雷美替胺中的杂质化合物的制备方法及制备的标准品

摘要

本发明涉及制药领域，具体提供了雷美替胺原料中杂质式(I)或/和式(II)化合物的制备方法及制备的含式(I)或/和式(II)化合物的标准品。所述方法包括：1)将含有式(I)和/或(II)化合物的雷美替胺原料利用制备色谱法进行制备，所述色谱条件为：色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm；流动相：乙腈-水(45∶55)；流速：30ml/min；检测波长：225nm；分别收集上述式(I)(相对保留时间为0.5)和式(II)化合物的峰(相对保留时间为1.5)即得。

权利要求

1.式(I)或/和式(II)化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将含有式(I)和/或(II)化合物的雷美替胺原料利用制备色谱法进行制备，其中所述色谱条件为：色谱柱：kromasil C18 10μm 21.2×250mm流动相：乙腈:水＝40:60～50:50的混合溶液流速：25～35ml/min

检测波长：210nm～300nm

分别收集式(I)和/或式(II)化合物的峰的流份、即得；

其中，所述含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料采用如下方法制备：b)将雷美替胺原料置于80～200℃条件下放置30～240min的时间进行高温破坏，使其产生所述的一种或多种杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

2-1)将步骤1)中所得的式(I)化合物按照步骤1)中所述的色谱条件再次进行制备，然后收集上述式(I)化合物的峰的流份、即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

2-2)步骤将步骤1)中所得的式(Ⅱ)化合物再进行色谱制备法制备，其中制备式(II)化合物的色谱条件为：色谱柱：YMC C18ODS-AQ 10μm 10×250mm流动相：乙腈:水＝36:64的混合溶液流速：10ml/min

检测波长：225nm

收集式(II)化合物的峰的流份、即得。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中流动相为乙腈:水＝45:

55的混合溶液。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中流动相的流速为30ml/min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中检测波长为225nm。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

3)将步骤1)和/或步骤2-1)所得含有式(I)化合物的洗脱液，或步骤1)和/或步骤2-2)含有式(II)化合物的洗脱液，除去乙腈，水相用有机溶剂提取，所述用于提取的有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯或正己烷；然后除去有机溶剂、所得固体用有机溶剂进行纯化即得，所述用于纯化的有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、苯甲醇或其水溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，特征在于，所述方法进一步包括：含有式(Ⅰ)或(Ⅱ)化合物的洗脱液除去乙腈后、水相用二氯甲烷提取、然后将二氯甲烷蒸干，所得产物用乙腈水溶液溶解，置于室温下直至析出固体，过滤，即得，所述乙腈水溶液为90％的乙腈水溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中高温破坏温度是为100～180℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中放置时间为60～180min。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步可选择地包括对雷美替胺原料中的式(I)和/或式(II)化合物进行HPLC或LS-MS检测。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的HPLC和/或LC-MS色谱条件为：色谱柱：Hypersil GOLD 5μm 250×4.6mm洗脱剂A:0.1％甲酸溶液；洗脱剂B:乙腈

流速:0.8ml/min；

进样体积：20μL；

检测器：288nm(UV)/MS。

说明书

雷美替胺中的杂质化合物的制备方法及制备的标准品

技术领域

[0001] 本发明涉及制药领域，具体涉及一种雷美替胺的杂质化合物的制备方法及制备的标准品，以用于药品雷美替胺的质量分析和检验。

背景技术

[0002] 雷美替胺(Ramelteon)，化学名称为：N-[2-[(8S)-1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基]乙基]丙酰胺)，系日本武田公司(TAKEDA)开发的用于治疗难以入睡失眠症和慢性失眠、短期失眠的新分子药物，其分别于2005年和2008年先后在美国和日本上市。该药品为褪黑素受体激动剂，能模拟由松果体分泌的褪黑素的生理作用，有助于调节睡眠周期，改善睡眠质量。其对褪黑素受体的亲和力较强，对氨基丁酸受体、阿片受体等无亲和力，因此不会产生药物依赖性；对慢性失眠症、慢性原发性失眠症的老年患者疗效确切，且无后遗效应，不良反应与安慰剂相似。

[0003] 随着人们对用药安全要求的不断提高，对药品质量的要求也在不断地提升，特别是针对药品原料中的杂质需要进一步地明确和控制，因此、对药品原料中杂质的研究成了当前本领域技术人员研究的热点和重点。

[0004] 雷美替胺目前尚未在国内外药典中收载，且现有学术资料也尚未报道该药品原料中的有关杂质的制备方法、市场上没有相应杂质产品的销售。

[0005] R.Scott等人(Metabolism of Ramelteon in Human Liver Microsomes and Correlation with the Effect of Fluvoxamine on Ramelteon Pharmacokinetics，《Drug Metabolishm and Disposition》2010，vol 38，No.8，1381-1391)公开了式(I)化合物为雷美替胺在生物体内的代谢产物，而在实际研究中发现该化合物也是一种降解产物，在雷美替胺产品的制备或储存中同样会产生式(I)化合物的杂质。CN101056867A公开了在雷美替胺的制备过程中会产生式(II)化合物的杂质。

[0006]

[0007] 而式(I)和/或(II)化合物对于雷美替胺原料中杂质的相关研究意义重大，可用于雷美替胺生产过程中杂质的定性及定量分析，从而可以提高雷美替胺的质量标准，为人民群众安全用药提供重要的指导意义。

[0008] 但目前尚未有式(I)和/或式(II)化合物的制备分离方法的任何记载和报道，更未有作为分析对照使用的式(I)和/或式(II)化合物标准品的制备和销售。

[0009] 因此、提供一种式(I)和/或式(II)化合物的制备方法及相应的标准品是非常有必要的，这有利于推动雷美替胺药品质量标准的提高，可以进一步保障雷美替胺药品的用药安全。

发明内容

[0010] 针对以上情况，本发明提供了雷美替胺中杂质式(I)化合物或/和式(II)化合物的制备方法，及采用该方法制备的含杂质式(I)化合物或/和式(II)化合物的标准品。

[0011] 本发明所述式(I)或/和式(II)化合物的制备分离方法，其包括：

[0012]

[0013] 1)将含有式(I)和/或(II)化合物的雷美替胺原料利用制备色谱法进行制备，其中所述色谱条件为：

[0014] 色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm；

[0015] 流动相：乙腈∶水＝40∶60～50∶50的混合溶液；

[0016] 流速：25ml/min～35ml/min；

[0017] 检测波长：210nm～300nm；

[0018] 分别收集式(I)和式(II)化合物的峰的流份、即得。

[0019] 本发明方法中，所述“制备色谱”是指所述技术领域中的制备型高效液相色谱。

[0020] 作为实施方案之一，本发明方法所述步骤1)中的色谱柱包括但不限于kromasil C18 10μ21.2×250mm色谱柱；本领域技术人员还可以结合本发明及本领域技术常识，制备或市购与本发明方法所述色谱柱性质相同或相类似的色谱柱以替代本发明步骤1)中所述的色谱柱，例如包括但不限于Sepax HP-Cyano10μ21.2×250mm色谱柱。

[0021] 作为实施方案之一，本发明所述流动相为乙腈∶水＝45∶55的混合溶液；

[0022] 作为实施方案之一，本发明所述流动相的流速为30ml/min；

[0023] 作为实施方案之一，本发明所述检测波长为225nm；

[0024] 在上述色谱条件下，其中所述式(I)化合物的相对保留时间为0.5；式(II)化合物的相对保留时间为1.5。

[0025] 为了更好地实现本发明目的，免受进样量和破坏样品中其他杂质的干扰，同时避免制备纯品时耗时较长，成本较高、作为实施方案之一、本发明优选可以采用二次制备方法制备式(I)和/或(II)化合物，即可选择地，作为实施方案之一，本发明所述式(I)或/和式(II)化合物的制备分离方法进一步包括：

[0026] 2-1)将步骤1)中所得的式(I)化合物按照步骤1)中所述的色谱条件再次进行制备，然后收集上述式(I)化合物的峰的流份、即得；

[0027] 作为实施方案之一，所述(I)化合物再次制备的色谱条件为：

[0028] 色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm

[0029] 流动相：乙腈∶水＝45∶55的混合溶液

[0030] 流速：30ml/min

[0031] 检测波长：225nm

[0032] 收集上述式(I)化合物的峰的流份、即得；

[0033] 作为本发明实施方案之一，上述色谱条件下，式(I)化合物相对保留时间为约0.5。

[0034] 作为实施方案之一，本发明所述方法进一步包括：

[0035] 2-2)步骤将步骤1)中所得的式(II)化合物再进行色谱制备法制备，其中，所述制备式(II)化合物的色谱条件为：

[0036] 色谱柱：YMC C18ODS-AQ 10μ10×250mm

[0037] 流动相：乙腈∶水＝36∶64的混合溶液

[0038] 流速：10ml/min

[0039] 检测波长：225nm

[0040] 收集式(II)化合物的峰的流份、即得。

[0041] 作为本发明实施方案之一，式(II)化合物相对保留时间为约1.5。

[0042] 作为实施方案之一，本发明方法所述步骤2-2)中的色谱柱包括但不限于YMC C18ODS-AQ 10μ10×250mm色谱柱；本领域技术人员还可以结合本发明及本领域技术常识，制备或市购与本发明方法所述色谱柱性质相同或相类似的色谱柱以替代本发明步骤2-2)中所述的色谱柱，例如包括但不限于Sepax C18-P 10μ10×250mm。

[0043] 作为实施方案之一，本发明所述式(I)或/和式(II)化合物的制备分离方法进一步包括：

[0044] 3)将步骤1)和/或步骤2)所得含有式(I)或式(II)化合物的洗脱液，除去乙腈，水相用有机溶剂提取；然后除去有机溶剂、所得固体用有机溶剂进行纯化即得。

[0045] 作为本发明实施方案之一，所述用于提取水相的有机溶剂包括但不限于二氯甲烷、正己烷或乙酸乙酯、或它们的任意组合物；进一步优选为二氯甲烷；

[0046] 作为本发明实施方案之一，对所得固体进行纯化的有机溶剂包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇、苯甲醇或其水溶液；作为本发明实施方案之一，优选为90％的乙腈水溶液。

[0047] 作为本发明实施方案之一，所得含有式(I)或式(II)的洗脱液，蒸出乙腈，水相用二氯甲烷提取；然后将二氯甲烷蒸干、所得产物用90％乙腈的水溶液溶解置于室温下直至析出固体，过滤，即得。作为实施方式之一，可以置于室温下放置时间包括但不限于约12小时。

[0048] 本发明所述式(I)或/和式(II)化合物的制备法中，所述步骤1)中含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料的来源不受任何的限制，只要该雷美替胺原料中含有可以实现分离制备的含有式(I)或/和式(II)化合物的量都可以用于本发明的制备方法。

[0049] 作为实施方案之一，本发明方法所述步骤1)中含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料，包括但不限于采用如下方法制备：

[0050] a)将雷美替胺原料暴露于光照强度在4500±500lx的条件下一定时间(一般为5～30天)，使其产生所述的一种或多种杂质；

[0051] b)将雷美替胺原料置于高温条件下放置一定时间进行高温破坏，使其产生所述的一种或多种杂质；和/或

[0052] c)将雷美替胺原料与药用辅料混合后暴露于光照强度在4500±500lx的条件下一定时间(一般为5～30天)，使其产生所述的一种或多种杂质。

[0053] 作为本发明实施方案之一，所述步骤1)中含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料的制备方法中，高温破坏的温度可以是由本领域技术任何结合本发明内容及本领域常识进行确定，作为实施方案之一，所述步骤b)中的所述高温破坏的温度为80℃～200℃，优选100℃～180℃。

[0054] 作为本发明实施方案之一，所述步骤1)中含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料的制备方法中，高温破坏的时间可以是由本领域技术任何结合本发明内容及本领域常识进行确定，作为实施方案之一，所述步骤b)中的高温破坏时间为30～240min，优选60～180min。

[0055] 作为本发明实施方案之一，所述步骤1)中含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料的制备方法中，步骤c)中的辅料包括淀粉、乳糖、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、羟丙甲纤维素、共聚维酮、二氧化钛、三氧化铁、聚乙二醇8000，或它们的任意混合物。

[0056] 本发明方法中，在特定条件下，上述辅料与雷美替胺混合后能够提高所述杂质式(I)和/或式(II)化合物的含量，提高收率，而且不会对杂质式(I)和/或式(II)化合物的分离产生不利的影响。

[0057] 为了保证本发明方法中使用的含有式(I)或/和式(II)化合物的雷美替胺原料能够更好地实现本发明目的，在进行制备前，可以采用本领域常规的方法先对雷美替胺原料中的是否含有式(I)或/和式(II)化合物及它们的含量进行检测。

[0058] 作为实施方案之一，本发明方法可以包括但不限于采用HPLC或LS-MS对含有式(I)和/或式(II)化合物的雷美替胺原料进行检测。

[0059] 作为实施方案之一，本发明所述的HPLC和/或LC-MS色谱条件为：

[0060] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm

[0061] 洗脱剂A：0.1％甲酸溶液

[0062] 洗脱剂B：乙腈

[0063]

[0064] 流速：0.8ml/min

[0065] 进样体积：20μL

[0066] 检测器：288nm(UV)/MS。

[0067] 本发明的检测方法中，所述杂质式(I)化合物和式(II)化合物在HPLC或者HPLC-MS方法下相对保留时间分别为0.7和1.1。

[0068] 本发明还进一步提供了采用本发明方法制备的含有式(I)化合物的标准品，所述标准品为类白色物质，色谱纯度为60％～98％。

[0069] 作为实施方式之一，本发明更进一步提供了采用本发明方法制备的含有式(I)化合物的标准品，所述标准品为类白色物质，色谱纯度为为96.1～98.2％。。

[0070] 本发明还进一步提供了采用本发明方法制备的含有式(II)化合物的标准品，所述标准品为白色晶体，色谱纯度为85％～98％。

[0071] 作为实施方式之一，本发明更进一步提供了采用本发明方法制备的含有式(I)化合物的标准品，所述标准品为白色晶体，色谱纯度为96.5％～98.7％。

[0072] 本发明制备方法具有操作简单、原料易得、成本低廉、收率适合，可同时用于雷美替胺原料中杂质式(I)和式(II)化合物的制备。

[0073] 本发明制备方法所得的杂质式(I)、式(II)化合物的标准品可以用于雷美替胺药物中杂质的分析、检测，解决了目前尚未有作为分析对照使用的式(I)和/或式(II)化合物标准品的技术难题，从而提高并保障了雷美替胺药物的用药安全。

附图说明

[0074] 图1：实施例1中雷美替胺破坏样品HPLC图谱；

[0075] 图2：实施例1中雷美替胺以及目标杂质的UV图谱；

[0076] 图3：实施例1中杂质式(I)MS图谱；

[0077] 图4：实施例1中杂质式(II)MS图谱。

具体实施方式

[0078] 本发明通过以下实施例和实验例进一步阐述本发明，但本发明并不受限于此。

[0079] 实施例1

[0080] 步骤一、雷美替胺破坏样品的制备

[0081] 取雷美替胺原料(由珠海联邦制药股份有限公司制备，批号为140218)20克，置于160℃条件下放置2小时，使其产生所述杂质。

[0082] 步骤二、HPLC测定雷美替胺破坏样品

[0083] 高效液相色谱仪：岛津20A型HPLC(配备DAD检测器)；

[0084] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0085] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0086] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0087] 流速：0.8ml/min；

[0088] 进样体积：20μL；

[0089] 检测波长：288nm。

[0090] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰含量(面积归一化法计算)分别为13.1％和3.4％，目标杂质含量较高，可进行后续实验。

[0091] 步骤三、LC-MS测定雷美替胺破坏样品

[0092] 高效液相色谱仪：Agilent 1260型HPLC(配备Agilent 6120单四级杆检测器)；

[0093] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0094] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0095] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0096] 进样体积：20μL；

[0097] 流速：0.8ml/min，经分流进质谱。

[0098] 质谱条件为电喷雾电离源正离子(ESI+)检测方式；氮气流速：10L/min；雾化器压力：35psig；干燥气体温度：300℃；碰撞诱导解离常数：70。

[0099] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰分子量分别为273和257，与目标杂质分子量一致，可进行后续实验。

[0100] 步骤四、杂质式(I)化合物(简称“杂质1”)和式(II)化合物(简称“杂质2”)的制备第一次制备

[0101] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm，检测波长为225nm，流速为30ml/min，流动相为乙腈-水(45∶55)。将步骤一所得破坏样品用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集相对保留时间为0.5和1.5处的峰相对应的洗脱液，所得两组洗脱液分别置于50℃水浴中减压旋蒸将流动相中乙腈蒸出，所得水相分别用100ml二氯甲烷萃取两次，再将二氯甲烷蒸干，得到油状物，然后进行二次制备。

[0102] 第二次制备

[0103] 杂质1的制备

[0104] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm，检测波长为225nm，流速为30ml/min，流动相为乙腈-水(45∶55)。将第一次制备所得油状物(相对保留时间为0.5对应的流出物)用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集对应的洗脱液，置于50℃水浴中减压旋蒸，将乙腈蒸出，所得水相用100ml二氯甲烷萃取两次，再将二氯甲烷蒸干，所得产物用90％乙腈-水溶解，置于室温下放置12小时，过滤后得到类白色固体。经测定色谱纯度为98.2％(约250mg)，MS结果显示分子量与杂质1一致。

[0105] 杂质2的制备

[0106] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：YMC C18ODS-AQ 10μ10×250mm，检测波长为225nm，流速为10ml/min，流动相为乙腈-水(36∶64)。将第一次制备所得油状物(相对保留时间为1.5对应的流出物)用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集对应的洗脱液，置于50℃水浴中减压旋蒸，将乙腈蒸出，所得水相用100ml二氯甲烷萃取两次，再将二氯甲烷蒸干，所得产物用90％乙腈-水溶解，置于室温下放置12小时，过滤后得到白色晶体。经测定色谱纯度为98.7％(约150mg)，MS结果显示分子量与杂质2一致。

[0107] 步骤五、杂质1和杂质2的结构鉴定

[0108] 对所得的杂质采用LC-MS和核磁共振波谱法(1H-NMR、13C-NMR)进行结构确证，数据如下：

[0109] 杂质1的结构鉴定数据：

[0110] MS(ESI)：274.2[M+H]+

[0111] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.12～1.15(t，3H)，1.63～1.73(m，1H)，1.91(s，2H，H2O)，2.15～2.24(q，2H；m，1H)，2.39～2.44(q，1H)，2.83～2.90(q，1H)，3.17～3.24(m，
1H)，3.25～3.30(q，2H)，3.32～3.42(m，2H)，4.64～4.71(q，1H)，4.72～4.79(q，1H)，5.74(s，1H)，6.80～6.82(d，1H)，7.57～7.59(d，1H)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.78，
27.43，29.63，33.43，35.23，37.72，42.80，72.50，110.11，123.17，125.17，130.37，154.83，
166.49，174.01，203.64。

[0112] 杂质2的结构鉴定数据：

[0113] MS(ESI)：258.2[M+H]+

[0114] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.08～1.12(t，3H)，1.72～1.181(m，1H)，1.88～1.95(m，1H)，2.10～2.16(q，2H)，2.17～2.20(m，1H)，2.34～2.43(m，1H)，2.88～2.95(m，
1H)，3.00～3.08(m，1H)，3.36～3.40(q，2H)，3.42～3.49(m，1h)，5.48(s，1H)，6.76(d，1H)，
7.11～7.14(d，1H)，7.30～7.32(d，1H)，7.60(d，1H)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：
9.80，29.69，31.34，31.76，34.56，38.05，42.47，104.63，109.56，120.42，123.56，137.60，
138.63，145.06，154.72，173.67。

[0115] 实施例2

[0116] 步骤一、雷美替胺破坏样品的制备

[0117] 取雷美替胺原料(由珠海联邦制药股份有限公司制备，批号为140218)10克，置于180℃条件下放置3小时，使其产生所述杂质。

[0118] 步骤二、HPLC测定雷美替胺破坏样品

[0119] 高效液相色谱仪：岛津20A型HPLC(配备DAD检测器)；

[0120] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0121] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0122] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0123] 流速：0.8ml/min；

[0124] 进样体积：20μL；

[0125] 检测波长：288nm。

[0126] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰含量(面积归一化法计算)分别为13.7％和3.1％，目标杂质含量较高，可进行后续实验。

[0127] 步骤三、LC-MS测定雷美替胺破坏样品

[0128] 高效液相色谱仪：Agilent 1260型HPLC(配备Agilent 6120单四级杆检测器)；

[0129] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0130] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0131] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0132] 进样体积：20μL；

[0133] 流速：0.8ml/min，经分流进质谱。

[0134] 质谱条件为电喷雾电离源正离子(ESI+)检测方式；氮气流速：10L/min；雾化器压力：35psig；干燥气体温度：300℃；碰撞诱导解离常数：70。

[0135] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰分子量分别为273和257，与目标杂质分子量一致，可进行后续实验。

[0136] 步骤四、杂质式(I)化合物(简称“杂质1”)和式(II)化合物(简称“杂质2”)的制备[0137] 第一次制备

[0138] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：Sepax HP-Cyano 10μ21.2×250mm，检测波长为225nm，流速为35ml/min，流动相为乙腈-水(40∶60)。将步骤一所得破坏样品用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集相对保留时间为0.5和1.5处的峰相对应的洗脱液，所得两组洗脱液分别置于50℃水浴中减压旋蒸将流动相中乙腈蒸出，所得水相分别用100ml乙酸乙酯萃取两次，再将乙酸乙酯蒸干，得到油状物，然后进行二次制备。

[0139] 第二次制备

[0140] 杂质1的制备

[0141] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：Sepax HP-Cyano 10μ21.2×250mm，检测波长为225nm，流速为35ml/min，流动相为乙腈-水(40∶60)。将第一次制备所得油状物(相对保留时间为0.5对应的流出物)用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集对应的洗脱液，置于50℃水浴中减压旋蒸，将乙腈蒸出，所得水相用100ml乙酸乙酯萃取两次，再将乙酸乙酯蒸干，所得产物用90％甲醇-水溶解，置于室温下放置12小时，过滤后得到类白色固体。经测定色谱纯度为96.1％(约120mg)，MS结果显示分子量与杂质1一致。

[0142] 杂质2的制备

[0143] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：Sepax C18-P 10μ10×250mm，检测波长为225nm，流速为10ml/min，流动相为乙腈-水(36∶64)。将第一次制备所得油状物(相对保留时间为1.5对应的流出物)用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集对应的洗脱液，置于50℃水浴中减压旋蒸，将乙腈蒸出，所得水相用100ml乙酸乙酯萃取两次，再将乙酸乙酯蒸干，所得产物用90％甲醇-水溶解，置于室温下放置12小时，过滤后得到白色晶体。经测定色谱纯度为
96.5％(约60mg)，MS结果显示分子量与杂质2一致。

[0144] 实施例3

[0145] 步骤一、雷美替胺破坏样品的制备

[0146] 取雷美替胺原料(由珠海联邦制药股份有限公司制备，批号为140218)10克，置于140℃条件下放置1.5小时，使其产生所述杂质。

[0147] 步骤二、HPLC测定雷美替胺破坏样品

[0148] 高效液相色谱仪：岛津20A型HPLC(配备DAD检测器)；

[0149] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0150] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0151] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0152] 流速：0.8ml/min；

[0153] 进样体积：20μL；

[0154] 检测波长：288nm。

[0155] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰含量(面积归一化法计算)分别为13.0％和3.5％，目标杂质含量较高，可进行后续实验。

[0156] 步骤三、LC-MS测定雷美替胺破坏样品

[0157] 高效液相色谱仪：Agilent 1260型HPLC(配备Agilent 6120单四级杆检测器)；

[0158] 色谱柱：Hypersil GOLD 5μ250×4.6mm；

[0159] 流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；

[0160] 梯度：0min(A：90％、B：10％)、5min(A：90％、B：10％)、45min(A：40％、B：60％)、50min(A：10％、B：90％)、51min(A：90％、B：10％)、60min(A：90％、B：10％)；

[0161] 进样体积：20μL；

[0162] 流速：0.8ml/min，经分流进质谱。

[0163] 质谱条件为电喷雾电离源正离子(ESI+)检测方式；氮气流速：10L/min；雾化器压力：35psig；干燥气体温度：300℃；碰撞诱导解离常数：70。

[0164] 取上述破坏样品适量，用50％乙腈-水配制成含雷美替胺约2mg/ml的溶液，进样分析，结果显示样品中相对保留时间为0.7与1.1位置的色谱峰分子量分别为273和257，与目标杂质分子量一致，可进行后续实验。

[0165] 步骤四、杂质式(I)化合物(简称“杂质1”)和式(II)化合物(简称“杂质2”)的制备[0166] 仪器：汉邦科技NP2000，色谱柱：kromasil C18 10μ21.2×250mm，检测波长为225nm，流速为30ml/min，流动相为乙腈-水(45∶55)。

[0167] 将步骤一所得破坏样品用50％乙腈-水溶解，注入色谱仪，收集相对保留时间为0.5和1.5处的峰相对应的洗脱液，所得两组洗脱液分别置于50℃水浴中减压旋蒸将流动相中乙腈蒸出，所得水相分别用100ml二氯甲烷萃取两次，将二氯甲烷蒸干，在80℃真空干燥
24小时，得到两种黄褐色粉末。经测定杂质1色谱纯度为59.8％(约300mg)，杂质2色谱纯度为86.5％(约150mg)。

[0168] MS结果显示上述物质中主要成分与目标杂质分子量一致。