所述设备包括、但不限于：注射器、吸管、吸球(pipette bulbs)、刮勺(spatulas)、管形瓶、注射器针头，和它们的不同组合。
[0239] 制备/合成的方法：
[0240] 通常通过用还原剂还原相应的花青染料，制备适合用在本文描述的组合物、使用方法和试剂盒中的本文中公开的还原染料。例如，从它们相应的花青染料，经由一步还原法，使用还原剂诸如硼氢化钠(NaBH4)或硼氘化钠(NaBD4)，可以合成本文中公开的氢花青和氘花青染料。与它们的相应花青染料相比，本文中公开的还原染料几乎没有或根本没有表现出荧光(由于破坏的π-共轭)。但是，在与ROS反应后，所述还原染料被氧化(再生具有扩展的π-共轭的以高亲和力结合核酸的花青染料)，由此实现当暴露于足够波长的光时荧光强度的大幅增加。
[0241] 在某些实施方案中，提供了用于制备具有结构式(I)的还原染料化合物(即，ROS探针)的方法：
[0242]
[0243] 所述方法包括：
[0244] a)使具有结构式(III)的花青化合物与还原剂反应，
[0245]
[0246] 其中：
[0247] Q、W、X、R1、R2、R20、R21、R22、n和t如前文中所定义。可以使用的还原剂的非限制性例子包括、但不限于：金属盐诸如LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、含有Sn2+离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。这些中的任一种可以具有被氘替代的氢，例如，NaBD4、Zn(BD4)2、LiAlD4。在某些实施方案中，所述还原剂可以是NaBH4或NaBD4。
[0248] 在某些实施方案中，提供了用于制备具有结构式(II)的还原染料化合物(即，ROS探针)的方法：
[0249]
[0250] 所述方法包括：
[0251] a)使具有结构式(IV)的花青化合物与还原剂反应，
[0252]
[0253] 其中：
[0254] W、X、R1、R2、R3、R4、R5、R11、R12、R13、R14、R20、R21、R22、n和t如前文中所定义。可以使用的还原剂的非限制性例子包括、但不限于：金属盐诸如LiAlH4、NaBH4、Zn(BH4)2、含有Sn2+离子的化合物、亚硫酸盐化合物、二异丁基氢化铝(DIBAH)、草酸、甲酸、抗坏血酸、亚磷酸盐、连二磷酸盐、连二磷酸、二硫苏糖醇(DTT)和含有Fe2+离子的化合物。这些中的任一种可以具有被氘替代的氢，例如，NaBD4，Zn(BD4)2，LiAlD4。在某些实施方案中，所述还原剂可以是NaBH4或NaBD4。
[0255] 在这样的方法的一个示例性实施方案中，如在下面显示的一般路线图中所示，制备结构式(II)的化合物：
[0256] 一般路线图
[0257]
[0258] 其中
[0259] Z-是生物学上相容的抗衡离子；和
[0260] X、R1、R2、R3、R4、R5、R11、R12、R13、R14、n和t如在前文中所定义。
[0261] 在这样的方法的另一个示例性实施方案中，如在路线图I中所示，制备结构式(I)的化合物：
[0262]
[0263] 在这样的方法的另一个示例性实施方案中，如在路线图II(参见下面)中所示，制备结构式(I)的化合物：
[0264]
[0265] 上面已经提供了本发明的详细描述，下述实施例为了例证本发明的目的而给出，并且不应当被解释为对本发明或权利要求的范围的限制。
[0266] 实施例
[0267] I.本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)的化学合成：
[0268] 实施例1：(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2，3-二氢苯并[d]噻唑(1)的合成
[0269]
[0270] 向(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物(350mg，0.636mmol)在甲醇(15mL)中的溶液中，缓慢地加入硼氢化钠(96mg，2.54mmol)，并将混合物在冰水浴温度搅拌保持30min。将反应混合物用乙酸乙酯(150mL)稀释，并用水(2x50mL)洗涤。将分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。蒸发溶剂后，通过在硅胶上的柱色谱法纯化粗产物，用2％乙酸乙酯在己烷中的溶液洗脱，得到期望的产物(1，225mg，
83％收率)。TLC：Rf＝0.45(硅胶，5％乙酸乙酯在己烷中的溶液)。
83％收率)。TLC：Rf＝0.45(硅胶，5％乙酸乙酯在己烷中的溶液)。
[0271] 实施例2：(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2-氘-3-氢苯并[d]噻唑(2)的合成
[0272]
[0273] 向(Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物(100mg，0.18mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中，缓慢地加入硼氘化钠(22mg，0.53mmol)，并将混合物在冰水浴温度搅拌保持30min。将反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用水(2x30mL)洗涤。将分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。蒸发溶剂后，通过在硅胶上的柱色谱法纯化粗产物，用2％乙酸乙酯在己烷中的溶液洗脱，得到期望的产物(2，50mg，65％收率)。TLC：Rf＝0.43(硅胶，5％乙酸乙酯在己烷中的溶液)。
[0274] 实施例3：(Z)-3-甲基-2-((1-丙基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-2，3-二氢苯并[d]噻唑(3)的合成
[0275]
[0276] 以与在上面化合物1的实施例中描述的类似的规程，从(Z)-3-甲基-2-((1-丙基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)苯并[d]噻唑-3-鎓甲苯磺酸盐和硼氢化钠制备化合物3。
[0277] 实施例4：(Z)-2-((2-甲氧基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基-2，3-二氢苯并[d]噻唑(4)的合成
[0278]
[0279] 以与在上面化合物1的实施例中描述的类似的规程，从(Z)-2-((2-甲氧基-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓高氯酸盐和硼氢化钠制备化合物4。
[0280] 实施例5：(Z)-N1，N1-二甲基-N3-(4-((3-甲基-2，3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚甲基)-1-苯基-1，4-二氢喹啉-2-基)-N3-丙基丙烷-1，3-二胺(5)的合成
[0281]
[0282] 以与在上面化合物1的实施例中描述的类似的规程，从(Z)-2-((2-((3-(二甲基氨基)丙基)(丙基)氨基)-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓氯化物和硼氢化钠制备化合物5。
[0283] 实施例6：N-乙基-N-(4-((Z)-4-((E)-3-(2-甲基-2，3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚丙烯基)-1-苯基-1，4-二氢喹啉-2-基)苄基)乙胺(6)的合成
[0284]
[0285] 向2-((1E，3Z)-3-(2-(4-((二乙基氨基)甲基)苯基)-1-苯基喹啉-4(1H)-亚基)丙-1-烯-1-基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物(50mg，0.07mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中，缓慢地加入硼氢化钠(10mg，0.26mmol)，并将混合物在冰水浴温度搅拌保持30min。将反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用水(2x25mL)洗涤。将分离的有机层经Na2SO4干燥和过滤。蒸发溶剂后，通过在硅胶上的柱色谱法纯化粗产物，用2％乙酸乙酯在己烷中的溶液洗脱，得到期望的产物(6)。
[0286] 实施例7：N-乙基-N-(4-((Z)-1-甲基-4-((E)-3-(3-甲基-2，3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)亚丙烯基)-1，4-二氢喹啉-2-基)苄基)乙胺(7)的合成
[0287]
[0288] 以与在上面化合物6的实施例中描述的类似的规程，从2-((1E，3Z)-3-(2-(4-((二乙基氨基)甲基)苯基)-1-甲基喹啉-4(1H)-亚基)丙-1-烯-1-基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物和硼氢化钠制备化合物7。
[0289] II.本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)的生物学应用实施例：
[0290] 实施例8：甲萘醌诱导的ROS的检测
[0291] 将人骨肉瘤(U2-OS)细胞以200,000个细胞/皿的密度铺板在MatTek30mm皿上，并在37℃温育。然后用或不用200μM叔丁基过氧化氢(TBHP，在37℃2小时)或100μM甲萘醌(在37℃1小时)处理细胞。对于药物温育的最后30min，将细胞用5μM化合物1染色。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，并在Zeiss Axiovert倒置显微镜上使用40×物镜成像。对于试验的所有化合物，观察到化合物1的信号的增加，从而指示这些细胞模型中氧化性应激的增加(参见，图2)。
[0292] 实施例9：氧化性应激的检测
[0293] 将人主动脉平滑肌(HASM)细胞以150,000个细胞/皿的密度铺板在MatTek30mm上并在37℃温育。然后将细胞用或不用500ng/ml血管紧张素-II处理4小时。对于药物温育的最后30min，将细胞用5μM化合物1染色。将细胞用PBS洗涤3次，并在Zeiss Axiovert倒置显微镜上使用40×物镜成像。对于试验的所有化合物，观察到化合物1的信号的增加，从而指示这些细胞模型中氧化性应激的增加(参见，图3)。
[0294] 实施例10：甲萘醌诱导的氧化性应激的定量检测
[0295] 将牛肺动脉内皮(BPAE)细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板在96-孔平板上并在37℃温育。将细胞用100μM甲萘醌在37℃处理1小时。将细胞用化合物1在37℃染色30min。然后将细胞用PBS洗涤3次，并在Thermo Fisher ArrayScan VTI(Thermo Fisher
Scientific，Pittsburgh，PA)上分析。将平均信号强度绘制在y-轴上，并将对照和处理过的样品绘制在x-轴上(参见，图4)。
Scientific，Pittsburgh，PA)上分析。将平均信号强度绘制在y-轴上，并将对照和处理过的样品绘制在x-轴上(参见，图4)。
[0296] 实施例11：对甲醛固定和去污剂透化的抗性
[0297] 将人骨肉瘤(U2-OS)细胞以7,500个细胞/孔的密度铺板在96-孔平板上并在37℃温育过夜。将细胞用或不用100μM甲萘醌在37℃处理1小时。然后通过将探针加入到完全培养基中将细胞用5μM化合物1和Hoechst33342染色，并在37℃温育30min。将细胞用PBS洗涤，并在Thermo Fisher Cellomics VTI上成像，所述细胞为活的、或用4％甲醛固定、或用甲醛固定并用0.1％Triton X-100渗透化处理。数据表明，在将细胞甲醛固定和去污剂透化以后，化合物1信号保持较好(参见，图5)。
[0298] 实施例12：使用流式细胞计量术检测氧化性应激
[0299] 将Jurkat细胞在含有10％FBS的RPMI中稀释至106个细胞/ml的密度。将对照细胞用媒介物对照或DMSO处理，并将样品细胞用不同浓度的甲萘醌(25μM、50μM或100μM)处理，或者用不同浓度的叔丁基过氧化氢(TBHP)(50μM、100μM或200μM)处理60min。对于药物温育的最后30分钟，加入化合物1至5μM的终浓度。获取样品，并在 Acoustic Focusing Cytometer上分析。使用488nm激光和530/30nm带通发射过滤器，检测化合物1荧光。使用标准的200μl/分钟收集速率，收集共计20,000个事件。与它们的对照相比，在甲萘醌和TBHP处理的细胞中观察到化合物1荧光强度的增加(参见，图6)。
[0300] 实施例13：THBP诱导的ROS的检测
[0301] 将Jurkat细胞用磷酸盐缓冲盐水(图7，对照)、200μM叔丁基过氧化氢(图7，TBHP)、或200μM TBHP和1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(图7，TBHP+NAC)在37℃、5％CO2下处理1小时，然后与500nM化合物1一起温育。使用配有488nm激光线和525/50带通滤波器的Becton Dickinson LSRII流式细胞计分析细胞样品，用于收集化合物1的荧光发射。TBHP是被广泛地用在不同系统的氧化性应激模型中的膜透性的促氧化剂。已经将TBHP诱导的氧化性应激应答的减少归因于抗氧化剂NAC的补充细胞内谷胱甘肽水平的能力。这会降低活性氧的水平。用单独的TBHP处理的细胞表现出来自化合物1的增加的荧光发射，平均荧光强度(MFI)为3944，与此相比，对照细胞的MFI为365。与用TBHP处理的细胞相比，用TBHP和NAC处理的细胞表现出减小的化合物1荧光MFI(MFI＝2768)。这证实了细胞内活性氧的减少，其原因是由增加的谷胱甘肽水平引起的增强的细胞抗氧化能力。
[0302] 实施例14：ROS的检测不需要染色后洗涤步骤
[0303] 将Jurkat细胞(T-细胞白血病，人)用磷酸盐缓冲盐水(对照；图8，图A)或200μM叔丁基过氧化氢(TBHP；图8，图B)在37℃、5％CO2下处理1小时，然后与500nM化合物1一起温育。在配有488nm激光线和525/50带通滤波器的Becton Dickinson LSRII流式细胞计上直接分析细胞样品，用于收集化合物1的荧光发射。直方图重叠显示了与在3个3mL洗涤步骤以后分析的样品(图8)相比，在与化合物1一起温育30分钟以后立即分析的细胞(图8)。化合物1荧光的中间荧光强度(MFI)没有显著不同于洗涤的细胞的中间荧光强度。在未洗涤样品中的信噪比(或TBHP处理的细胞相对于对照细胞的倍数变化)类似于洗涤3次的样品中的信噪比，对于未洗涤和洗涤的样品，分别为9.1和10.4。这指示，不象需要这样的洗涤步骤的其它现有技术ROS探针一样，可以在没有洗涤步骤的情况下使用化合物1。
[0304] 实施例15：在完全培养基中相对于在含有蛋白的缓冲液中的ROS的检测
[0305] 将Jurkat细胞(T-细胞白血病，人)再悬浮于完全培养基(RPMI1640培养基，GIBCO(Life Technologies，Carlsbad，CA)，补充了10％胎牛血清，FBS)或补充了1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水中。将在完全培养基(图9，图A)和缓冲盐水+1％BSA(图9，图B)中的细胞用稀释剂对照单独的磷酸盐缓冲盐水(图9，对照)或400μM叔丁基过氧化氢(图9，TBHP)在37℃、5％CO2下处理30分钟，然后用500nM化合物1染色。在配有488nm激光线和525/50带通滤波器的BD LSRII流式细胞计上分析细胞样品，用于收集化合物1的荧光发射。与在含有蛋白的缓冲液(图9，图B)中染色的样品相比，在完全培养基(图9，图A)中染色的对照细胞的化合物1荧光的中间荧光强度(MFI)(图9，图A)和TBHP处理的细胞的化合物1荧光的MFI(图9，图B)增加。结果，在完全培养基(图9，图A)中染色的样品的信噪比(或TBHP处理的细胞相对于对照细胞的倍数变化)(13.6)大于在含有蛋白的缓冲液中染色的样品的信噪比
(9.6)。这指示，化合物1可以用于在完全培养基中将细胞染色，从而给用户提供胜过既存现有技术ROS检测试剂(其需要在不含蛋白的缓冲液中染色)的显著优点。
(9.6)。这指示，化合物1可以用于在完全培养基中将细胞染色，从而给用户提供胜过既存现有技术ROS检测试剂(其需要在不含蛋白的缓冲液中染色)的显著优点。
[0306] III.本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)的生物学应用实施例：
[0307] 除了上述的应用以外，本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)和含有那些染料的组合物可以在体外用作诊断工具以检测或定量多种样品中的ROS。此外，本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)和含有那些染料的组合物可以在体内用于检测多种以ROS的产生或过度产生为特征的疾病和障碍或疾病和障碍的标志物，以及用在正电子发射断层摄影术(PET)(作为造影剂)、生物分子成像和光声成像中。
[0308] 实施例16：体内ROS产生的成像
[0309] 评价本文中公开的还原染料化合物(ROS探针)的使体内ROS产生成像的能力，所述ROS在急性炎症的LPS模型中由活化的巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生。简而言之，将小鼠分为三组：给第I组施用LPS(1mg在400μL盐水中)的腹膜内(i.p.)注射；给第II组施用盐水(400μL)的i.p.注射；和第III组不经处理。6h后，将小鼠麻醉，剃除它们的腹毛，并给LPS-和盐水-处理的小鼠腹膜内注射ROS探针(～5nM在50μL甲醇中)。使用体内成像系统，诸如柯达体内成像系统FX(Kodak In-Vivo Imaging System FX)(Kodak Molecular Imaging Systems，New Haven，CT)，将小鼠按三份成像，每组一份。