一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法，属于药物分析领域，鉴别方法包括以下步骤样品溶液的制备、色谱质谱分析、成分鉴定，使用UPLC/Q‑TOF‑MS/MS对芪苈强心胶囊活性部位中的C19二萜类生物碱进行了检测和鉴定，可以为其物质基础的研究提供有力的佐证。

权利要求

1.一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法，所述中药组合物是由以下重量份的原料药制成：黄芪 150-450份、附子40-120份、人参或党参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮或南五加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别，其特征在于所述鉴别方法包括以下步骤：A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂，用甲醇水溶液超声提取，离心，取上清液，加水，过SPE柱，再用甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，水浴吹干，以甲醇：水复溶，得到样品溶液；

B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；进样量为10μL；

梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%含0.1%甲酸的H2O，10%-

40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20种乌头碱类化合物，所述的20种乌头碱类化合物分别为：中乌头原碱、卡马乌头原碱、杰斯乌头碱、乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉地萨敏、查斯曼丁、14-乙酰塔拉地萨敏、10-羟基14-苯甲酰中乌头原碱、14-苯甲酰中乌头原碱、乌头碱、14-苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰次乌头原碱、14-苯甲酰去氧乌头原碱、中乌头碱、10-羟基乌头碱、次乌头碱、去氧乌头碱。

2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述步骤A中甲醇水溶液为50-90%甲醇水溶液，水浴温度为40℃，甲醇：水体积比为1:1，SPE柱为Waters Oasis HLB SPE小柱。

3.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述步骤B中液相柱为Brownlee SPP液相柱，规格为2.7μm，2.1mm×100mm，氮气流速为900 L·h−1。

4.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述鉴别方法由以下步骤构成：

A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂，用50%甲醇水溶液超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品，加甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用90%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以体积比为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；进样量为10μL；

梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%含0.1%甲酸的H2O，10%-

40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20种乌头碱类化合物。

5.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪450份、附子112.5份、人参或党参225份、丹参225份、葶苈子150份、香加皮或南五加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、桂枝90份、红花90份、陈皮75份。

6.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪150份、附子40份、人参或党参225份、丹参225份、葶苈子50份、香加皮或南五加皮

180份、泽泻75份、玉竹75份、桂枝30份、红花90份、陈皮25份。

7.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪250份、附子112.5份、人参或党参200份、丹参120份、葶苈子135份、香加皮或南五加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、桂枝75份、红花75份、陈皮60份。

8.根据权利要求1-7任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述中药组合物的活性成分由下列步骤制成：（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮用7-9倍量70%乙醇提取，滤过，浓缩提取液至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏；

（2）提取桂枝、陈皮的挥发油；

（3）附子、丹参、玉竹、红花加6-10倍量水煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过；桂枝、陈皮提油后的水溶液滤过，收集水溶液滤液，再加6-10倍量水煎煮残渣1小时，滤过，合并水溶液；将上述所得的各种水溶液合并，浓缩至相对密度为1.25-1.30清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，静置，滤过，滤液浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30清膏。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述中药组合物作为活性成分的药物制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂或丸剂。

说明书

一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及中药活性成分的鉴别方法。

背景技术

[0002] 该中药组合物由黄芪、附子、人参、丹参、葶苈子、泽泻、红花、玉竹、陈皮、桂枝、香加皮等十一味中草药。附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)是毛茛科乌头属植物乌头的干燥侧根，有毒，并具有镇痛、消炎、强心和抗癌等广泛的药理作用。二萜类生物碱是附子的主要化学成分，按取代基结构不同分为三类：单酯型生物碱(monoester-diterpenoid alkaloids)、双酯型生物碱(diester-diterpenoid alkaloids)和脂型生物碱(1ipo-alkaloids)，这些也有可能是该中药组合物的强心成分之一。前期对于该中药组合物的活性部位成分的研究中，并未对检出附子中的成分有所报道。

[0003] 二萜类生物碱的结构

[0004]

[0005] R1=CH3 or C2H5

[0006] R2=H or OH

[0007] R3=H or OH

[0008] R=CH3COO(diester-diterpenoid alkaloids)

[0009] or OH(monoester-diterpenoid alkaloids)

[0010] or 甲酸tty acyl(lipo-alkaloids)

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法。

[0012] 本发明所采用的技术方案是：

[0013] 一种中药组合物制剂中20种乌头碱类化合物的鉴别方法，所述中药组合物是由以下重量份的原料药制成：黄芪 150-450份、附子40-120份、人参或党参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮或南五加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝
30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别，所述鉴别方法包括以下步骤：

[0014] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂，用甲醇超声提取，离心，取上清液，加水，过SPE柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，水浴吹干，以甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0015] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；进样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%上午含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0016] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除开启；循环时间：1 秒；数据处理：
PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0017] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0018] 作为优选方式，所述步骤A中甲醇为50-90%甲醇，水浴温度为40℃，甲醇：水为1:1，SPE柱为Waters Oasis HLB SPE小柱，3cc 60mg。

[0019] 作为优选方式，所述步骤B中液相柱为Brownlee SPP液相柱，规格为2.7μm，2.1mm×100mm，氮气流速为900 L·h−1。

[0020] 作为优选方式，所述鉴别方法包括以下步骤：

[0021] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂，用50%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，在称取干燥样品，加甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用90%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0022] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；进样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%含0.1%甲酸的H2O，
10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0023] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除开启；循环时间：1 秒；数据处理：
PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0024] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0025] 作为优选方式，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

[0026] 黄芪450份、附子112.5份、人参或党参225份、丹参225份、葶苈子150份、香加皮或南五加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、桂枝90份、红花90份、陈皮75份。

[0027] 或

[0028] 黄芪150份、附子40份、人参或党参225份、丹参225份、葶苈子50份、香加皮或南五加皮180份、泽泻75份、玉竹75份、桂枝30份、红花90份、陈皮25份。

[0029] 或

[0030] 黄芪250份、附子112.5份、人参或党参200份、丹参120份、葶苈子135份、香加皮或南五加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、桂枝75份、红花75份、陈皮60份。

[0031] 所述中药组合物的活性成分由下列步骤制成：

[0032] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮用7-9倍量70%乙醇提取，滤过，浓缩提取液至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏；

[0033] （2）提取桂枝、陈皮的挥发油；

[0034] （3）附子、丹参、玉竹、红花加6-10倍量水煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过；桂枝、陈皮提油后的水溶液滤过，收集水溶液滤液，再加6-10倍量水煎煮残渣1小时，滤过，合并水溶液；将上述所得的各种水溶液合并，浓缩至相对密度为1.25-1.30清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，静置，滤过，滤液浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30清膏。

[0035] 为了实现上述技术方案，将所述中药组合物制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂或丸剂。

[0036] 所述的20个乌头碱类化合物分别为：中乌头原碱、卡马乌头原碱、杰斯乌头碱、乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉地萨敏、查斯曼丁、14-乙酰塔拉地萨敏、10-羟基14-苯甲酰中乌头原碱、14-苯甲酰中乌头原碱、乌头碱、14-苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰次乌头原碱、14-苯甲酰去氧乌头原碱、中乌头碱、10-羟基乌头碱、次乌头碱、去氧乌头碱。

[0037] 由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

[0038] 本发明使用UPLC/Q-TOF-MS/MS对芪苈强心胶囊活性部位中的C19二萜类生物碱进行了检测和鉴定，可以为其物质基础的研究提供有力的佐证。

附图说明

[0039] 图1是20个乌头碱类化合物的提取离子色谱图，其中1是中乌头原碱，2是卡马乌头原碱，3是杰斯乌头碱，4是乌头原碱，5是次乌头原碱，6是附子灵，7是尼奥灵，8是塔拉地萨敏，9是查斯曼丁，10是14-乙酰塔拉地萨敏，11是10-羟基14-苯甲酰中乌头原碱，12是14-苯甲酰中乌头原碱，13是乌头碱，14是14-苯甲酰乌头原碱，15是14-苯甲酰次乌头原碱，16是14-苯甲酰去氧乌头原碱，17是中乌头碱，18是10-羟基乌头碱,19是次乌头碱，20是去氧乌头碱；

[0040] 图2是乌头碱的二级质谱图；

[0041] 图3是中乌头碱的二级质谱图；

[0042] 图4是次乌头碱的二级质谱图；

[0043] 图5是去氧乌头碱的二级质谱图；

[0044] 图6是杰斯乌头碱的二级质谱图；

[0045] 图7是10-羟基乌头碱的二级质谱图；

[0046] 图8是中乌头原碱的二级质谱图；

[0047] 图9是乌头原碱的二级质谱图；

[0048] 图10是次乌头原碱的二级质谱图；

[0049] 图11是14-苯甲酰中乌头原碱的二级质谱图；

[0050] 图12是10-羟基-14-苯甲酰中乌头原碱的二级质谱图；

[0051] 图13是14-苯甲酰乌头原碱的二级质谱图；

[0052] 图14是14-苯甲酰次乌头原碱的二级质谱图；

[0053] 图15是14-苯甲酰去氧乌头原碱的二级质谱图；

[0054] 图16是卡马乌头原碱的二级质谱图；

[0055] 图17是附子灵的二级质谱图；

[0056] 图18是尼奥灵的二级质谱图；

[0057] 图19是塔拉地萨敏的二级质谱图；

[0058] 图20是查斯曼丁的二级质谱图；

[0059] 图21是14-乙酰塔拉地萨敏的二级质谱图。

具体实施方式

[0060] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

[0061] 质谱仪为AB SCIEX TripleTOFTM 5600，液相柱为Brownlee SPP液相柱，规格为2.7μm，2.1mm×100mm。

[0062] 实施例1本发明药物胶囊剂的制备

[0063] 处方：黄芪450g    附子112.5g  人参225g  丹参225g  葶苈子150g

[0064] 香加皮180g   泽泻225g    红花90g   玉竹75g   陈皮75g  桂枝90g[0065] 制备方法：

[0066] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25 (60℃热测)的清膏，备用；

[0067] （2）桂枝、陈皮按照处方蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；

[0068] （3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.25 (60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30 (60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65℃烘干；

[0069] （4）干膏混合粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，制成1000粒，即得。

[0070] 乌头碱化合物的鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别包括以下步骤：

[0071] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂1.2g，用50%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品10mg，加5ml甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用90%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0072] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；进样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%的含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含
0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0073] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 流速为900 L·h−1，除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除（DBS）开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0074] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物，见表1、图1。

[0075] 实施例2：本发明药物片剂的制备

[0076] 处方：黄芪150g  附子40g  党参225g  丹参225g  葶苈子50g

[0077] 南五加皮180g   泽泻75g  玉竹75g   桂枝30g   红花90g  陈皮25g

[0078] 制备方法：

[0079] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、党参、南五加皮按照比例量称取加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25 (60℃热测)的清膏，备用；

[0080] （2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；

[0081] （3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.30 (60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25 (60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，70℃烘干；

[0082] （4）按常规制剂方法制成片剂。

[0083] 乌头碱化合物的鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别包括以下步骤：

[0084] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂1.2g，用50%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品10mg，加5ml甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用90%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0085] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；上样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%的含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含
0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0086] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为−1，45 V, 除溶剂气体为氮气, 流速为900 L·h 除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除（DBS）开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0087] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0088] 实施例3：本发明药物颗粒剂的制备

[0089] 处方：黄芪250g  附子112.5g  党参200g   丹参120g   葶苈子135g

[0090] 香加皮150g   泽泻200g   玉竹60g   桂枝75g   红花75g  陈皮60g[0091] 制备方法：

[0092] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、党参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.28 (60℃热测)的清膏，备用；

[0093] （2）桂枝、陈皮按照处方蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加6倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；

[0094] （3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.27 (60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30(60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合；

[0095] （4）按常规制剂方法制成颗粒剂。

[0096] 乌头碱化合物的鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别包括以下步骤：

[0097] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂1.5g，用90%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品10mg，加5ml甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用50%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0098] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；上样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%的含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含
0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0099] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 流速为900 L·h−1，除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除（DBS）开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0100] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0101] 实施例4

[0102] 处方：黄芪450g    附子40g   人参225g  丹参225g  葶苈子150g

[0103] 香加皮180g   泽泻225g    红花90g   玉竹75g   陈皮75g 桂枝90g[0104] 制备方法：

[0105] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加9倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30(60℃热测)的清膏，备用；

[0106] （2）桂枝、陈皮按照处方蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加10倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；

[0107] （3）附子、丹参、玉竹、红花加水10倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.25(60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25(60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65℃烘干；

[0108] （4）按常规方法制成丸剂。

[0109] 乌头碱化合物的鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别包括以下步骤：

[0110] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂1g，用70%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品10mg，加5ml甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用80%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0111] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；上样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%的含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含
0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0112] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 流速为900 L·h−1，除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除（DBS）开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0113] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0114] 实施例5

[0115] 处方：黄芪150g    附子120g   党参75g   丹参75g   葶苈子50g

[0116] 南五加皮60g   泽泻75g    红花30g   玉竹25g   陈皮25g  桂枝30g[0117] 制备方法：

[0118] （1）将黄芪、葶苈子、泽泻、党参、南五加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为
1.28 (60℃热测)的清膏，备用；

[0119] （2）桂枝、陈皮按照处方蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加6倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；

[0120] （3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.27 (60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.29(60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，67℃烘干；

[0121] （4）按常规方法制成散剂。

[0122] 乌头碱化合物的鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法对组合物分离，用质谱对化合物进行鉴别包括以下步骤：

[0123] A、样品溶液的制备：称取中药组合物制剂1.2g，用50%甲醇超声提取30min，提取液蒸干，得到干燥样品，再称取干燥样品10mg，加5ml甲醇超声溶解，离心，取上清液，加水，Waters Oasis HLB SPE小柱，再用90%甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴吹干，以比例为1:1的甲醇：水复溶，得到样品溶液；

[0124] B、液相色谱条件：流动相为甲醇和含0.1%甲酸的H2O，流速：0.5ml/min；上样量为10μL；梯度程序：0-2min，90%含0.1%甲酸的H2O，10%甲醇；2-13min，90-60%的含0.1%甲酸的H2O，10%-40%甲醇，13-19min，60-30%的含0.1%甲酸的H2O，40%-70%甲醇，19-20min，30-0%含
0.1%甲酸的H2O，70%-100%甲醇；柱温40℃；

[0125] 质谱条件：离子化模式为ESI，正、负离子扫描, 毛细管电压为3.5 kV, CE电压为45 V, 除溶剂气体为氮气, 流速为900 L·h−1，除溶剂温度为550 ℃, 离子源温度为120℃，MS/MS mode-10 MS/MS at 80 ms each 50-1300 m/z，IDA，动态背景扣除（DBS）开启；循环时间：1 秒；数据处理：PeakView SoftwareTM数据处理软件；

[0126] C、成分鉴定：将乌头碱类化合物的分子式列表导入数据处理软件中的XIC Manager里，将分子式列表的精确质量数与计算的理论质量数对比筛选出符合的成分，根据二级质谱中的碎片信息分析化合物的裂解方式，鉴别出20个乌头碱类化合物。

[0127] 具体乌头碱类化合物见表1

[0128] 表1. 采用UPLC/Q-TOF-MS/MS从芪苈强心胶囊中鉴定出的20个化合物的质谱数据[0129]

[0130] 1.1 双酯型生物碱

[0131] 双酯型生物碱是未经炮制的附子中的主要成分，也是毒性成分，但是在炮制以后大部分会水解生成单酯型生物碱，毒性降为之前的1/2000。

[0132] 成分13的质谱图给出646.3186的准分子离子峰，使用Fomular Finder，根据二萜生物碱的一般结构限定C个数≤50、H≤200、N、O≤20，推测其可能的化学组成为C34H47NO11。MS2谱中有m/z 554.2709[M+H-AcOH-CH3OH] +，105.0332[C7H5O] +，经与乌头碱标准品对照tR、精确分子质量均一致，鉴定为乌头碱，见图2。

[0133] 成分17的质谱图给出m/z 632.3026的准分子离子峰，使用Fomular Finder推测其可能的化学组成为C33H45NO11，MS2谱中有m/z 572.2832[M+H- AcOH]+，m/z 540.2532[M+H -AcOH-CH3OH]+，m/z 512.2636[M+H-AcOH-CH3OH-CO]+, 105.0336[C7H5O] +的碎片离子,经与文献对鉴定为中乌头碱，见图3.

[0134] 成分19的质谱图给出m/z 616.3090的准分子离子峰，使用Fomular Finder推测其2 十
可能的化学组成为C33H45NO10，MS谱中有m/z 584.2851[M+H-CH3OH] ，m/z 556.2891[M+H- AcOH]+，m/z 524.2636[M+H-AcOH-CH3OH]+，m/z 496.2669[M+H-AcOH-CH3OH-CO]+, 105.0337[C7H5O] +的碎片离子, 经与文献对照鉴定为次乌头碱，见图4。

[0135] 成分20的质谱图给出m/z 630.3238的准分子离子峰，使用Fomular Finder推测其2 +
可能的化学组成为C34H47NO10，MS谱中有m/z 570.3037[M+H-AcOH] ，m/z 538.2769 [M+H-AcOH-CH3OH] +，m/z 510.2809[M+H-AcOH-CH3OH-CO] +和m/z 506.2556[M+ H-AcOH -
2CH3OH] +的碎片离子,经与文献对照推断为去氧乌头碱，见图5。

[0136] 同样方法并结合文献鉴定出成分3（m/z 638.2712）、18(m/z 662.3136)分别为杰斯乌头碱和10-羟基乌头碱，见图6、图7。

[0137] 1.2 单酯型生物碱

[0138] 双酯型生物碱经水解或者降解后会产生单酯型生物碱，C8位的R基由乙酰基变为羟基或是形成8、9位双键。

[0139] 成分1给出m/z 486.2689的准分子离子峰，利用Fomular Finder结合乌头类生物碱的一般结构，推断其可能的化学组成为C24H40NO9。MS2谱中有m/z 468.2605[M+H-H2O]十，m/z 454.2447 [M+H-CH3OH]十，m/z 436.2331[M+H- H2O-CH3OH]十，m/z 422.2190[M+H-2CH3OH]十，和m/z 404.2073[M+H-H2O-2CH3OH]十的碎片离子，结合文献以及乌头碱类化合物的断裂规律推断为中乌头原碱，见图8。

[0140] 成分4给出m/z 500.2844的准分子离子峰，利用Fomular Finder推断其可能的化学组成为C25H42NO9。MS2谱中有m/z 468.2605[M+H- H2O]十，m/z 454.2447 [M+H-CH3OH]十，m/z 436.2331[M+H- H2O-CH3OH]十，m/z 422.2190 [M+H-2CH3OH]十，和m/z 404.2073[M+H-H2O-
2CH3OH]十的碎片离子，结合文献以及乌头碱类化合物的断裂规律推断为乌头原碱，见图9。
同样方法鉴定出成分5（m/z 470.2740）为次乌头原碱，见图10。

[0141] 成分12给出m/z 590.2941的准分子离子峰，Fomular Finder结合乌头类生物碱的一般结构，推断其可能的化学组成为C31H43NO10。MS2谱中有m/z 572.2851[M+H- H2O]十，m/z 558.2685 [M+H-CH3OH]十，m/z 540.2573[M+H- H2O-CH3OH]十，m/z 526.2429 [M+H-2CH3OH十 十  +  +
] ，和m/z 508.2321[M+H-H2O-2CH3OH] ，105.0331[C7H5O] ，77.0392[C6H5] 的碎片离子，结合文献推断为14-苯甲酰中乌头原碱。具有类似碎片的还有成分11（m/z 606.2864）、14（m/z 604.3097）、15（m/z 574.2978）、16（m/z 588.3130）,分别鉴定为10-羟基14-苯甲酰中乌头原碱、14-苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰次乌头原碱和14-苯甲酰去氧乌头原碱。分别见图11-15。

[0142] 2.3 其它生物碱

[0143] 成分2给出m/z 408.2727的准分子离子峰，利用Fomular Finder推断其可能的化学组成为C23H37NO5。MS2谱中有m/z 390.2626[M+H- H2O]十，m/z 372.2541[M+H- 2H2O]十，m/z 358.2373[M+H- H2O-CH3OH]十，结合文献鉴定为卡马乌头原碱。同样结合相应碎片信息和文献鉴定成分6（m/z 454.2808）、7（m/z 438.2839）、8（m/z 422.2877）、9（m/z 452.2984）、10（m/z 604.3097）分别为附子灵、尼奥灵、塔拉地萨敏、查斯曼丁和14-乙酰塔拉地萨敏。见图
16-21。