苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明的目的是提供一种高度特异性的苯妥因多克隆抗体及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法,包括苯妥因特异性多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物的制备，定标液的制备。本发明的苯妥因多克隆抗体特异性强，效价高，在药物交叉反应试验中，对测试的31种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检验苯妥因的血药浓度。本发明的苯妥因药物浓度均相酶免疫检验试剂盒灵敏度高，能够准确检测10g/mL的样本，苯妥因药物浓度的有效检测范围为5 ng/mL‑60μg/mL。本发明试剂盒的准确率高，回收率在90%以上，简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。

权利要求

1.一种苯妥因免疫原，其通过苯妥因衍生物与载体偶联获得，其结构式如式I所示：

（I）

式中，R为R为-O-CH2-NH-COO-，载体选自血清蛋白，血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。

2.一种抗苯妥因特异性多克隆抗体，其由权利要求1所述的苯妥因免疫原免疫宿主动物后生产而得到的，具体步骤如下：步骤a：苯妥因衍生物的活化：将苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、10 mM pH为 5.0 的磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于10mL0.2 M pH为 8.5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12 -16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。

3.一种含有权利要求2所述抗苯妥因特异性多克隆抗体的苯妥因均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有R1试剂、R2试剂、定标液；其中，所述R1试剂由以下组分组成：质量百分比为0.02-0.1%的苯妥因特异性多克隆抗体，55 mM/L 的Tris，质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白，145.4 mM/L 的NaCl，3 mM/L的MgCl2，2.02 g/L脱氢辅酶Ⅰ和0.86 g/L葡萄糖-6-磷酸，余量为水，pH值为8.0；所述R2试剂为质量体积比为0.03-0.25%的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原的Tris缓冲液，所述Tris缓冲液pH为8.2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120 mM Tris、质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白、145.4 mM NaCl、3 mM MgCl2；定标液为含有不同浓度苯妥因的空白血清。

说明书

苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医学检验领域，具体涉及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

[0002] 癫痫是一种常见的神经系统疾病,也是我国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症。目前,抗癫痫类药物仍然是控制癫痫发作的主要手段。传统的抗癫痫类药物苯妥因（结构式如下）治疗窗窄、个体差异大、疗效和毒性反应与血药浓度密切相关,临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度。因此，苯妥因血药浓度的监测对癫痫的诊断和治疗具有重要的临床指导意义。

[0003]

[0004] 苯妥因

[0005] 目前，国内外测定苯妥因血药浓度的方法主要是高效液相色谱（HPLC）、荧光偏振免疫分析（FPIA）、微粒酶免法、免疫比浊法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法。采用HPLC法，需要样本前处理，操作相对复杂、且检测成本昂贵；ELISA检测法灵敏度较高，但无法精确定量；荧光偏振免疫分析（FPIA）具有操作简单、灵敏度高等优点，但试剂成本高，不适合常规治疗药物的检测，阻碍个性化治疗的推广。

[0006] 专利CN2012101255333公开了一种苯妥因均相酶检测试剂盒用的抗苯妥因特异性抗体，其通过对苯妥因中苯环对位进行取代后与免疫原偶联而获得的，其苯妥因免疫原结构式如下：

[0007]

[0008] 美国专利US5306617及US5747352也公开了类似的苯妥因均相酶检测试剂盒用的抗苯妥因特异性抗体，其利用与苯妥因咪唑啉环上的一个氨基偶联的免疫原而获得的，其苯妥因免疫原结构式如下：

[0009]

[0010] 但是通过上述衍生方法制备的抗体不能够充分体现其整体免疫性，从而影响苯妥因均相酶检测试剂盒的灵敏度及特异性。

发明内容

[0011] 本发明的一个目的是提供一种苯妥因免疫原，其通过苯妥因衍生物与载体偶联获得，其结构式如式I所示：

[0012]

[0013] 式I

[0014] 式中，R为连接基团，载体为具有免疫原性的蛋白质。

[0015] R选自如下基团：-(CH2)n-COO-、-O-(CH2)n-COO-、-S-(CH2)n-COO- 或-O-(CH2)n-NH-COO- 等，n是1至20之间的整数。

[0016] 在本发明更进一步地实施方案中， R优选为-O-CH2-NH-COO-。载体优选为血清蛋白，血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；更优选为牛血清蛋白。

[0017] 本发明的另一个目的是提供一种抗苯妥因特异性多克隆抗体，其由所述苯妥因免疫原免疫宿主动物后生产而得到的。

[0018] 所述抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法为：

[0019] 步骤a：

[0020] 苯妥因衍生物的活化：将苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、10 mM pH为 5.0 的磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

[0021] 步骤b：抗原的偶联和纯化：将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于10mL0.2 M pH为 8.5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12 -16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

[0022] 步骤c：采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。

[0023] 优选的所述步骤a为：

[0024] 苯妥因衍生物的活化：将20 mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700 μL 纯二甲基酰胺、700 μL无水乙醇、1.4 mL 10 mM pH为 5.0 的磷酸钾缓冲液、80 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

[0025] 步骤b：抗原的偶联和纯化：将40 mg牛血清白蛋白溶解于10 mL0.2 M pH8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12 -16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

[0026] 优选的，所述步骤c为：用0.2 M的pH为 8.5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至1.0 mg/mL，然后用1.0 mL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2～3周后，再用1.0 mL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。

[0027] 本发明的另一个目的是提供一种苯妥因均相酶免疫检测试剂盒，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有R1试剂、R2试剂、定标液。

[0028] 所述R1试剂由以下组分组成：质量百分比为0.02-0.1%的苯妥因特异性多克隆抗体，55 mM/L 的Tris，质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白，145.4 mM/L 的NaCl，3 mM/L的MgCl2，2.02 g/L脱氢辅酶Ⅰ和0.86 g/L葡萄糖-6-磷酸，余量为水，pH值为8.0。

[0029] 所述R2试剂为质量体积比为0.03-0.25%的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原的Tris缓冲液，所述Tris缓冲液pH为8.2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120 mM Tris、质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白、145.4 mM NaCl、3 mM MgCl2；

[0030] 定标液为含有不同浓度苯妥因的空白血清。

[0031] 更进一步地，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：R1试剂的制备，R2试剂的制备，定标液的制备，

[0032] 所述R1试剂的制备为：在1LTris缓冲液中依次加入2.02 g脱氢辅酶Ⅰ和0.86g葡萄糖-6-磷酸，在室温下搅拌10分钟,所述Tris缓冲液pH为8.0，所述Tris缓冲液中各组分浓度为55mMTris、质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白、145.4 mM NaCl、3mM MgCl2，然后将步骤c中得到的苯妥因衍生物特异性多克隆抗体加入该溶液中，稀释比例为1：3000，得到R1试剂;

[0033] 所述R2试剂的制备为：

[0034] 步骤a、将30 mg葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24 mL 0.05 M的Tris缓冲液中，然后依次加入200-500 mg还原型辅酶Ⅰ、1.0-2.0 mL的卡必醇和2.0-6.0 mL的二甲基亚砜混匀；

[0035] 步骤b、将20 mg的苯妥因衍生物溶解于840 μL二甲基亚砜 和360 μL纯二甲基酰胺的混合溶液中，加入12 μL三丁胺和6 μL氯甲酸异丁酯，在2～8℃条件下搅拌30分钟；

[0036] 步骤c、将步骤a和步骤b得到的两种溶液混合，在2～8℃条件下搅拌过夜，得到偶联的酶标抗原，再进行G-25凝胶层析柱纯化得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物；

[0037] 步骤d、将步骤c中的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原稀释于Tris缓冲液中，稀释比例为1:1000，得到R2试剂；所述Tris缓冲液pH为8.2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120 mM Tris、质量体积百分比为0.1%的牛血清白蛋白、145.4 mM NaCl、3 mM MgCl2；

[0038] 定标液的制备为：将苯妥因校准品溶于空白血清中配制成。

[0039]  优选的，所述R1试剂的制备中的步骤c为：用0.2 M的pH8.5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至1.0 mg/mL，然后用1.0 mL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2～3周后，再用1.0 mL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。

[0040] 优选的，所述定标液的制备为将苯妥因校准品溶于空白血清中并配制成0μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL共6种系列浓度的定标液。

[0041] 本发明的有益效果为本发明的苯妥因特异性多克隆抗体的特异性强，效价高，在药物交叉反应试验中，对测试的32种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检验苯妥因的血药浓度。本发明的苯妥因药物浓度均相酶免疫检验试剂盒灵敏度高，能够准确检测1 ng/mL的标本，苯妥因药物浓度的有效检测范为5 ng/mL-60μg/mL。本发明试剂盒的准确率高，回收率在90%以上，简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。

具体实施方式

[0042] 本发明中的检验方法是一种均相酶免疫测定法，该检验的基本原理基于一种竞争反应，即液体样本中游离的苯妥因与偶联在葡萄糖六磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH）上的苯妥因衍生物竞争结合特异性抗体的位点。G6PDH-苯妥因衍生物偶联物是酶标半抗原，具有抗原和酶的活性，G6PDH-苯妥因衍生物偶联物可以被抗体识别。G6PDH既能够氧化磷酸葡萄糖脱氢，同时将氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）还原为NADH。这个过程导致吸光度的变化，可以在 340nm波长光源下被检测到。抗体与酶-苯妥因衍生物结合后，G6PDH的活性被抑制，液体样本中的苯妥因竞争性的取代与抗体结合的苯妥因酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使G6PDH恢复活性。因此，液体样本中苯妥因的含量越多，游离的G6PDH-苯妥因衍生物偶联物就越多，从而能得到更强的信号。

[0043] 本发明的要点是提供一种简便、快速、灵敏度高和全自动化的苯妥因药物浓度检测试剂盒和制备方法。本发明的核心技术为均相酶免疫检测方法，其中试剂和待测样品均为液相，测定过程中不存在分离步骤，样品与抗体反应后再加入标记的抗原进行反应。本发明的技术方案包括苯妥因免疫原的合成，抗苯妥因特异性抗体的制备，酶标偶联物的制备以及样本的测定。分别通过化学合成的方法制备出G6PDH-苯妥因偶联物和BSA-苯妥因免疫原，并由BSA-苯妥因免疫原免疫动物，制备出特异性的抗苯妥因多克隆抗体。将制备好的抗体和酶标偶联物配制成均相酶免疫试剂R1和R2，在全自动生化分析仪上进行苯妥因样本的测定。

[0044] 实施例1 苯妥因衍生物的制备

[0045] 步骤1）化合物3的合成：准确称取5.3g的化合物1和1.9g无水碳酸钾，将这两个化合物加入长颈瓶中；加入150mL DMF，超声15min 溶解化合物，加入5.0g化合物2，在55℃下搅拌72h，将溶液降至室温后过滤，用5mL DMF 溶解反应物，真空干燥，用150mL 浓碳酸氢钠溶液溶解残留物，经150mL EtOAc 萃取，得到的有机相加入硫酸钠进行干燥，粗提化合物用硅胶键合柱进行快速层析纯化，最后得到化合物3；

[0046] 化合物3的质谱分析表明：

[0047] ESI-MS：300.27[M+H]+

[0048] 元素分析：理论值/实测值，C(68.13/68.22)，H(5.79/5.72)，N(4.64/4.68)，O(21.44/21.38)。

[0049]

[0050] 步骤2）称取6.0g化合物3至100ml甲醇中，加入80mL2M NaOH溶液，液体逐渐由澄清的无色溶液变为白色沉淀，继续加入2M NaOH 溶液至溶液重新变为澄清的无色溶液，室温快速搅拌过夜，将该混合溶液浓缩，加150mL水溶解白色固体，用80mL甲基叔丁基醚洗涤两次，将该混合溶液浓缩并用4M盐酸酸化至水层pH值为2-3，用100mL EtOAc萃取两次，得到的有机相加入硫酸钠进行干燥，获得油状粗提化合物，用硅胶键合柱进行快速层析纯化粗提化合物，最后得到化合物4，把2.0g化合物4，0.8gKCN，6.0g(NH4)2CO3，5mL 水，35mL DMF，加热至120℃并保温120h，降温至室温，用100mL2.5M NaOH 溶解混合体，用80mL 乙醚洗涤两次，将该混合溶液用6N 盐酸酸化至水层pH 值为4-5，用100mL EtOAc 萃取两次，用盐水洗涤有机合成物，干燥，浓缩后获得油状粗提化合物，用硅胶键合柱进行快速层析纯化粗提化合物，最后得到白色固体的苯妥因衍生物（化合物5）；合成路线如下：

[0051]

[0052] 利用Bruker Avance III plus 300 MHz 对化合物5进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1HNMR(DMSO-d6, 300MHz): 12.15(s, 1H), 11.17 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 9.18(s, 1H), 7.27-7.33(m, 6H), 6.97(m, 2H),6.91 (s, 1H), 5.61 (s，2H)。

[0053] ESI-MS：342.27[M+H]+

[0054] 元素分析：理论值/实测值，C(59.88/59.82)，H(4.41/4.43)，N(12.36/12.31)，O(23.35/23.44)。

[0055] 实施例2

[0056] 苯妥因特异性多克隆抗体的制备：

[0057] a、苯妥因免疫抗原的合成

[0058] 1）苯妥因衍生物的活化，称取20 mg实施例1制备的苯妥因衍生物于小烧杯中，并依次加入700 μL纯二甲基酰胺（dimethylformamide，DMF）、700 μL无水乙醇、1.4 mL 10 mM的pH为 5.0的磷酸钾缓冲液、80 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10 mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide,Sulfo-NHS），将这些化学品在室温条件下搅拌溶解反应30 min；

[0059] 2）BSA溶液的制备，称取40 mg牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）并在室温条件下溶解于10 mL 0.2 M的pH8.5的磷酸缓冲液中；

[0060] 3）抗原的偶联和纯化， 将活化的苯妥因衍生物滴加到BSA溶液中，在2～8℃条件下搅拌过夜，得到抗原；并将偶联的抗原进行透析纯化。

[0061] b、采用常规方法制备抗体，大致步骤如下：

[0062] 用磷酸缓冲液将合成的苯妥因免疫抗原稀释至1.0 mg/mL，然后用1.0 mL的抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；2～3周后，再用1.0 mL 相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔四周一次，共两次，获得的抗体效价约为1：120000。

[0063] 实施例3

[0064] 苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备，包括以下步骤：苯妥因衍生物特异多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物的制备，定标液的制备，均相酶免疫试剂的制备和利用全自动生化分析仪进行样本测试

[0065] a、按实施例2的方法制备苯妥因特异性多克隆抗体。

[0066] b、苯妥因酶标抗原的制备

[0067] 1）称取30 mg 葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24 mL，0.05M Tris缓冲液中，然后依次加入200-500 mg NADH、1.0-2.0mL的卡必醇和2-6.0mL的二甲基亚砜混匀；

[0068] 2）将20 mg的实施例1制备的苯妥因衍生物溶解于840 μL二甲基亚砜 和360 μL DMF中， 加入12 μL三丁胺（tributylamine）和6 μL 氯甲酸异丁酯（isobutylchloroformate），在2～8℃条件下搅拌30 min；

[0069] 3）将上述两种溶液混合，在2～8℃条件下搅拌过夜，并将偶联的酶标抗原进行G-25凝胶层析柱纯化。

[0070] c、定标液的制备

[0071] 将苯妥因校准品溶于空白血清中并配制成0、2.5、5、10、20、40 μg/mL 共 6种系列浓度的定标液，定标液的工作体积为10-35μL。

[0072] d、均相酶免疫试剂的制备

[0073] 1)R1试剂的制备

[0074] 在1 LTris缓冲液（55 mMTris，0.1%BSA，145.4 mMNaCl，3 mMMgCl2，pH为8.0）中依次加入2.02 gNAD(辅脱氢酶Ⅰ)和0.86 gG6P(葡萄糖-6-磷酸)，在室温下搅拌10 min。然后将实施例1中苯妥因衍生物特异多克隆抗体制备中得到的抗体加入溶液中，稀释比例为1：3000。

[0075] 2）R2试剂的制备

[0076] 在1LTris缓冲液（120 mMTris，0.1%BSA，145.4 mMNaCl，3 mM MgCl2，pH8.2）中加入G6PDH—苯妥因衍生物酶标抗原，稀释比例为1:1000。

[0077] 然后加入100μL试剂R1和100μL试剂R2，采用两点速率法，检测主波长为340 nm、副波长为405 nm的吸光度变化率，建立并优化苯妥因均相酶免疫定标曲线，定标曲线的建立和优化在日立7180型全自动生化分析仪上完成。

[0078] e、利用全自动生化分析仪进行样本测试

[0079] 1)血清标本的收集,按照常规方法收集血清标本;

[0080] 2)根据日立7180型全自动生化仪的操作说明,打开仪器,进行仪器光密度检测和探针的清洗,检测仪器是否运行正常;

[0081] 3)仪器检测运行正常后,将试剂R1、R2依次放入R1、R2试剂仓,血清标本放入样品盘1(S1),将0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的苯妥因定标液放入样品盘2(S2)的指定位置;

[0082] 4)仪器在Stand by状态时,设定苯妥因的操作程序和检测参数,具体检测参数如表一:

[0083] 表一 血清中苯妥因药物浓度检测参数

[0084]检测方法 两点速率法
样本量 10-35 µL
T1 0分钟
T2 1.5分钟
试剂R1 100-200 µL
试剂R2 100-200 µL
测光点 21至31点
检测波长(主/副) 340/405 nm
定标类型 Logit-Log(4P)
定标液1 0 µg/mL
定标液2 2.5 µg/mL
定标液3 5 µg/mL
定标液4 10 µg/mL
定标液5 20 µg/mL
定标液6 40 µg/mL

[0085] 5)按照设定的检测参数,首先进行定标实验,建立苯妥因的定标曲线,然后根据建立的定标曲线,检测血清标本中苯妥因的浓度。

[0086] 6)检测血清标本中苯妥因的浓度，仪器将测得的吸光度变化率根据标准曲线换算成药物浓度，并由终端显示打印检测报告。

[0087] 实施例4

[0088] 实施例3制备的苯妥因检验试剂盒产品的检验实验

[0089] a、回收实验

[0090] 利用建立的苯妥因定标曲线，测定低(2.5μg/mL)、中(10μg/mL))、高(40μg/mL)三种浓度的苯妥因血清标本，每个标本重复测定5次。

[0091] 表二：苯妥因试剂盒的回收实验

[0092]测试(n=5) 低(2.5μg/mL) 中(10μg/mL) 高(40μg/mL)
平均值 2.52 9.89 39.57
回收率 100.80% 98.90% 98.92%
标准差 0.24 0.46 0.87
相关系数偏差 6.11% 5.43% 3.26%

[0093] b、药物干扰实验

[0094] 选取31种常用化合物和药物，调整其工作浓度为10.0 μg/mL，在日立7180型全自动生化分析仪上进行干扰试验测定，试验结果如表三所示：

[0095] 表三：苯妥因试剂盒的药物干扰实验

[0096]ID# 化合物名称 等价于苯妥因的浓度(μg/mL)
1 乙酰水杨酸 < 0.01
2 异戊巴比妥 < 0.01
3 氨苄青霉素 < 0.01
4 苯乙胺 < 0.01
5 咖啡因 < 0.01
6 甲氨二氮卓 < 0.01
7 氯丙嗪 < 0.01
8 氯氮卓 < 0.01
9 d-甲基苯丙胺 < 0.01
10 非诺洛芬 < 0.01
11 吉非贝齐 < 0.01
12 龙胆酸 < 0.01
13 二氢可待因酮 < 0.01
14 布洛芬 < 0.01
15 丙咪嗪 < 0.01
16 (L)-麻黄素 < 0.01
17 利多卡因 < 0.01
18 萘普生 < 0.01
19 烟酰胺 < 0.01
20 青霉素 < 0.01
21 苯肾上腺素 < 0.01
22 苯丙醇胺 < 0.01
23 普鲁卡因胺 < 0.01
24 普鲁卡因 < 0.01
25 奎尼丁 < 0.01
26 佐美酸 < 0.01
27 芽子碱甲基酯 < 0.01
28 芽子碱 < 0.01
29 安定 < 0.01
30 可替宁 < 0.01
31 反式-4-可替宁羧酸 < 0.01

[0097] 根据苯妥因均相酶免疫测定结果分 析，32 种常用化合物和药物对苯妥因的干扰非常小，说明本发明的抗体是抗苯妥因特异性抗体。

[0098] c、灵敏度实验

[0099] 将苯妥因标准品溶于空白血清中，系列稀释浓度为0、1、5ng/mL的样品，用苯妥因均相酶免疫检测试剂测定苯妥因的吸光度，重复测定5次，计算平均值和标准差。

[0100] 表四：苯妥因试剂盒的灵敏度试验

[0101]测试次数（n=5） 0ng/mL 1 ng/mL 5 ng/mL
平均值 0.0 0.14 0.64
标准差 0.0 0.02 0.08
平均值±SD 0.0±0.0 0.14±0.02 0.64±0.08
平均值±2SD 0.0±0.0 0.14±0.04 0.64±0.16

[0102] d、精密度实验

[0103] 表五 苯妥因试剂盒的精密度试验结果

[0104]

[0105] 对比试验

[0106] 为了说明本发明的苯妥因均相酶检测试剂盒的优越性，采用不同但结构与本发明结构类似的苯妥因衍生物，按照实施例1-32所述的方法制备相应的人工抗原、多克隆抗体及均相酶试剂盒，并对所制备的均相酶试剂盒进行实施例4所列出的实验，各对比例采用的苯妥因衍生物结构如下：

[0107]

[0108] 对比例1                    对比例2

[0109] 对比例3：来自专利文献CN201210125533的说明书第079段所示的化合物式III，