肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备及应用

摘要

本发明涉及一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒及其制备和应用，包括以下物质：（1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；（2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；（3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。本发明可以检测不同来源样本中的EV71抗原，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。本发明的检测方法可用于肠道病毒71型的血清流行病学调查、临床辅助诊断以及EV71病毒的复制调控、抗病毒治疗药物筛选等科研领域。

权利要求

1.一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）制备三种EV71单克隆抗体：用原核表达纯化的EV71 VP1蛋白免疫BALB/c 小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备若干株杂交瘤细胞，进行细胞培养后收集培养液，然后用免疫印迹方法筛选出三株特异性敏感性均较高的三株，进行层析纯化后浓缩并冻干，-80℃保存备用；

（2）pET-28a-VP1的构建及蛋白表达纯化：把EV71-C4标准株的VP1基因克隆入原核表达载体pET-28a，BL21大肠杆菌中进行原核表达EV71病毒VP1蛋白，Ni柱进行亲和纯化，-80℃保存备用；

（3）羧化乳胶凝集方法的建立：通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上，遵循固定其它条件，改换其中一个条件的原则，摸索偶联蛋白量，偶联时间，胶乳浓度，选择偶联反应终止剂和封闭剂；

所述碳化二亚胺的工作液浓度为1.0-2.3%，碳化二亚胺的反应终浓度为60-80μl，碳化二亚胺的反应时间为2.5-3小时；

所述的偶联蛋白量为20-70ug，偶联时间为4.5-9.6小时，所述的乳胶浓度为110-

180ul；

所述的偶联反应终止剂为20-60μl的0.1M乙醇胺溶液加入1-2mlpH8.0硼酸缓冲液悬浮的乳胶溶液中制得；

（4）肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒的组装：将制备好的致敏乳胶、阴阳性对照、载玻片和胶棒组装成检测试剂盒；

所述肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒由以下物质组成：

（1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；

（2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；

（3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。

2.如权利要求1所述肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上的具体步骤为：（a）取羧化胶乳放入离心管中，用pH9.6的碳酸缓冲液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸缓冲液洗3遍；

（b）加入水溶性碳化二亚胺在pH4.5的磷酸缓冲液中室温作用3h；

（c）用pH8.0硼酸缓冲液洗3遍；

（d）在胶乳悬液中加入VP1蛋白质抗原或混合单抗，摇床上感作6小时后，将胶乳抗体检测试剂悬浮于贮存液中。

3.如权利要求1所述肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备后，对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期进行了测定和优化。

4.如权利要求1所述肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒在检测肠道病毒71型抗原和抗体中的应用。

说明书

肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备及应用

技术领域

[0001] 本发明属于病原生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。

[0003] 手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox，A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型)、埃可病毒(Echo) 和EV71引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例较为常见。我国自1981年在上海始见本病，之后多个省市区均有报道。2008年5月2日我国正式将手足口病列为丙类传染病进行法定传染病管理。

[0004] 病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症。患儿感染EV71后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分重症患者病情进展较快，甚至死亡。患者主要为学龄前儿童，尤以3 岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71 感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较高。同时，由于肠道病毒传染性强，易引起暴发或流行。加强对EV71 感染的防控，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。

[0005] 目前对于EV71感染性疾病尚无特效的药物，主要采用对症及支持治疗，积极防止并发症发生。加强疾病及病原的监测、准确及时处置疫情、展开健康教育等是控制EV71流行的关键。EV71疫苗正在开发当中，将成为预防的关键。对人群特别是婴幼儿群体的EV71的血清流行病学状态和规律进行研究，可为手足口病的免疫规划的制订提供数据参考。因此EV71的抗体快速检测试剂盒的开发显得尤为必要。

[0006] 而相关疫苗的开发及病毒抗原快速检测试剂盒的研制则是预防控制该病的关键。目前检测肠道病毒之方式除了传统的病毒培养鉴定法外，国内已有生物科技公司利用生物芯片技术研发出“肠道病毒鉴定芯片”（EV typing chip），可快速检测出肠病毒之型别，不致延误病患就诊治疗的首要时机。因肠道病毒鉴定芯片感染易引起并发症，且往往在一星期内即转成重症，所以若能提早确知所感染的病毒类型，即可掌握对症治疗的第一时间。肠道病毒鉴定芯片鉴定芯片主要是针对并发症较严重之EV71、Cox A15、Cox A16及Cox B3等几型肠道病毒鉴定芯片所设计出的生物芯片，利用肠道病毒鉴定芯片的特定基因序列来鉴别肠道病毒鉴定芯片的类型。在我国公共卫生系统，出现手足口症状的患儿样本，咽拭子或肛拭子采样后，用探针标记的Real-time PCR进行肠道病毒检测。

[0007] 目前已经研发出针对肠道病毒IgG、IgM抗体以及检测病毒病毒粒子的的ELISA试剂盒。中国医学科学院医学生物学研究所公开了“EV71型病毒抗原的检测方法”专利（申请号200910094972.0），该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71 抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了“EV71 病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利（申请号200910131382.0），该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，价格昂贵，操作步骤繁琐费时，且需要洗板机，排枪，酶标记等昂贵仪器，不适合在普通的乡镇医疗机构推广使用。湖南康润药业有限公司公开了“肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用”专利（申请号
201210151666.8），该专利是采用胶体金标记的方法来检测EV71抗体，方法简单快捷，但是成本高，不利于大规模的血清流行病学调查结果。

发明内容

[0008] 针对现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于检测肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒及其制备和应用，本发明基于羧化乳胶颗粒为载体，通过碳化二亚胺把目的蛋白或者抗体偶联到乳胶颗粒上，用于检测肠道病毒71型。

[0009] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

[0010] 一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒，由以下物质组成：

[0011] （1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；

[0012] （2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；

[0013] （3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS

[0014] 和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。

[0015] 一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

[0016] （1）制备三种EV71单克隆抗体：用原核表达纯化的EV71 VP1蛋白免疫BALB/c 小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备若干株杂交瘤细胞，进行细胞培养后收集培养液，然后用免疫印迹方法筛选出三株特异性敏感性均较高的三株，进行层析纯化后浓缩并冻干，-80℃保存备用；

[0017] （2）pET-28a-VP1的构建及蛋白表达纯化：把EV71-C4标准株的VP1基因克隆入原核表达载体pET-28a，BL21大肠杆菌中进行原核表达EV71病毒VP1蛋白，Ni柱进行亲和纯化，-80℃保存备用；

[0018] （3）羧化乳胶凝集方法的建立：通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上，遵循固定其它条件，改换其中一个条件的原则，摸索偶联蛋白量，偶联时间，胶乳浓度，选择偶联反应终止剂和封闭剂；

[0019] 所述碳化二亚胺的工作液浓度为1.0-2.3%，碳化二亚胺的反应终浓度为60-80μl，碳化二亚胺的反应时间为2.5-3小时；

[0020] 所述的偶联蛋白量为20-70ug，偶联时间为4.5-9.6小时，所述的乳胶浓度为110-180ul；

[0021] 所述的偶联反应终止剂为20-60μl的0.1M乙醇胺溶液加入1-2mlpH8.0硼酸缓冲液悬浮的乳胶溶液中制得；

[0022] （4）肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒的组装：将上述制备好的致敏乳胶、阴阳性对照、载玻片和胶棒组装成检测试剂盒。

[0023] 所述步骤（3）中通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上的具体步骤为：

[0024] （a）取羧化胶乳放入离心管中，用pH9.6的碳酸缓冲液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸缓冲液洗3遍；

[0025] （b）加入水溶性碳化二亚胺在pH4.5的磷酸缓冲液中室温作用3h；

[0026] （c）用pH8.0硼酸缓冲液洗3遍；

[0027] （d）在胶乳悬液中加入VP1蛋白质抗原或混合单抗，摇床上感作6小时后，将胶乳抗体检测试剂悬浮于贮存液中。

[0028] 所述的肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备后，对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期等进行了测定和优化。

[0029] 一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒在检测肠道病毒71型抗原和抗体中的应用。

[0030] 本发明的原理是：采用三株EV71单克隆抗体或原核表达纯化的VP1蛋白通过EDC偶联，致敏羧化乳胶，采用抗原抗体反应并发生凝集的原理检测样品中的EV71抗原和抗体。

[0031] 本发明有益效果是：本发明的肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测方法操作简单、快捷、价格低廉且无需应用专业仪器设备，适于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断，尤其适应于普通的乡镇医疗机构推广使用。同时，本方法无需携带标记的二抗，直接进行抗原抗体的凝集反应，因此不仅可以检测人源抗体还可以检测动物源抗体，如小鼠，兔子等实验动物来源的血样。因此可以广泛应用于科研实验中的相关动物实验。

[0032] 本发明不仅可以检测人源性血清中的抗EV71的IgG，还适应于动物源性的血清。抗原检测试剂盒可以检测不同来源样本中的EV71抗原。由于采用了共价偶联的技术，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。同时，采用VP1蛋白作为抗原，与全病毒相比使该方法具有更高的生物安全性。本发明建立的检测方法可用于肠道病毒71 型的血清流行病学调查、临床辅助诊断以及EV71病毒的复制调控、抗病毒治疗药物筛选等科研领域。

附图说明

[0033] 图1为超声波破碎后初步纯化的VP1蛋白聚丙烯酰胺电泳；

[0034] 图2为Ni柱进行亲和纯化的VP1蛋白聚丙烯酰胺电泳；

[0035] 图3为Western-blot检测VP1蛋白；

[0036] 图4为羧化乳胶微球羧基基团和碳化二亚胺以化学键连接；

[0037] 图5为乳胶凝集抗体检测试剂盒检测不同来源血清样本中的抗EV71 VP1抗体；

[0038] 图6为EV71病毒在VERO细胞上产生细胞病变；

[0039] 图7为乳胶凝集抗原检测试剂盒检测VP1蛋白和病毒培养上清，其中原液为2MOI。

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

[0041] 实施例1

[0042] EV71 单克隆抗体的制备

[0043] 本产品的关键原料为EV71单克隆抗体和VP1纯化蛋白，二者的研发及制备地点均为中国科学院武汉病毒研究所。

[0044] EV71单克隆抗体制备：用原核表达纯化的EV71 VP1蛋白，分别免疫BALB/c小鼠，常规杂交瘤细胞技术进行细胞融合，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价，筛选出具有抗EV71 抗体高分泌性、高亲合力的杂交瘤细胞作为原始细胞株准备投入生产，液氮中存放保存。将按上述方法筛选得到的细胞种子从-173℃液氮罐中取出，尽快融化，在37℃培养获得一级种子液，同样条件培养得二级种子液，然后将种子液移至细胞培养缸中，于37℃的二氧化培养箱中培养，收集培养液。上述培养液通过离心后获取上清液，再经膜分离系统过滤，收集到的上清液即为含EV71单抗的粗提物。将粗提物分别经过亲和层析，收集抗体，再经浓缩管浓缩至规定浓度。配制的2种包含不同EV71核心位置的抗体溶液，分别灌装、冻干成冻干管，-80℃保存备用。生产时其中一种用于胶体金标记蛋白的制备，另一种用于包被于硝酸纤维膜上。

[0045] 实施例2

[0046] EV71 VP1纯化蛋白的生产，即把EV71-C4标准株的VP1基因克隆入原核表达载体pET-28a，BL21大肠杆菌中进行原核表达EV71病毒VP1蛋白，Ni柱进行亲和纯化：如图1-图3所示，在平板上选择阳性菌落接种于卡那平板上，37℃振荡培养至OD600约等于0.6时加IPTG至终浓度为0.4mM, 继续培养3h，无菌条件下取1ml菌液样本，10000r/min离心1min，取沉淀按常规方法进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达情况。取诱导表达3h的细菌培养物8000r/min离心10min，收集细菌，加1/10原培养物体积的缓冲液A重悬，强超声波处理约8次，10s/次（冰上操作），直到液体变为透明，4℃12000r/min离心15min，取100μL上清备用，将沉淀加等体积（离心前）缓冲液A重悬，取100μL加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，作为SDS-PAGE电泳样品。剩下的可置-80℃备用。Western-blot方法鉴定所表达纯化的蛋白的免疫原性。

[0047] 实施例3

[0048] 肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒的建立，如图4-图7所示：

[0049] 1、通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上。具体步骤为：a.取125μL 10%羧化胶乳放入离心管中；b.碳酸缓冲液（pH9.6）洗3遍；c.磷酸缓冲液（pH4.5）洗3遍；d.加入水溶性碳化二亚胺（EDC）在磷酸缓冲液（pH4.5）中室温作用3h；e.硼酸缓冲液（pH8.0）洗3遍；f.在胶乳悬液中加入VP1蛋白质抗原或混合单抗，摇床上感作6小时；g.胶乳抗体检测试剂悬浮于贮存液中。

[0050] 2、遵循固定其它条件，改换其中一个条件的原则，摸索本发明方法的最佳的偶联蛋白量，最佳的偶联时间，最佳的胶乳浓度，偶联反应终止剂和封闭剂的选择等。

[0051] 最佳的碳化二亚胺的工作液浓度为1.0-2.3%，如2%，即5g溶解在250ml双蒸水中，最佳的碳化二亚胺的反应终浓度为60-80μl，如2%碳化二亚胺加入到1ml pH4.5的磷酸盐缓冲液悬浮的乳胶溶液中，最佳的碳化二亚胺的反应时间为2.5-3小时；

[0052] 偶联蛋白量为20-70ug，偶联时间为4.5-9.6小时，所述的乳胶浓度为110-180ul；

[0053] 偶联反应终止剂为20-60μl的0.1M乙醇胺溶液加入1-2mlpH8.0硼酸缓冲液悬浮的乳胶溶液中制得；

[0054] 最佳的偶联蛋白量为20-70ug，最佳的偶联时间为4.5-9.6小时，最佳的乳胶浓度为110-180ul；最佳的缓冲液用量为1ml缓冲液/150μl羧化乳胶；

[0055] 最佳的偶联反应终止剂为20-60μl的0.1M乙醇胺溶液加入1-2mlpH8.0硼酸缓冲液悬浮的乳胶溶液中制得。

[0056] 3、肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒的组装：将上述制备好的致敏乳胶，阴阳性对照，载玻片，胶棒组装成检测试剂盒。

[0057] 实施例4

[0058] 本发明肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的检测方法及结果。

[0059] 1、检测方法：用移液器吸取15μL乳胶试剂至载玻片上，吸取15μL待检血清或者含病毒的样本与乳胶混匀，并用塑胶棒旋转搅匀，感作2-5分钟后，即可进行结果判定，依据凝集反应的强度由弱至强可以分为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。

[0060] 2、检测结果：本发明的检测试纸条在绍兴市疾病预防控制中心进行临床考核，包括手足口病门诊患者、手足口病入院患者、肝病中心住院儿童、感染科各种疾病住院儿童，共考核了600名临床患儿及400份健康体检幼儿的血清样本。临床实验验证的结果表明肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒，准确度高，特异性好，其中对血清样本抗体检测考核结果：准确度为89.5%，特异度为92.4%，灵敏度为81.3%，阳性样本与商业化的ELISA检测试剂盒的符合率为82.6%，阴性样本与PCR的符合率为94.5%；对抗原检测的考核结果：用本发明的抗原检测乳胶试剂盒抗原检测包含2 MOI EV71病毒的原液至100倍稀释的细胞培养上清。对病毒含量低的咽拭子、肛拭子等检出率较低，real-time PCR检测，病毒拷贝数较高的样本呈乳胶凝集实验“+”或“++”。

[0061] 本发明的肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备后，对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期等进行了测定和优化。

[0062] 本发明的抗体检测试剂可适用于人及动物来源血清中EV71抗体的检测，且操作简便、价格低廉、可即时得知结果，非常方便各医疗机构快速辅助诊断。抗原检测乳胶凝集试剂盒可以检测细胞培养上清中病毒复制水平高低差异，对于研究EV71病毒的复制调控、抗病毒治疗药物筛选等方面具有重要的应用前景。

[0063] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。