一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法

摘要

本发明涉及一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，包括以下步骤：将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。本发明所提供的方法简单易行，缩短了不定芽诱导的周期，每个外植体能够诱导至少4个不定芽，提高了诱导数，并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的不定芽生长健壮，能够快速成苗。

权利要求

1.一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；

其中，所述诱导的步骤包括：

1)利用诱导培养基在培养温度为19-21℃、光照强度为1450-1550lx、光照时间为11-

13h/d的条件下诱导培养30-50天；

2)更换新鲜的诱导培养基在3-5℃下处理7-10天后置于温度为19-21℃、光照强度为

2000-2500lx、光照时间为11-13h/d的环境条件下培养25-40天，获得带有不定芽和芽点的膨大的外植体；

所述增殖的步骤包括：将上述外植体接种在增殖培养基中，培养条件与步骤1)相同，培养30-50天；

所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-2.0mg/L的NAA；

所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加浓度为0.2-1.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-1.0mg/L的NAA，浓度为0.1-1.0mg/L的2,4-D。

2.根据权利要求1所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基还添加有浓度为30-50g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

3.根据权利要求2所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

4.根据权利要求1或3所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述消毒的步骤包括：将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。

5.根据权利要求4所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，在诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7个。

说明书

一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的涉及一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法。

背景技术

[0002] 黄花贝母(F.verticillata)是百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria L.)的一种多年生球根植物，具有较高的药用价值和观赏价值。自然分布于新疆的塔城、托里、额敏、裕民、阿勒泰、富蕴、和布克赛尔、吉木乃、青河等县，生长于海拔1500～2000米的山地草原、灌木及砾石质山坡地上。产地土壤肥沃、质地疏松、排水良好。现在也多进行人工栽培繁殖，主要在新疆、甘肃等地进行栽培种植。因其喜欢冷凉气候，不耐高温，生长周期短且不易在异地进行栽培种植，加之长期以来人们对野生资源的滥采乱挖，致使数量急剧减少，这就极大地限制了它的应用。

[0003] 此外，黄花贝母和其它贝母一样，常规的繁殖方法以播种和分球繁殖为主，用鳞茎进行繁殖，其繁殖系数低，且容易造成种性退化。而用种子进行有性繁殖，其繁殖周期长，一般要5-6年的时间才能长成开花种球，且黄花贝母种子的种胚发育不全，需经低温处理后熟后才能完成胚的生长和发育，这很难适应和满足产业化大生产和国内外市场的需求。而采取植物组织培养技术，可以快速获得贝母不定芽，进一步培养成贝母幼苗，移栽1～2年后即可收获成熟贝母，这样不仅缩短了人工栽培贝母周期，而且可大量繁殖贝母幼苗，从而实现贝母种苗规模化生产。

[0004] 目前关于贝母组织培养已有一些报道，并取得了一定的进展，这些研究多采用贝母的鳞茎作为外植体，通过离体培养进行愈伤的诱导，或进行鳞茎的再生等以达到快速繁殖的目的，已经在川贝母、平贝母、伊贝母、暗紫贝母等种类上取得了一定的效果。而关于黄花贝母组培的研究较少，只有高燕等发表的《贝母愈伤组织的诱导及植株再生》(新疆农业科学,2005,01:35-37)一文中公开了有关黄花贝母的组织培养研究，文中提到诱导不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D0.1mg/L，平均每个外植体产生2～3个不定芽。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种简单易行、培养周期短、能够在外植体上诱导出4-7个不定芽，且不定芽绿色健壮的黄花贝母组织培养诱导成芽的方法。

[0006] 为达到以上目的，本发明提供了一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，所述方法包括以下步骤：

[0007] 将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；

[0008] 其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。

[0009] 可选的，所述诱导的步骤包括：

[0010] 1)利用诱导培养基在培养温度为19-21℃、光照强度为1450-1550lx、光照时间为11-13h/d的条件下诱导培养30-50天；

[0011] 2)更换新鲜的诱导培养基在3-5℃下处理7-10天后置于温度为19-21℃、光照强度为2000-2500lx、光照时间为11-13h/d的环境条件下培养25-40天，获得带有不定芽和芽点的膨大的外植体；

[0012] 所述增殖培养的步骤包括：将上述外植体接种在增殖培养基中，培养条件与步骤1)相同，培养30-50天。

[0013] 可选的，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-2.0mg/L的NAA。

[0014] 可选的，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.2-1.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-1.0mg/L的NAA，浓度为0.1-1.0mg/L的2,4-D。

[0015] 可选的，所述诱导、增殖培养基还含有浓度为30-50g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

[0016] 可选的，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

[0017] 可选的，所述消毒的步骤包括：

[0018] 将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。

[0019] 可选的，在诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7个。

[0020] 本发明所提供的方法简单易行，缩短了不定芽诱导的周期，每个外植体能够诱导至少4个不定芽，提高了诱导数，并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的不定芽生长健壮，能够快速成苗。

附图说明

[0021] 图1为黄花贝母生长期鳞茎刚接种到诱导培养基中的情况；

[0022] 图2为外植体膨大后表面长出芽点和芽的情况；

[0023] 图3为不定芽经过增殖培养后的情况；

[0024] 图4为单个健壮芽的情况。

具体实施方式

[0025] 下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0026] 本发明提供了一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，所述方法包括以下步骤：

[0027] 将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。

[0028] 在本发明中，所述生长期鳞茎采自处于营养生长期的黄花贝母种球，即地上部分开始长叶至有花蕾前，一般的，黄花贝母在每年的2月下旬至3月上旬进入营养生长期，此时的鳞茎处于细胞生长旺盛时期，可以用作外植体用于诱导不定芽。

[0029] 本发明所提供的方法还包括在进行消毒前的清洗步骤，本发明对于清洗的方法没有特别的限制，只要能够去除杂物获得洁净的鳞茎即可，在本发明的一种实施方式中，可以先剥除黄花贝母鳞茎上带有的老鳞茎及根等杂物，然后将鳞茎置于有洗洁精的溶液中浸泡15-25min，浸泡期间不停地摇晃以去除鳞茎表面的杂物，之后用清水冲洗鳞茎60-90min获得清洗干净的鳞茎。

[0030] 根据本发明所提供的方法，所述消毒的步骤包括：

[0031] 将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。在用次氯酸钠溶液浸泡后，还需要用无菌水对鳞茎清洗3-5次，每次3-5min，清洗结束后，用无菌滤纸吸干鳞茎表面的水分。为了避免杂菌污染，上述步骤需要在超净工作台中进行。

[0032] 在诱导前，将鳞茎切割成小块，所述小块的尺寸约为5mm×5mm×3mm。

[0033] 在本发明所提供的方法中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-2.0mg/L的NAA。

[0034] 优选的，为了获得更好的诱导效果，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5mg/L的6-BA，浓度为0.2mg/L的NAA，或者，以MS培养基为基本培养基，含有浓度为1.0mg/L的6-BA，浓度为1.0mg/L的NAA。

[0035] 在本发明所提供的方法中，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.2-1.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-1.0mg/L的NAA，浓度为0.1-1.0mg/L的2,4-D。

[0036] 优选的，为了获得更好的增殖效果，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.2mg/L的6-BA，浓度为0.5mg/L的NAA，浓度为1.0mg/L的2,4-D。

[0037] 其中所述MS培养基的配方为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、氯化钙440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L。

[0038] 在本发明的一种实施方式中，为了使黄花贝母的茎段获得更加充分的营养，所述诱导、增殖培养基还含有浓度为30-50g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

[0039] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

[0040] 具体的，所述诱导的步骤包括：

[0041] 1)利用诱导培养基在培养温度为19-21℃、光照强度为1450-1550lx、光照时间为11-13h/d的条件下诱导培养30-50天；

[0042] 2)更换新鲜的诱导培养基在3-5℃下处理7-10天后置于温度为19-21℃、光照强度为2000-2500lx、光照时间为11-13h/d的环境条件下培养25-40天，得带有不定芽和芽点的膨大的外植体。

[0043] 其中在步骤1)中，鳞茎在诱导培养基中培养45-55天后开始长出芽点，随后芽点逐渐发育成不定芽。一般的，在诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7个。

[0044] 将在诱导培养基中获得的带有不定芽和芽点的膨大的外植体接种在增殖培养基中，培养温度为19-21℃、光照强度为1450-1550lx、光照时间为11-13h/d，培养30-50天后，膨大的外植体上分化出更多的芽，平均每个外植体有6-8个芽和芽点。

[0045] 下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0046] 实施例1-5

[0047] 实施例1-5用于说明本发明所提供的诱导增殖方法。

[0048] (1)将种在北林科技花卉工程技术中心温室花盆内处于营养生长时期的黄花贝母种球挖出。

[0049] (2)剥除上述鳞茎上带有的旧鳞茎及根等杂物，然后置于含有洗洁精的溶液中浸泡20min，期间应不停地摇晃，之后用自来水进行流水冲洗90min，然后将鳞茎在超净工作台上采用75％酒精进行表面消毒60s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的升汞处理10min，再用2％的次氯酸钠水溶液处理15min，无菌水冲洗3次，每次5min，然后用无菌滤纸吸干表面的水分，待用；

[0050] (3)将步骤(2)中处理后的鳞茎切成长、宽各约0.5cm的小块共28块，然后将其接入诱导不定芽的培养基中进行诱导培养。

[0051] 诱导培养基的组分如表1所示，培养温度为20℃，在光照时间为12h/d，光强为1500lx的环境中培养，35天后在膨大的外植体上长出芽点，之后形成不定芽2-3个。然后将其接种在新鲜的诱导培养基上进行继代培养，同时转入4℃低温下处理7天，之后在培养温度为20℃，在光照时间为12h/d，光强为2000lx的环境中培养30天，每个外植体可获得4-5个绿色健壮的不定芽。

[0052] (4)不定芽的增殖培养

[0053] 将经过低温处理的长有芽点的外植体接种在以下增殖培养基中进行增殖培养，MS+0.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1.0mg/L2,4-D+50g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.89，培养温度为20℃，光照时间为12h/d，光强为1500lx。

[0054] 统计外植体通过诱导增殖得到的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0055] 在诱导增殖过程中，观察实施例1中黄花贝母生长期鳞茎切块刚接种到诱导培养基中的情况(见图1)；外植体膨大后表面长出芽点和芽的情况(见图2)；不定芽经过增殖培养后的情况(图3)；单个健壮芽的情况(图4)。

[0056] 表1

[0057]实施例 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 蔗糖(g/L) 琼脂(g/L) pH
1 0.5 0.2 30 6.5 5.85
2 1.0 1.0 30 6.5 5.92
3 0.5 2.0 30 6.5 5.96
4 1.0 2.0 30 6.5 5.83
5 2.0 0.5 30 6.5 5.89

[0058] 实施例6

[0059] 采用与实施例1相同的方法进行不定芽诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA附加50g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.88。

[0060] 统计诱导增殖得到的外植体上作为组培苗的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0061] 实施例7

[0062] 采用与实施例1相同的方法进行不定芽诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA，并且，附加50g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，诱导培养基的pH值为5.95。

[0063] 统计诱导增殖得到的外植体上作为组培苗的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0064] 实施例8

[0065] 采用与实施例1相同的方法进行不定芽诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D，附加50g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.83。

[0066] 统计诱导增殖得到的外植体上作为组培苗的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0067] 实施例9

[0068] 采用与实施例1相同的方法进行不定芽诱导增殖，不同的是，诱导培养的步骤为：利用诱导培养基在培养温度为25℃、光照强度为1600lx、光照时间为14h/d的条件下培养35天。

[0069] 统计诱导增殖得到的外植体上作为组培苗的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0070] 对比例1

[0071] 按照高燕等发表的《贝母愈伤组织的诱导及植株再生》一文中的诱导增殖方法进行黄花贝母不定芽诱导，步骤如下：

[0072] 取新鲜贝母鳞茎，刮去鳞片上的栓皮，用水洗净后放在70％酒精溶液中浸泡，4～5min后取出鳞茎，再将鳞茎浸泡在0.1％氯化汞溶液中消毒，20min后倒去消毒液，用无菌水冲洗鳞茎7～8次，在无菌条件下将鳞茎切成方约5mm×5mm×2mm的小块，接种于诱导培养基上，以MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.1mg/L+GA3(赤霉素)0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.8诱导不定芽。

[0073] 培养条件为：10℃下暗培养2周，后转到18～20℃，光强1500lx，12h/d的光下培养，4～5周后,诱导出愈伤组织和不定芽，平均每个外植体均产生2～3个不定芽。

[0074] 统计诱导增殖得到的外植体上作为组培苗的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。

[0075] 表2

[0076]

[0077] 表2中，诱导率＝诱导出芽和芽点的外植体数/接种数×100％；

[0078] 增殖倍数＝增殖培养后每个外植体的不定芽平均数量/诱导培养后每个外植体的不定芽平均数量

[0079] 将实施例1-9以及对比例1中获得的不定芽进行数量对比，可以发现，实施例1中通过诱导和增殖培养后不定芽的数量平均可以达到7.6个，明显优于其他组合的培养及高燕报道的不定芽诱导的数量，是其2-3倍；此外，本发明采用的是处于生长期的新鲜鳞茎作为外植体，省去了添加GA3的麻烦(因为GA3需要采用过滤灭菌，不可高温灭菌)，诱导率也较高，同时还可降低污染率。

[0080] 通过将实施例1-5进行比较，可以发现：实施例1的诱导率最高，说明诱导培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA比较适合黄花贝母外植体的诱导，MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA的诱导率次之。将实施例1和实施例6、7、8进行比较，可以发现：添加有2,4-D的增殖培养基的增殖率较高，且在0.1-1.0mg/L的范围内，随着浓度的增加，增殖效果越显著，而只添加有6-BA和NAA的增殖培养基，其增殖倍数相对较低，说明2,4-D对黄花贝母不定芽的增殖起重要作用。综上所述，最佳的诱导及增殖条件为实施例1中的叙述。

[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。