一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法

摘要

本项发明属于遗传学领域，涉及一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法。一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰基因组DNA；PCR扩增斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的生长抑制素基因；进行测序并比对；MSTN基因从第83位点开始的AGC微卫星重复六次的为斑点叉尾鮰，若该微卫星重复七次的为长鳍叉尾鮰。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰的空白。

权利要求

1.一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法，其特征在于包含以下步骤：(1)分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的生长抑制素基因；

(3)扩增产物纯化后，直接测序，进行序列比对；

(4)根据测序结果，进行判定：生长抑制素基因从第83位点开始的AGC微卫星重复六次的为斑点叉尾鮰，若该微卫星重复七次的为长鳍叉尾鮰。

2.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法，其特征在于用于PCR扩增斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的生长抑制素基因的上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法，其特征在于所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/LTris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01％明胶组成；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，经35个循环后再72℃延伸10min。

说明书

一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法

技术领域

[0001] 本项发明属于遗传学领域，涉及一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法。

背景技术

[0002] 斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰原产于美国，是目前美国养殖技术最为成熟、养殖产量最高的种类，养殖产量约30万吨。斑点叉尾鮰自20世纪80年代引入我国后，在短短的二十几年时间里得到了快速发展，相继突破了养殖、繁殖、饲料、加工出口等环节技术难关，形成了从苗种繁育、养殖、加工、市场营销完整的产业链条，产量也从最初的几千吨猛增，最高峰时达到了22.4万吨，成为我国出口美国的主要品种之一。但是斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰种质来源依靠进口，质量得不到保障，可能存在斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰混杂的情况。

[0003] 目前尚没有文献报道斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰MSTN基因的微卫星的重复规律性，并将此作为两种鱼类分子鉴定的依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法。

[0005] 一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：

[0006] （1）分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰基因组DNA；

[0007] （2）以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的生长抑制素基因；

[0008] （3）扩增产物纯化后，直接测序，进行序列比对；

[0009] （4）根据测序结果，进行判定：MSTN基因从第83位点开始的AGC微卫星重复六次的为斑点叉尾鮰，若该微卫星重复七次的为长鳍叉尾鮰。

[0010] 所述的用于PCR扩增斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的生长抑制素基因的上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

[0011] 所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01%明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，经35个循环后再72℃延伸10min。

[0012] 一种用于斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰的分子遗传鉴别的引物对，上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

[0013] 本发明所述的引物对在制备斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰分子遗传鉴别试剂中的应用。

[0014] 一种斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰分子遗传鉴别试剂，包含本发明所述的引物对。

[0015] 所述的斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰分子遗传鉴别试剂，还优选包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl2，0.01%明胶组成。

[0016] 有益效果：

[0017] 本发明针对斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰肌细胞生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因上的微卫星的重复次数的不同，首次以该种属特异性片段作为依据，从而定性鉴别斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰的空白。

附图说明

[0018] 图1为本发明中MSTN基因测序序列比对结果，星号标明的是从第83位点[0019] （MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复。

具体实施方式

[0020] 以下结合实施例来进一步阐明本发明，但并不是对本发明做任何形式的限定，仅仅作示例说明。

[0021] 实施例1

[0022] 1、引物设计

[0023] 设计一对特异性PCR扩增引物，引物序列为：上游引物SEQ ID NO.1：5'-ACGGTGTTC CTGTTACTGC-3'，下游引物SEQ ID NO.2：5'-CACCAGATGTTGCTATGC-3'。

[0024] 2、样本采集

[0025] 取待鉴定的斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰个体各30尾。

[0026] 3、基因组DNA提取

[0027] 取每尾鱼的尾鳍组织约20mg，用滤纸吸干表面水分，装入1.5ml离心管，加入420μL STE缓冲液(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/LNaCl)。混匀后再加入浓度为10%的SDS80μL和20mg/mL的蛋白酶K10μL，56℃消化8-10h；加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提两次，12000r离心10min，取上清液；加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提一次，12000r离心10min，取上清液；加入等体积预冷无水乙醇，12000r离心10min，弃清液；加入600mL70%的乙醇洗涤沉淀，8000r离心10min，倒掉乙醇，干燥；加入200μL双蒸水溶解，紫外分光光度计测其OD值并稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。

[0028] 4、PCR扩增与检测

[0029] 已提取的DNA为模板，用上述引物（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01%明胶)；dNTP混合液4μL(每种dNTP0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μL Taq酶(2IU)；双蒸水36μL。扩增反应程序为：94℃预变性
2min，94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，经35个循环后再72℃延伸10min。

[0030] PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。

[0031] 5、测序比对

[0032] 检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，获得500bp左右的序列，比对后可以发现MSTN基因从第83位点（MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复次数存在差异：30尾斑点叉尾鮰从第83位点（MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复次数为六次，30尾长鳍叉尾鮰从第83位点（MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复次数为七次。

[0033] 实施例2

[0034] 按照实施例1方法，将样本扩大到斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰个体各100尾，结果依然显示斑点叉尾鮰从第83位点（MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复次数为六次，长鳍叉尾鮰从第83位点（MSTN-83）开始的(AGC)微卫星重复次数为七次。