血浆中厦门霉素的定量检测以及其代谢物的定性检测方法转让专利
申请号 : CN201410714321.8
文献号 : CN104407084B
文献日 : 2016-03-02
发明人 : 徐岷涓 , 冯蕾 , 徐俊
申请人 : 上海交通大学
摘要 :
本发明公开了一种血浆中厦门霉素的定量检测以及其代谢物的定性检测方法；所述定量检测方法包括样品的制备和检测方法，样品制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中依次加入3倍体积的含有维拉帕米为内标的甲醇溶液，混匀；离心，收集上清，进行分析。所述定性检测中样品制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中加入10倍体积的甲醇-乙腈混合溶液，体积比为5∶3，离心，收集上清，进行分析。本发明的检测方法具有良好的专属性、精密度和准确度较高，线性范围较宽，适用于厦门霉素及类似苯并吡喃类化合物的体内药代动力学测定及代谢产物的分析。
权利要求 :
1.一种液相色谱串联MS/MS质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A的方法，包括样品的制备和检测方法，其特征在于，所述样品的制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中依次加入3倍体积的含有维拉帕米为内标的甲醇溶液，混匀；离心，收集上清，进行分析；
液相色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱，流动相包括流动相A：0.1％甲酸5mM甲酸铵水溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱条件：体积比为45％B～85％B在两分钟内连续梯度变化，流速为0.3毫升/分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正离子选择反应检测。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，质谱喷雾电压为3500V，厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为25eV。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的液相色谱串联MS/MS质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A的方法在厦门霉素A药代动力学评价中的用途。
5.一种超高效液相色谱串联Q-Tof串联质谱法定性检测血浆样本中厦门霉素A及其代谢产物的方法，包括样品的制备和检测方法，其特征在于，所述样品制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中加入10倍体积的甲醇-乙腈混合溶液，离心，收集上清，进行分析；
所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇、乙腈体积比为5:3；
液相色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱，流动相包括流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱条件：体积比为5％B～30％B在2分钟内进行连续梯度变化，30％B～60％B在2.5分钟内进行连续梯度变化，流速为0.4毫升/分钟。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正离子全扫描检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述代谢产物包括厦门霉素B、经甲酯化、双键氧化或羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，质谱喷雾电压为3000V，厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为20～30eV，厦门霉素B的碰撞诱导裂解电压为20～30eV,经甲酯化、双键氧化或羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物的碰撞诱导裂解电压为15～30eV。
说明书 :
血浆中厦门霉素的定量检测以及其代谢物的定性检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于药学领域，具体涉及在血浆中厦门霉素A、厦门霉素B及其相关苯并吡喃化合物的分析方法和在药代动力学中的应用。
背景技术
[0002] 目前，关于具有抗纤维化活性的苯并吡喃benzopyran类化合物，即厦门霉素A、B、C、D，已有一些文献报道，如日文专利[Kawamura，N.；Tsuji，E.；Watanabe，Y.；Tsuchihashi，K.；Takako，T.Benzopyran derivatives，their manufacture with Streptomyces species.and their use for treatment of asthma and rheumatoid arthritis.Daiichi Seiyaku Co.，Ltd.；Mercian Corp.：Kyoto，Japan，7March 2000.]和本申请人前期的工作文献[Xu，M.J.；Liu，X.J.；Zhao，Y.L.；Liu，D.；Xu，Z.H.；Lang，X.M.；Ao，P.；Lin，W.H.；Yang，S.L.；Zhang，Z.G.；Xu，J.，Identification and characterization of an anti-fibrotic benzopyran compound isolated from mangrove-derived Streptomyces xiamenensis.Mar Drugs 2012，10，(3)，639-54；Liu，X.J.；Xu，M.J.；Fan，S.T.；Wu，Z.；Li，J.；Yang，X.M.；Wang，Y.H.；Xu，J.；Zhang，Z.G.，Xiamenmycin attenuates hypertrophic scars by suppressing local inflammation and the effects of mechanical stress.J Invest Dermatol 2013，133，(5)，1351-60；Yang，Y.；Fu，L.；Zhang，J.；Hu，L.；Xu，M.；Xu，J.Characterization of the xiamenmycin biosynthesis gene cluster in Streptomyces xiamenensis318.PloS one 2014，9，e99537.]中，曾报道了厦门霉素A-D的提取分离、结构鉴定、以及厦门霉素生物合成途径，并报道了其具有抗炎、抗肺纤维化和抗增生性瘢痕活性，是一类抗纤维化的活性先导化合物。
[0003] 针对厦门霉素的进一步药学研究，特别是体内药代动力学特性的研究，对于该类先导化合物的成药性非常重要，因此亟需建立一套定量分析厦门霉素A，即母药，的定量方法。同时，还需要对于厦门霉素A进入体内后的代谢物，如厦门霉素B，即代谢物，的定性分析的方法。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一套液相色谱串联质谱MS/MS的方法，定量检测血浆样本中厦门霉素A。同时提供一套超高效液相串联qTOF质谱的方法，定性检测血浆样本中，厦门霉素A的代谢产物，厦门霉素B及相关苯并吡喃类化合物的方法。
[0005] 本发明目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 第一方面，本发明涉及一种液相色谱串联MS/MS质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A的方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测方法：
[0007] 步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中依次加入3倍体积的含有维拉帕米为内标的甲醇溶液，并混匀；离心，收集上清，进行分析。通过该方法可以有效提取血样中的厦门霉素A。
[0008] 步骤(2)检测时液相色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱，流动相为流动相A：0.1％(体积百分比浓度)甲酸5mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱条件：体积比为45％B～85％B在两分钟内连续梯度变化，流速为0.3毫升/分钟。45％B～85％B指的是，流动相A、B的起始体积比为55∶45，终体积比为15∶85。更优选梯度洗脱条件为：
0min、45％B，2min、85％B，2.8min、85％B，2.9min、45％B，4.5min、45％B；流速为0.3毫升/分钟。通过摸索多种色谱条件意外发现，该色谱条件能够将厦门霉素A与其他血样中的杂质分离，定量数据准确。
0min、45％B，2min、85％B，2.8min、85％B，2.9min、45％B，4.5min、45％B；流速为0.3毫升/分钟。通过摸索多种色谱条件意外发现，该色谱条件能够将厦门霉素A与其他血样中的杂质分离，定量数据准确。
[0009] 优选的，质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正离子选择反应检测。该方法具有灵敏度高，线性范围宽，简单易行的特点。
[0010] 优选的，质谱喷雾电压为3500V，厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为25eV。
[0011] 第二方面，本发明还涉及本发明的液相色谱串联MS/MS质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A的方法在厦门霉素A药代动力学评价中的用途。
[0012] 第三方面，本发明还涉及一种超高效液相色谱Q-Tof串联质谱法定性检测血浆样本中厦门霉素A及其代谢产物的方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测方法：
[0013] 步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：向待测样品中依次加入10倍体积的甲醇-乙腈混合溶液，所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇、乙腈体积比为5∶3，离心，收集上清，进行分析。通过该方法可以有效提取血样中的厦门霉素类化合物。
[0014] 步骤(2)检测液相色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱，流动相为流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％(甲酸的体积百分比浓度)甲酸乙腈，梯度洗脱条件：体积比为5％B～30％B在2分钟内进行连续梯度变化，30％B～60％B在2.5分钟内进行连续梯度变化，流速为0.4毫升/分钟。其中，5％B～30％B指的是，第一阶段洗脱中，流动相A、B的起始体积比为95∶5，终体积比为70∶30，30％B～60％B指的是，第二阶段洗脱中，流动相A、B的起始体积比为70∶30，终体积比为40∶60。更优选梯度洗脱条件：0min、5％B，2min、30％B，4.5min、60％B，12min、100％B；流速为0.4毫升/分钟。通过摸索多种色谱条件发现，该色谱条件能够将厦门霉素A、厦门霉素B及经甲酯化、双键氧化、羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物进行比较清晰的分离，适用于多种厦门霉素衍生物的检测。
[0015] 优选的，质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正离子全扫描检测。同时也对于负离子条件进行了摸索，发现正离子条件更加容易质子化，厦门霉素类化合物碎裂规律明确，是检测类似代谢产物的最佳离子化条件。质谱检测条件分别比较了正、负离子两种扫描模式，发现厦门霉素A、B及血样中的代谢产物在电喷雾源正离子模式下响应强度高于负离子模式。
[0016] 优选的，所述代谢产物包括厦门霉素B、经甲酯化、双键氧化或羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物。
[0017] 优选的，质谱喷雾电压为3000V，厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为20～30eV，厦门霉素B的碰撞诱导裂解电压为20～30eV，其余代谢产物(经甲酯化、双键氧化或羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物)的碰撞诱导裂解电压为15～30eV。
[0018] 本发明具有如下的有益效果：
[0019] 1、本发明建立了一种液相色谱串联MS/MS质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A的方法，能够快速的定量厦门霉素A在体内的血药浓度；
[0020] 2、本发明建立了一种超高效液相色谱串联QTof质谱法定量检测血浆样本中厦门霉素A、厦门霉素B及相关苯并吡喃类代谢产物的方法，能够快速的分析厦门霉素A在体内的代谢产物；
[0021] 3、通过本发明的定量及定性检测方法，发现厦门霉素A的药代动力学特性，吸收快，具有良好的市场应用和推广前景。
附图说明
[0022] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0023] 图1为本发明的厦门霉素A在血浆中标准曲线图；
[0024] 图2为厦门霉素A血浆中浓度-时间曲线图；
[0025] 图3为厦门霉素A在体内代谢后血浆中代谢产物的分析图；
[0026] 图4为厦门霉素A在体内代谢后血浆中代谢产物的规律图。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0028] 实施例1、厦门霉素A的标准曲线的建立及质量控制
[0029] 标准曲线的配制：实际称取2.45mg厦门霉素A，1.225mL100％DMSO溶解，涡旋使之充分溶解至澄清状态，配制成储备液(2mg/mL)。从储备液吸取100ul至EP管中，加入甲醇1900ul配制成100ug/ml工作液，涡旋混匀，再分别从此工作液中吸取100、200、400、500ul至EP管中，分别加入900、800、600、500ul甲醇，涡旋混匀，配制成浓度为10、20、40、50ug/ml的工作液，分别从10、20、50ug/ml的工作液中各取100ul至EP管中，分别加入900ul甲醇，涡旋混匀，得100、200、500ng/ml工作液，按此法依次稀释，最终获得浓度为10、20、50、100、
200、500、1000、2000、5000、10000、20000、40000、50000ng/ml的工作液。配制标准曲线时，分别取不同浓度工作液各3ul，加入27ul空白小鼠血浆，涡旋混匀，得浓度为1、2、10、50、100、
200、500、1000、2000、5000ng/ml的标准含药血浆，按前处理方法处理，进样分析获得标准曲线。20、2000、40000ng/ml工作液用于随行质量控制。
200、500、1000、2000、5000、10000、20000、40000、50000ng/ml的工作液。配制标准曲线时，分别取不同浓度工作液各3ul，加入27ul空白小鼠血浆，涡旋混匀，得浓度为1、2、10、50、100、
200、500、1000、2000、5000ng/ml的标准含药血浆，按前处理方法处理，进样分析获得标准曲线。20、2000、40000ng/ml工作液用于随行质量控制。
[0030] 厦门霉素A在血浆中的标准曲线数据见表1，As代表待测化合物的峰面积，Ai代表内标峰面积，f表示相对峰面积，标准曲线见图1。
[0031] 表1厦门霉素A在血浆中的标准曲线
[0032]
[0033] 厦门霉素A质量控制结果见表2：
[0034] 表2厦门霉素A在血浆中的QC准确度％
[0035]ng/mL 1 2 3 Mean
2 117 104 110.5
200 92.7 96.1 94.4 94.4
4000 110 112 107 109.7
2 117 104 110.5
200 92.7 96.1 94.4 94.4
4000 110 112 107 109.7
[0036] 由QC结果可见，整个测定过程准确可靠。
[0037] 实施例2、厦门霉素A的药代动力学特性
[0038] 样品配制：实际称取5.95mg厦门霉素A。按此重量，向瓶中加入30μL DMSO，超声振荡使油状固体充分溶解，转移至4mL离心管中，再向瓶中分3次加入纯水，荡洗后合并于离心管中，共补纯水体积2.945mL，终体积为2.975mL，获得浓度为2mg/mL的药液(含1％DMSO)。药液体系为半透明均匀液体。由于药品为油状且量少，因此以标准曲线的浓度为标准，对给药样品的浓度进行了校准。将给药后剩余的给药药液稀释后，与标准曲线下同浓度的稀释液进行峰面积的比较，发现给药药液为标准曲线中色谱峰的72％。以此比例折算，配制药液的最终浓度为1.45mg/mL，折算剂量0.145mg/只动物。
[0039] 样品的收集：18只小鼠(C57小鼠，体重：15-18g，性别：雌性)食物、给水：饲养、给药期间自由进水，取血前12小时开始禁食，给药4h给食。随机编为A-F共6组，每组3只，采用尾静脉注射给药和腹腔注射给药两种方式，按0.1mL/只动物给药。A、D组采集给药前0h，给药后30min、4h、24h点；B、E组采集采集给药后5min、1h、6h点；C、F组采集采集给药后15min、2h、8h点，合并绘制药时曲线。每个时间点采集血样约0.1-0.2mL至肝素化Eppendorf管中，置于碎冰中直至离心。全血经离心后收集血浆，转移血浆至96孔板中，于-20℃保存至LC-MS/MS检测。经初步考证，200ng/mL含药血浆室温放置4h未见明显降解。
[0040] 样品前处理方法：30μL血样加入90μL含5ng/mL维拉帕米的甲醇，涡旋3min，15000rpm离心5min，取上清100μL至进样小瓶，进样分析。
[0041] 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C8 Narrow Bore EE2.1×100mm3.5μm；流动相A：0.1％甲酸5mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；流速0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃，梯度洗脱条件：0min、45％B，2min、85％B，2.8min、85％B，2.9min、45％B，4.5min、45％B。
[0042] 质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正离子选择反应检测。
[0043] 质谱条件：检测离子对的分子量为厦门霉素A392.2→273.2；维拉帕米(内标)455.2→165.1；离子源参数：雾化气温度350℃；雾化气流量7L/min；毛细管电压(即质谱喷雾电压)3500V；锥孔电压35V。厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为25eV。
[0044] 定量方法的验证：该实验中采用的定量方法为实施例1中的定量方法，定量下限为1ng/mL。同时还对于基质效应进行了考察。其中试验组(jz1)：取30μL血样加入90μL甲醇，涡旋3min，15000rpm离心5min，将上清全部转移至预先加有厦门霉素A和内标的EP管中，涡旋1min，进样分析。对照组(jz0)：取30μL纯水加入90μL甲醇，涡旋3min，15000rpm离心5min，将上清全部转移至预先加有厦门霉素A和内标的EP管中，涡旋1min，进样分析，如下表3：
[0045] 表3基质效应考察
[0046]
[0047] 由表3可知该方法能够满足基质效应的要求，能够对小鼠血浆中的厦门霉素A的浓度进行准确的定量。
[0048] 小鼠经静脉给药(i.v.)及腹腔给药(i.p.)给药厦门霉素A后，测得血浆中厦门霉素A的浓度-时间数据列于表4和表5，小鼠经i.p.给药厦门霉素A后的血药浓度曲线见图2，由图2可知，腹腔注射后厦门霉素A可迅速完全吸收，给药后5min(第1个采血点)即达到峰值。与静注后药时曲线的最大不同在于在腹腔注射给药后2-6h，药时曲线处于平台期，浓度维持在10-30ng/mL左右，这可能与样本来自于不同个体有关。两种给药方式给药后，厦门霉素A均较快从血中消除，给药后1小时血药浓度即降至100ng/mL左右，之后消除较缓慢。
[0049] 表4小鼠i.v.厦门霉素A0.145mg/只后血浆中浓度-时间数据(ng/mL)
[0050]
[0051] BQL：低于定量下限
[0052] 表5小鼠i.p.厦门霉素A0.145mg/只后血浆中浓度-时间数据(ng/mL)
[0053]
[0054] BQL：低于定量下限
[0055] 采用WinNonlin5.2软件，按统计矩理论分别求算i.v./i.p.厦门霉素A后各时间点浓度均值的相关药动学参数，详见表6。经血浆药物浓度-时间曲线面积(AUC)估算厦门霉素Ai.p.给药后的绝对生物利用度为102.6％。由末端相计算的消除半衰期可达5小时以上；但全局参数平均滞留时间(MRT)提示厦门霉素A在体内的消除仍属于较快水平。具体药代动力学参数末端消除相半衰期HL_Lambda_z、血药浓度达峰时间Tmax、血药浓度达峰值Cmax、血浆药物浓度-时间曲线面积AUClast、表观分布容积Vz_F_obs、表观清除率Cl_F_obs、平均滞留时间MRTlast见表6。
[0056] 表6小鼠i.v./i.p.厦门霉素A0.145mg/只后药代动力学参数
[0057]
[0058] 实施例3、厦门霉素A的代谢产物分析
[0059] 样品前处理方法：20μL血样加入200μL甲醇-乙腈混合溶液，体积比为5∶3，涡旋3min，15000rpm离心5min，取上清100μL至进样小瓶，进样分析。
[0060] 色谱柱：ACQUITY BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈；流速0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：45℃，梯度洗脱条件：梯度洗脱条件：0min、5％B，2min、30％B，4.5min、60％B，12min、100％B。
[0061] 质谱条件：采用电喷雾离子化源，正离子模式离子全扫瞄范围：100～1000amu，扫描速度0.25s。离子源参数：雾化气温度350℃；雾化气流量600h/L；毛细管电压(即质谱喷雾电压)3000V；锥孔电压35V。厦门霉素A的碰撞诱导裂解电压为20～30eV，厦门霉素B的碰撞诱导裂解电压为20～30eV，其余代谢产物(经甲酯化、双键氧化或羧基还原后的苯并吡喃类代谢产物)的碰撞诱导裂解电压为15～30eV。
[0062] 定性方法的验证：通过高分辨质谱的指认，所有精确分子量的误差范围在3mDa之内，同时根据厦门霉素二级质谱的裂解规律对各代谢产物的二级碎裂峰进行分析，确认化合物的结构类型。其中代谢产物M3的鉴定是以厦门霉素B标准品进行对照。
[0063] 厦门霉素A在血浆中检测出的代谢产物质谱提取离子流叠加图，见图3。对于其中代谢产物的代谢规律图，如图4所示。其中M3为厦门霉素B，是主要的代谢产物，M3’与M3”分别是厦门霉素B的同分异构体，M1为厦门霉素A中双键氧化的产物，M1’为厦门霉素A的同分异构体，M2为厦门霉素B中羧基被还原的产物，M4为厦门霉素B经过甲基化的产物。
[0064] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。