胰激素产生细胞的制造方法及胰激素产生细胞、以及分化诱导促进剂

摘要

本发明提供胰激素产生细胞的制造方法(分化诱导方法)及由此制造的胰激素产生细胞、以及用于所述制造方法的分化诱导促进剂，所述制造方法能够将多能干细胞或胰组织干/祖细胞高效地诱导分化成胰激素产生细胞。本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法的特征在于，在从多能干细胞或胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导过程中，向培养基中添加特定的分化诱导促进剂。作为分化诱导促进剂，可以使用下述多肽或其变体、或者下述细胞的培养上清液，所述多肽包含由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA、或能够和包含与所述DNA互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA。

权利要求

1.胰激素产生细胞的制造方法，其中从iPS细胞或胰组织干/祖细胞制造胰激素产生细胞，其特征在于，在将iPS细胞或胰组织干/祖细胞分化诱导为胰激素产生细胞的过程中，向培养基中添加选自下述(1)和(2)中的至少一种的分化诱导促进剂，(1)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码；

(2)细胞的培养上清液，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA。

2.如权利要求1所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A1)～(E1)：工序(A1)，在属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的生长因子的存在下，对iPS细胞进行培养；

工序(B1)，将所述工序(A1)中得到的细胞在FGF(成纤维细胞生长因子)的存在下进行培养；

工序(C1)，将所述工序(B1)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

工序(D1)，将所述工序(C1)中得到的细胞在γ-分泌酶抑制剂的存在下进行培养；及工序(E1)，在选自由毒晰外泌肽-4、HGF(肝细胞生长因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子-

1)及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对所述工序(D1)中得到的细胞进行培养，在所述工序(A1)～(E1)中的至少一个工序中，向培养基中添加所述分化诱导促进剂。

3.如权利要求1所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A2)～(D2)：工序(A2)，在属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的生长因子、和选自属于Wnt(无翅型MMTV整合位点)家族的生长因子及GSK-3(糖原合成酶激酶-3)抑制剂中的至少一种的因子的存在下，对iPS细胞进行培养；

工序(B2)，将所述工序(A2)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养；

工序(C2)，将所述工序(B2)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

工序(D2)，在选自由cAMP(环腺苷酸)增多剂、地塞米松、TGF-β1型受体抑制剂及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对所述工序(C2)中得到的细胞进行培养，在所述工序(A2)～(D2)中的至少一个工序中，向培养基中添加所述分化诱导促进剂。

4.如权利要求1所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A3)～(E3)：工序(A3)，在不存在属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的生长因子、类视黄醇、FGF(成纤维细胞生长因子)及烟酰胺的条件下，对胰组织干/祖细胞进行培养；

工序(B3)，将所述工序(A3)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养；

工序(C3)，将所述工序(B3)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

工序(D3)，将所述工序(C3)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养；及工序(E3)，将所述工序(D3)中得到的细胞在烟酰胺的存在下进行培养，在所述工序(A3)～(E3)中的至少一个工序中，向培养基中添加所述分化诱导促进剂。

5.包含下述(1)和(2)中的至少一者的试剂用于制造分化诱导促进剂中的用途，所述分化诱导促进剂诱导iPS细胞或胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化，(1)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码；

(2)下述细胞的培养上清液，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA。

说明书

胰激素产生细胞的制造方法及胰激素产生细胞、以及分化诱

导促进剂

技术领域

[0001] 本发明涉及胰激素产生细胞(pancreatic hormone-producing cell)的制造方法及由此制造的胰激素产生细胞、以及用于所述制造方法的分化诱导促进剂，所述制造方法中，从多能干细胞(pluripotent stemcell)(诱导多能干细胞(以下也称作“iPS细胞”)、或胰组织干/祖细胞(pancreatic tissue stem/progenitor cell)制造胰激素产生细胞。

背景技术

[0002] 胰脏具有内分泌细胞和外分泌细胞，是在内分泌及外分泌两方面中担负着重要作用的器官。内分泌细胞发挥产生·分泌胰激素的作用，已知分别地，从α细胞分泌胰高血糖素、从β细胞分泌胰岛素、从δ细胞分泌生长抑素(somatostatin)、从PP细胞分泌胰多肽。特别地，胰岛素具有降低血糖值的作用，发挥将血糖维持为正常浓度的重要作用。

[0003] 近年来，将多能干细胞、胰组织干/祖细胞分化诱导为胰激素产生细胞的方法已被大量报道(参见非专利文献1～4，专利文献1～6等)。若能够通过这样的分化诱导方法有效地得到胰激素产生细胞，则可预期找到作为胰岛移植的替代方法的糖尿病治疗方法。此外，认为通过从来自患者本人的多能干细胞或胰组织干/祖细胞得到胰激素产生细胞，还能够解决排斥反应的问题。

[0004] 但是，迄今为止已报道的分化诱导方法中，分化诱导为胰激素产生细胞的分化诱导效率均不充分。例如，非专利文献1中的分化诱导为胰岛素产生细胞的分化诱导效率为12％左右。因此，希望开发出能够从多能干细胞或胰组织干/祖细胞高效地分化诱导为胰激素产生细胞的分化诱导方法。此外，非专利文献3中，通过向小鼠ES细胞中导入pdx1基因并进行培养，分化诱导为胰岛素产生细胞，但从安全性的观点考虑，优选不伴有基因导入的分化诱导方法。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：国际公开第2007/103282号

[0008] 专利文献2：国际公开第2005/063971号

[0009] 专利文献3：国际公开第2009/048675号

[0010] 专利文献4：国际公开第2007/051038号

[0011] 专利文献5：国际公开第2006/108361号

[0012] 专利文献6：国际公开第2008/066199号

[0013] 非专利文献

[0014] 非专利文献1：D’Amour，K.A.等人,Nature Biotechnology,24,pp.1392-1401(2006)

[0015] 非专利文献2：Wei Jiang等人,Cell Research,17,pp.333-344(2007)

[0016] 非专利文献3：Miyazaki，S.等人,Diabetes,53,pp.1030-1037(2004)

[0017] 非专利文献4：Yuya Kunisada等人,Stem Cell Research,8,pp.274-284(2012)发明内容

[0018] 本发明是鉴于上述以往的实情而完成的，本发明的目的在于提供能够从多能干细胞或胰组织干/祖细胞高效地分化诱导成胰激素产生细胞的胰激素产生细胞的制造方法(分化诱导方法)及制造的胰激素产生细胞、以及用于所述制造方法的分化诱导促进剂。

[0019] 为了解决上述问题，本申请的发明人反复进行了潜心研究。结果发现：通过向培养基中添加作为人TM4SF20已知的多肽、或者作为外源基因整合有编码人TM4SF20的DNA的细胞的培养上清液，能够从多能干细胞或胰组织干/祖细胞高效地分化诱导成胰激素产生细胞。本发明是基于上述知识而完成的，更具体而言如下所述：

[0020] [1]

[0021] 胰激素产生细胞的制造方法，其中，从多能干细胞或胰组织干/祖细胞制造胰激素产生细胞，

[0022] 其特征在于，在从多能干细胞或胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导过程中，向培养基中添加选自下述(1)～(3)中的至少一种的分化诱导促进剂，

[0023] (1)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码；

[0024] (2)包含下述氨基酸序列并且具有促进向胰激素产生细胞的分化诱导的作用的多肽，所述氨基酸序列是在由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加了一个或更多个氨基酸而得到的氨基酸序列；

[0025] (3)下述细胞的培养上清液，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA、或能够和包含与所述DNA互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA。

[0026] [2]

[0027] 如上述[1]所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A1)～(E1)：

[0028] 工序(A1)，在属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的生长因子的存在下，对多能干细胞进行培养；

[0029] 工序(B1)，将上述工序(A1)中得到的细胞在FGF(成纤维细胞生长因子)的存在下进行培养；

[0030] 工序(C1)，将上述工序(B1)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

[0031] 工序(D1)，将上述工序(C1)中得到的细胞在γ-分泌酶抑制剂的存在下进行培养；及

[0032] 工序(E1)，在选自由毒晰外泌肽(Exendin)-4、HGF(肝细胞生长因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子-1)及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对上述工序(D1)中得到的细胞进行培养，

[0033] 在上述工序(A1)～(E1)中的至少一个工序中，向培养基中添加上述分化诱导促进剂。

[0034] [3]

[0035] 如上述[1]所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A2)～(D2)：

[0036] 工序(A2)，在属于TGF-β超家族的生长因子、和选自属于Wnt(无翅型MMTV整合位点)家族的生长因子及GSK-3(糖原合成酶激酶-3)抑制剂中的至少一种的因子的存在下，对多能干细胞进行培养；

[0037] 工序(B2)，将上述工序(A2)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养；

[0038] 工序(C2)，将上述工序(B2)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

[0039] 工序(D2)，在选自由cAMP(环腺苷酸)增多剂、地塞米松、TGF-β1型受体抑制剂及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对上述工序(C2)中得到的细胞进行培养，[0040] 在上述工序(A2)～(D2)中的至少一个工序中，向培养基中添加上述分化诱导促进剂。

[0041] [4]

[0042] 如上述[1]所述的胰激素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括以下工序(A3)～(E3)：

[0043] 工序(A3)，在不存在属于TGF-β超家族的生长因子、类视黄醇、FGF及烟酰胺的条件下，对胰组织干/祖细胞进行培养；

[0044] 工序(B3)，将上述工序(A3)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养；

[0045] 工序(C3)，将上述工序(B3)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养；

[0046] 工序(D3)，将上述工序(C3)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养；及

[0047] 工序(E3)，将上述工序(D3)中得到的细胞在烟酰胺的存在下进行培养，

[0048] 在上述工序(A3)～(E3)中的至少一个工序中，向培养基中添加上述分化诱导促进剂。

[0049] [5]

[0050] 一种胰激素产生细胞，所述细胞是通过上述[1]～[4]中任一项所述的胰激素产生细胞的制造方法人工制得的。

[0051] [6]

[0052] 一种分化诱导促进剂，其诱导从多能干细胞或胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化，所述分化诱导促进剂包含下述(1)～(3)中的至少一者，

[0053] (1)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码；

[0054] (2)包含下述氨基酸序列并且具有促进向胰激素产生细胞的分化诱导的作用的多肽，所述氨基酸序列是在由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加了一个或更多个氨基酸而得到的氨基酸序列；

[0055] (3)下述细胞的培养上清液，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA、或能够和包含与所述DNA互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA。

[0056] 根据本发明，能够提供可从多能干细胞或胰组织干/祖细胞高效地分化诱导成胰激素产生细胞的胰激素产生细胞的制造方法(分化诱导方法)及由此制造的胰激素产生细胞、以及用于所述制造方法的分化诱导促进剂。

附图说明

[0057] [图1]是表示在从人iPS细胞向胰激素产生细胞进行分化诱导的分化诱导过程的最终阶段(工序(D1)、(E1))添加了转染(transfect)有由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的多肽(IBCAP)的表达载体(vector)的细胞的培养上清液的情况下的、胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量的图。

[0058] [图2]是表示在从人iPS细胞向胰激素产生细胞进行分化诱导的分化诱导过程的初期阶段(工序(A1-1)、(A1-1))或中间阶段(工序(B1)、(C1))添加了转染有由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的多肽(IBCAP)的表达载体的细胞的培养上清液的情况下的、胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量的图。

[0059] [图3]是表示在从小鼠胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞进行分化诱导的分化诱导过程的最终阶段(工序(E3))添加了转染有由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的多肽(IBCAP)的表达载体的细胞的培养上清液的情况下的、小鼠胰岛素-1(Ins1)的表达量的图。

具体实施方式

[0060] 本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法的特征在于，在从多能干细胞或胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞进行分化诱导的分化诱导过程中，向培养基中添加特定的分化诱导促进剂。以下，首先依次对多能干细胞、胰组织干/祖细胞、分化诱导促进剂进行说明，然后对具体的胰激素产生细胞的制造方法(分化诱导方法)进行说明。

[0061] <多能干细胞>

[0062] 所谓多能干细胞(pluripotent cell)，是指具有分化成属于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)中每层的至少一种分化细胞的能力(多能性)的可自我复制的干细胞，包括例如诱导多能干细胞(iPS细胞)、成体多能干细胞(APS细胞)等。其中，本发明涉及的制造方法中优选使用其中的诱导多能干细胞(iPS细胞)。

[0063] iPS细胞是通过对体细胞进行初始化得到的具有多能性的细胞。多个课题组(包括京都大学的Yamanaka博士等人的课题组、麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)的Jaenisch博士等人的课题组、威斯康辛大学(University of Wisconsin)的Thomson博士等人的课题组、哈佛大学的Hochedlinger博士等人的课题组等)已成功制作了iPS细胞。

[0064] 用于制作iPS细胞的体细胞的种类没有特别限定，可以使用任意体细胞。即，可以使用构成生物体的细胞中除生殖细胞以外的所有细胞，可以是已分化的体细胞，也可以是未分化的干细胞。体细胞的来源没有特别限定，可以为哺乳动物、鸟类、鱼类、爬虫类、两栖类均可，优选为哺乳动物，特别优选为人或小鼠。使用人的体细胞时，使用胎儿、新生儿、成人的体细胞均可。

[0065] 为了从体细胞制作iPS细胞，需要向体细胞中导入至少一种初始化基因进行初始化。初始化基因是编码初始化因子的基因，所述初始化因子具有将体细胞初始化为iPS细胞的作用。作为制作人iPS细胞时的初始化基因的组合，可以举出例如以下(i)～(iv)，但并不限定于这些例子，

[0066] (i)OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因

[0067] (ii)OCT基因、SOX基因、NANOG基因、LIN28基因

[0068] (iii)OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因、hTERT基因、SV40large T基因

[0069] (iv)OCT基因、KLF基因、SOX基因。

[0070] <胰组织干/祖细胞>

[0071] 所谓胰组织干/祖细胞，是指存在于动物的胰脏中的、具有多分化能力、自我复制能力的组织干/祖细胞。胰组织干/祖细胞的来源没有特别限定，优选为哺乳动物，特别优选为人或小鼠。作为从胰脏分离组织干/祖细胞的方法，没有特别限定，可以任意地采用现有已知的方法。例如，已知在胎儿胰脏中，PDX1为胰组织干/祖细胞的标记分子(marker molecule)(Jonsson,J.等人,Nature,371,pp.606-609(1994)；Offield,M.F.等人,Development,22,pp.983-995(1996))。胎儿的PDX1表达细胞分化成内分泌细胞、外分泌细胞及胰管细胞，产生存在于成体胰脏的所有种类的细胞。因此，可以将PDX1作为标记分子来分离胰组织干/祖细胞。

[0072] 需要说明的是，上述胰组织干/祖细胞可以是未细胞株化的，也可以是已细胞株化的。

[0073] <分化诱导促进剂>

[0074] 用于本发明的胰激素产生细胞的制造方法中的分化诱导促进剂为选自下述(1)～(3)中的至少一种。

[0075] (1)包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码。

[0076] (2)包含下述氨基酸序列并且具有促进向胰激素产生细胞的分化诱导的作用的多肽，所述氨基酸序列是在由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加了一个或更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

[0077] (3)下述细胞的培养上清液，所述细胞中，作为外源基因整合有包含序列号1所示的碱基序列的DNA、或能够和包含与所述DNA互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA。

[0078] 包含序列号1所示的碱基序列的DNA是作为编码人TM4SF20的DNA而已知的、总长度为2308bp的DNA(NCBI：LOCUS NM024795)。该DNA的CDS为38..727，编码具有序列号3所示的229个的氨基酸序列的多肽(参见序列号2)。本发明涉及的制造方法中，可以将该多肽用作分化诱导促进剂。

[0079] 此外，本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法中，也可以将包含在上述多肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加了一个或更多个氨基酸而得到的氨基酸序列的多肽(以下也称作“突变体多肽”)用作分化诱导促进剂，只要维持着促进向胰激素产生细胞的分化诱导的作用即可。已知包括通过对氨基酸序列取代、缺失和/或添加一个或更多个氨基酸而进行修饰得到的氨基酸序列的多肽能够维持其生物学活性(参见Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.5662-5666(1984)；Zoller，M.J.等人，Nucleic Acids Research，10，pp.6487-6500(1982)；Wang，A.等人，Science，224，pp.1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.6409-6413(1982)等)。

[0080] 此处，将上述多肽的氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸取代为其他氨基酸的情况下，取代前后保留氨基酸侧链的性质是令人期待的。作为氨基酸侧链的性质，可以举出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱性基团的侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内的字母均为氨基酸的单字母表示)。

[0081] 取代、缺失和/或添加一个或更多个氨基酸的情况下，该数目可以为例如1～20个，可以为1～15个，可以为1～10个，可以为1～5个。

[0082] 此外，突变体多肽与原多肽的同源性优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为93％以上、特别优选为95％以上、最优选为98％以上。

[0083] 需要说明的是，序列号3的第1～163号、第179～229号的氨基酸是在不同物种之间高度保守的部分。因此，该部分的氨基酸优选在突变前后被保留。

[0084] 上述多肽和突变体多肽可以化学合成，也可以通过基因工程学方法获得。例如，可以通过下述方法获得：将包含序列号1所示的碱基序列的DNA、或能够和包含与该DNA互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA作为外源基因整合进可培养的宿主细胞，对该宿主细胞进行培养，使基因表达，由此从其培养上清液中得到上述多肽、突变体多肽。

[0085] 作为宿主细胞，可以合适地使用细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等已知的细胞。作为动物细胞，可以举出HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO-K1细胞、COS细胞等。

[0086] 此处所谓的“在严格条件下杂交的DNA”，是指能够使用特定的DNA(包含与包含序列号1所示的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA)作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法(plaque hybridization)、Southern印迹杂交法等由此而取得的DNA。例如可以举出可通过下述方法鉴定的DNA等：使用固定化有来自菌落、噬菌斑的DNA的滤膜，在0.7～1.0M氯化钠的存在下于65℃进行杂交后，使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，于65℃的条件下对滤膜进行清洗(若需要，参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989.等)。在严格条件下杂交的DNA的碱基序列的、与用作探针的DNA的碱基序列的同源性优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为93％以上、特别优选为95％以上、最优选为98％以上。

[0087] 上述多肽、突变体多肽的分离·纯化可以利用肽化学中通常使用的方法(例如，离子交换树脂、分配色谱法、凝胶色谱法、反相色谱法等)来进行。

[0088] 此外，本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法中，也可以将含有上述多肽或突变体多肽的培养上清液用作分化诱导促进剂。将培养上清液用作分化诱导促进剂的情况下，优选通过超滤等对培养上清液进行浓缩。进而，也可以根据需要进行透析从而除去不需要的化学物质等。

[0089] <从多能干细胞向胰激素产生细胞的分化诱导方法(胰激素产生细胞的制造方法)>

[0090] 本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法中，在从多能干细胞向胰激素产生细胞的分化诱导过程中，向培养基中添加上文所述的分化诱导促进剂。作为从多能干细胞向胰激素产生细胞的分化诱导方法，没有特别限定，可以任意地采用以往已知的方法。添加多肽或突变体多肽作为分化诱导促进剂的情况下，其浓度优选为10～200ng/mL、更优选为50～180ng/mL、进一步优选为60～150ng/mL。此外，添加培养上清液作为分化诱导促进剂的情况下，其浓度优选为0.5～20％(v/v)、更优选为1～10％(v/v)、进一步优选为1.5～5％(v/v)。

[0091] 以下，作为从多能干细胞至胰激素产生细胞的分化诱导方法(胰激素产生细胞的制造方法)的例子，对两种方法进行说明，但本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法并不限定于这样的例子。

[0092] [第一种分化诱导方法]

[0093] 第一种分化诱导方法为基于非专利文献1中记载的方法。该文献以引用方式并入本申请中。

[0094] 第一种分化诱导方法包括下述工序(A1)～(E1)。在其中的至少一个工序中，向培养基中添加上文所述的分化诱导促进剂。添加分化诱导促进剂的工序优选为工序(A1)～(C1)中的至少一个工序，更优选为工序(B1)～(C1)中的至少一个工序。需要说明的是，在某工序中添加分化诱导促进剂时，可以在该工序之初添加，也可以在工序的中途添加。

[0095] 工序(A1)，在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下，对多能干细胞进行培养。

[0096] 工序(B1)，将上述工序(A1)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养。

[0097] 工序(C1)，将上述工序(B1)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0098] 工序(D1)，将上述工序(C1)中得到的细胞在γ-分泌酶抑制剂的存在下进行培养。

[0099] 工序(E1)，在选自由毒晰外泌肽-4、HGF、IGF-1及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对上述工序(D1)中得到的细胞进行培养。

[0100] (工序(A1))

[0101] 工序(A1)中，在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下对多能干细胞进行培养。

[0102] 作为属于TGF-β超家族的生长因子，可以举出激活素(activin)、Nodal、BMP(骨形成蛋白)等，其中优选激活素。已知上述属于TGF-β超家族的生长因子促进由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化(参见非专利文献1、专利文献1～3等)。作为激活素，可以举出激活素A、激活素B、激活素AB等，其中优选激活素A。

[0103] 属于TGF-β超家族的生长因子的浓度优选为5～250ng/mL、更优选为10～200ng/mL、进一步优选为50～150ng/mL。

[0104] 此外，工序(A1)中，优选向培养基中添加属于Wnt家族的生长因子。通过同时添加属于TGF-β超家族的生长因子和属于Wnt家族的生长因子，能够提高向胚体内胚层细胞的分化效率。

[0105] 作为属于Wnt家族的生长因子，可以举出Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等，优选Wnt1、Wnt3a，更优选Wnt3a。

[0106] 属于Wnt家族的生长因子的浓度优选为1～1000ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为10～50ng/mL。

[0107] 需要说明的是，工序(A1)中，也可以添加GSK-3抑制剂(例如CHIR)来代替属于Wnt家族的生长因子。已知GSK-3抑制剂(例如CHIR)激活Wnt信号途径(J.Biol.Chem.277(34)，pp.30998-31004(2002))。

[0108] 此外，工序(A1)中，也可以向培养基中添加能提高向胚体内胚层细胞的分化效率的补充因子。作为补充因子，可以举出例如PDGF(血小板衍生生长因子)、EGF(上皮生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、KGF(角质形成细胞生长因子)、HGF、NGF(神经生长因子)、GDF(生长分化因子)、GLP(胰高血糖素样肽)、烟酰胺、毒晰外泌肽-4、视黄酸、乙醇胺、甲状旁腺激素、孕酮、抑蛋白酶肽(aprotinin)、氢化可的松、胃泌素(gastrin)、甾体类生物碱(steroid alkaloid)、铜螯合剂(三乙烯五胺(triethylenepentamine)等)、毛喉素、丁酸钠、成头蛋白(Noggin)、丙戊酸、制滴菌素A、Ihh蛋白(Indian hedgehog)、Shh蛋白(Sonic hedgehog)、蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitor)、Notch途径抑制剂、Hedgehog途径抑制剂等。

[0109] 作为用于培养的容器，从分化诱导能力、功能表达能力、生存能力等的观点考虑，优选包被有使用了生物相容性的材料的骨架(scaffold)的培养板。作为骨架，可以举出层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan)、明胶、巢蛋白(entactin)、多聚鸟氨酸等。作为市售品，能够得到Becton Dickinson制的MATRIGELTM、生长因子减少型MATRIGELTM等。特别优选使用经MATRIGELTM包被的培养板。

[0110] 用于培养的培养基如下进行制作：在可用于动物细胞培养的基本培养基中，添加维持细胞生长所必需的各种营养源、其他成分。

[0111] 作为基本培养基，可以举出RPMI1640培养基、DMEM培养基、CMRL1066培养基、Ham F12培养基、Eagle MEM培养基、Glasgow MEM培养基、IMEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、William E培养基、Fischer培养基、McCoy培养基、BME培养基、αMEM培养基、BGJb培养基、Medium199培养基、或者它们的混合培养基等。

[0112] 作为营养源，可以举出甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等碳源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇等烃类；硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源；钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐等无机盐类；各种维生素类；各种氨基酸类；等。

[0113] 作为其他成分，可以举出青霉素、链霉素等抗生素；霍乱毒素；胰岛素；转铁蛋白；亚硒酸；白蛋白；2-巯基乙醇；血清或血清替代物；等。作为胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸，Invitrogen制的ITS-X、ITS-A、ITS-G等作为市售品能够得到。此外，作为血清替代物，Invitrogen制的B-27TM添加剂(supplement)、N-2添加剂、KnockoutTM血清替代物等作为市售品能够得到。

[0114] 此处，已知为了提高工序(A1)的分化效率，使培养基中的胰岛素、IGF等的含量足够低是重要的(参见国际公开第2006/020919号)。因此，工序(A1)中，优选使用无血清培养基或低血清培养基(参见非专利文献1、专利文献1～3等)。血清浓度优选为0～2％(v/v)、更优选为0～1％(v/v)、进一步优选为0～0.5％(v/v)。

[0115] 优选的实施方式中，可以使用添加有激活素A、Wnt3a、青霉素、链霉素等抗生素、L-谷氨酰胺或含L-谷氨酰胺的二肽的、无血清或低血清的RPMI1640培养基。

[0116] 工序(A1)的培养时期为例如1～6天、优选为2～4天。

[0117] 对于向胚体内胚层细胞的分化诱导的进行，可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着从多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化的进行，作为干细胞标记基因的OCT4、NANOG、SOX2、ECAD等的表达减少，作为胚体内胚层细胞标记基因的SOX17、CER、FOXA2、CXCR4等的表达亢进。

[0118] 需要说明的是，为了提高向胚体内胚层细胞的分化效率，需要降低培养基中的血清浓度；而为了提高细胞的生存率，优选增高培养基中的血清浓度。

[0119] 因此，优选将工序(A1)分为以下两个工序：工序(A1-1)，使用无血清的第一培养基进行培养；工序(A1-2)，使用低血清的第二培养基进行培养。

[0120] 关于工序(A1-1)中使用的第一培养基，除为无血清以外，可以与上述相同。即，第一培养基含有属于TGF-β超家族的生长因子，此外，也可含有属于Wnt家族的生长因子。该第一培养基优选含有属于Wnt家族的生长因子。

[0121] 工序(A1-1)的培养时期为例如1～3天、优选为1～2天。通过该培养，从多能干细胞向中内胚层细胞的分化得以进行。

[0122] 对于向中内胚层细胞的分化诱导的进行，可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着从多能干细胞向中内胚层细胞的分化的进行，作为干细胞标记基因的OCT4、NANOG、SOX2、ECAD等的表达减少，作为中内胚层细胞标记基因的BRA、FGF4、WNT3、NCAD等的表达亢进。

[0123] 关于工序(A1-2)中使用的第二培养基，可以除了为低血清以外与上述相同。即，第二培养基含有属于TGF-β超家族的生长因子，此外，也可含有属于Wnt家族的生长因子。血清浓度优选为0.05～2％(v/v)、更优选为0.05～1％(v/v)、进一步优选为0.1～0.5％(v/v)。

[0124] 工序(A1-2)的培养时期为例如1～3天、优选为1～2天。通过该培养，从中内胚层细胞向胚体内胚层细胞的分化得以进行。

[0125] 如上所述，对于向胚体内胚层细胞的分化诱导的进行，可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。

[0126] 需要说明的是，对于得到的细胞，也可以在进入下述工序(B1)之前通过已知的方法进行浓缩、分离和/或纯化。

[0127] (工序(B1))

[0128] 工序(B1)中，将工序(A1)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养。

[0129] 作为FGF，可以举出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-
19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，优选FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10。

[0130] FGF的浓度优选为5～150ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为20～80ng/mL。

[0131] 此外，工序(B1)中，优选向培养基中添加Hedgehog途径抑制剂。通过同时添加FGF和Hedgehog途径抑制剂，能够提高分化效率。

[0132] 作为Hedgehog途径抑制剂，可以举出KAAD-环巴胺(cyclopamine)(28-[2-[[6-[(3-苯基丙酰基)氨基]己酰基]氨基]乙基]-17β,23β-环氧藜芦烷-3-酮(28-[2-[[6-[(3-phenylpropanoyl)amino]hexanoyl]amino]ethyl]-17β,23β-epoxyveratraman-3-one))、KAAD-环巴胺类似物、蒜藜芦碱(jervine)(17,23β-环氧-3β-羟基藜芦烷-11-酮(17,23β-Epoxy-3β-hydroxyveratraman-11-one))、蒜藜芦碱类似物、Hedgehog途径阻断抗体等，其中优选KAAD-环巴胺。

[0133] Hedgehog途径抑制剂的浓度优选为0.01～5μM、更优选为0.02～2μM、进一步优选为0.1～0.5μm。

[0134] 用于培养的容器可以与工序(A1)相同。关于培养基，可以除了上述各因子、培养基的血清浓度以外与工序(A1)相同。培养基的血清浓度优选为0.1～5％(v/v)、更优选为0.5～5％(v/v)、进一步优选为1～5％(v/v)。

[0135] 需要说明的是，工序(A1)中使用低血清培养基时，工序(B1)中优选使用血清浓度比工序(A1)更高的培养基。

[0136] 优选的实施方式中，可以使用添加有FGF-10、KAAD-环巴胺、青霉素、链霉素等抗生素、L-谷氨酰胺或含L-谷氨酰胺的二肽的、低血清的RPMI1640培养基。

[0137] 工序(B1)的培养时期为例如1～6天、优选为2～4天。

[0138] 分化诱导的进行可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着分化的进行，HNF1B、HNF4A等基因的表达亢进。

[0139] 需要说明的是，对于得到的细胞，也可以在进入下述工序(C1)之前通过已知的方法进行浓缩、分离和/或纯化。

[0140] (工序(C1))

[0141] 工序(C1)中，将工序(B1)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0142] 作为类视黄醇，可以举出视黄醇、视黄醛、视黄酸等，其中优选视黄酸。

[0143] 类视黄醇的浓度优选为0.2～10μM、更优选为0.4～8μM、进一步优选为1～4μM。

[0144] 此外，工序(C1)中，优选向培养基中添加Hedgehog途径抑制剂。通过同时添加类视黄醇和Hedgehog途径抑制剂，能够提高分化效率。

[0145] 作为Hedgehog途径抑制剂，可以举出KAAD-环巴胺、KAAD-环巴胺类似物、蒜藜芦碱、蒜藜芦碱类似物、Hedgehog途径阻断抗体等，其中优选KAAD-环巴胺。

[0146] Hedgehog途径抑制剂的浓度优选为0.01～5μM、更优选为0.02～2μM、进一步优选为0.1～0.5μM。

[0147] 此外，工序(C1)中，优选向培养基中添加FGF。通过同时添加类视黄醇和FGF，能够提高分化效率。

[0148] 作为FGF，可以举出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-
19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，优选FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10。

[0149] FGF的浓度优选为0.5～50ng/mL、更优选为1～25ng/mL、进一步优选为2～10ng/mL。

[0150] 此外，工序(C1)中，也可以向培养基中添加属于TGF-β超家族的生长因子。

[0151] 属于TGF-β超家族的生长因子的浓度优选为5～250ng/mL、更优选为10～200ng/mL、进一步优选为20～150ng/mL。

[0152] 用于培养的容器可以与工序(B1)相同。关于培养基，可以除上述各因子以外与工序(B1)基本相同。但是，优选在培养基中添加血清替代物来代替血清。作为血清替代物的市售品，可得到Invitrogen制的B-27TM添加剂、N-2添加剂、KnockoutTM血清替代物等，其中优TM选B-27 添加剂。

[0153] B-27TM添加剂的浓度优选为0.1～10％(v/v)、更优选为0.2～5％(v/v)、进一步优选为0.4～2.5％(v/v)。需要说明的是，由于所述B-27TM添加剂是以50倍储备液的形式出售的，所以为了将B-27TM添加剂的浓度制成0.1～10％(v/v)，可将其以稀释5～500倍的方式添加在培养基中。

[0154] 优选的实施方式中，可以使用添加有视黄酸、KAAD-环巴胺、FGF-10、青霉素、链霉素等抗生素、B-27TM添加剂的、无血清的DMEM/Ham F12培养基。

[0155] 工序(C1)的培养时期为例如1～6天、优选为2～4天。

[0156] 分化诱导的进行可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着分化的进行，PDX1、HNF6、HLXB9等基因的表达亢进。

[0157] 需要说明的是，对于得到的细胞，也可以在进入下述工序(D1)之前通过已知的方法进行浓缩、分离和/或纯化。

[0158] [工序(D1)]

[0159] 工序(D1)中，将工序(C1)中得到的细胞在γ-分泌酶抑制剂的存在下进行培养。

[0160] 作为γ-分泌酶抑制剂，可以举出DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine tert-butylester))、L-685458([1S-苄基-4R-[1-(1S-氨基甲酰基-2-苯乙基氨基甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨基甲酰基]-2R-羟基-5-苯乙基戊基]氨基甲酸叔丁酯([1S-benzyl-4R-[1-(1S-carbamoyl-2-phenethylcarbamoyl)-1S-3-methylbutylcarbamoyl]-2R-hydroxy-
5-phenethylpentyl]carbamicacid tert-butyl ester))等，其中优选DAPT。

[0161] γ-分泌酶抑制剂的浓度优选为1～50μM、更优选为2～40μM、进一步优选为5～20μM。

[0162] 此外，工序(D1)中，优选向培养基中添加毒晰外泌肽-4。通过同时添加γ-分泌酶抑制剂和毒晰外泌肽-4，能够提高分化效率。

[0163] 毒晰外泌肽-4的浓度优选为5～150ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为20～80ng/mL。

[0164] 用于培养的容器、培养基可以与工序(C1)相同。即，优选在培养基中添加血清替代物。

[0165] 优选的实施方式中，可以使用添加有DAPT、毒晰外泌肽-4、青霉素、链霉素等抗生素、B-27TM添加剂的、无血清的DMEM/Ham F12培养基。

[0166] 工序(D1)的培养时期为例如1～6天、优选为2～3天。

[0167] 分化诱导的进行可通过形态学观察来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着分化的进行，NKX6-1、NGN3、PAX4、NKX2-2等基因的表达亢进。

[0168] 需要说明的是，对于得到的细胞，也可以在进入下述工序(E1)之前通过已知的方法进行浓缩、分离和/或纯化。

[0169] (工序(E1))

[0170] 工序(E1)中，在选自由毒晰外泌肽-4、HGF、IGF-1及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对工序(D1)中得到的细胞进行培养。

[0171] 作为毒晰外泌肽-4、HGF、IGF-1及烟酰胺，优选添加其中的2种以上、更优选添加3种以上。

[0172] 毒晰外泌肽-4的浓度优选为5～150nM、更优选为10～100nM、进一步优选为20～80nM。

[0173] HGF的浓度优选为5～150ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为20～80ng/mL。

[0174] IGF-1的浓度优选为5～150ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为20～80ng/mL。

[0175] 烟酰胺的浓度优选为1～30mM、更优选为3～20mM、进一步优选为5～15mM。

[0176] 用于培养的容器、培养基可以与工序(D1)相同。即，优选在培养基中添加血清替代物。

[0177] 优选的实施方式中，可以使用添加有毒晰外泌肽-4、HGF、IGF-1、青霉素、链霉素等抗生素、B-27TM添加剂的、无血清的CMRL1066培养基。

[0178] 工序(E1)的培养时期为例如3～20天、优选为3～10天。

[0179] 通过上述工序(E1)，能够得到胰激素产生细胞。

[0180] 对于向胰激素产生细胞的分化诱导的进行，可通过对胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等胰激素的产生进行确认来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着分化的进行，INS、GCG、GHRL、SST、PPY等中的至少一个基因的表达亢进。

[0181] [第二种分化诱导方法]

[0182] 第二种分化诱导方法基于非专利文献4中记载的方法。该文献以引用的方式并入本申请中。

[0183] 第二种分化诱导方法包括下述工序(A2)～(D2)。在其中的至少一个工序中，向培养基中添加上文所述的分化诱导促进剂。添加分化诱导促进剂的工序优选为工序(C2)～(D2)中的至少一个工序、特别优选为工序(D2)。需要说明的是，在某工序中添加分化诱导促进剂时，可以在该工序之初添加，也可以在工序的中途添加。

[0184] 工序(A2)，在属于TGF-β超家族的生长因子、和选自属于Wnt家族的生长因子及GSK-3抑制剂中的至少一种的因子的存在下，对多能干细胞进行培养。

[0185] 工序(B2)，将上述工序(A2)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养。

[0186] 工序(C2)，将上述工序(B2)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0187] 工序(D2)，在选自由cAMP增多剂、地塞米松、TGF-β1型受体抑制剂及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对上述工序(C2)中得到的细胞进行培养。

[0188] (工序(A2))

[0189] 工序(A2)中，在属于TGF-β超家族的生长因子、和选自属于Wnt家族的生长因子及GSK-3抑制剂中的至少一种的因子的存在下，对多能干细胞进行培养。

[0190] 作为属于TGF-β超家族的生长因子，可以举出激活素、Nodal、BMP等，其中优选激活素。作为激活素，可以举出激活素A、激活素B、激活素AB等，其中优选激活素A。

[0191] 属于TGF-β超家族的生长因子的浓度优选为5～250ng/mL、更优选为10～200ng/mL、进一步优选为50～150ng/mL。

[0192] 作为属于Wnt家族的生长因子，可以举出Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等，优选Wnt1、Wnt3，更优选Wnt3a。

[0193] 属于Wnt家族的生长因子的浓度优选为1～1000ng/mL、更优选为10～100ng/mL、进一步优选为10～50ng/mL。

[0194] 作为GSK-3抑制剂，使用GSK-3α抑制剂及GSK-3β抑制剂均可，但优选使用GSK-3β抑制剂。作为具体例，可以举出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-
pyridinecarbonitrile))、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮(3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-
pyrrol-2,5-dione))、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-
2,5-二酮(3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrol-2,5-
dione))、靛玉红-3’-单肟(indirubin-3’-monoxime)(3-[(3E)-3-(羟基亚氨基)-2,3-二氢-1H-吲哚-2-亚基]-2,3-二氢-1H-吲哚-2-酮(3-[(3E)-3-(hydroxyimino)-2,3-
dihydro-1H-indol-2-ylidene]-2,3-dihydro-1H-indol-2-one))、Kenpaullone(9-溴-7,
8-二氢吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂 -6(5H)-酮(9-bromo-7,8-dihydro-indolo[3,2-d]
[1]benzodiazepin-6(5H)-one))等，其中优选CHIR99021。

[0195] GSK-3抑制剂的浓度优选为0.01～20μM、更优选为0.1～20μM、进一步优选为1～5μM。

[0196] 此外，工序(A2)中，也可以向培养基中添加能提高分化效率的补充因子。作为补充因子，可以举出例如PDGF、EGF、VEGF、KGF、HGF、NGF、GDF、GLP、烟酰胺、毒晰外泌肽-4、视黄酸、乙醇胺、甲状旁腺激素、孕酮、抑蛋白酶肽、氢化可的松、胃泌素、甾体类生物碱、铜螯合剂(三乙烯五胺等)、毛喉素、丁酸钠、成头蛋白、丙戊酸、制滴菌素A、Ihh蛋白、Shh蛋白、蛋白酶体抑制剂、Notch途径抑制剂、Hedgehog途径抑制剂等。

[0197] 作为用于培养的容器，从分化诱导能力、功能表达能力、生存能力等的观点考虑，优选包被有使用了生物相容性的材料的骨架的培养板。作为骨架，可以举出层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、明胶、巢蛋白、聚鸟氨酸等。作为市售品，能够得到Becton Dickinson制的MATRIGELTM、生长因子减少型MATRIGELTM等。特别优选使用经MATRIGELTM包被的培养板。

[0198] 用于培养的培养基如下进行制作：在可用于动物细胞培养的基本培养基中，添加维持细胞生长所必需的各种营养源、其他成分。

[0199] 作为基本培养基，可以举出RPMI1640培养基、DMEM培养基、CMRL1066培养基、Ham F12培养基、Eagle MEM培养基、Glasgow MEM培养基、IMEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、William E培养基、Fischer培养基、McCoy培养基、BME培养基、αMEM培养基、BGJb培养基、Medium199培养基、或者它们的混合培养基等。

[0200] 作为营养源，可以举出甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等碳源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇等烃类；硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源；钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐等无机盐类；各种维生素类；各种氨基酸类；等。

[0201] 作为其他成分，可以举出青霉素、链霉素等抗生素；霍乱毒素；胰岛素；转铁蛋白；亚硒酸；白蛋白；2-巯基乙醇；血清或血清替代物；等。作为胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸，Invitrogen制的ITS-X、ITS-A、ITS-G等作为市售品能够得到。此外，作为血清替代物，Invitrogen制的B-27TM添加剂、N-2添加剂、KnockoutTM血清替代物等作为市售品能够得到。

[0202] 此处，已知为了提高工序(A2)的分化效率，使培养基中的胰岛素、IGF等的含量足够低是重要的。因此，工序(A2)中，优选使用无血清培养基或低血清培养基。血清浓度优选为0～3％(v/v)、更优选为0～2％(v/v)。

[0203] 优选的实施方式中，可以使用添加有激活素A、CHIR99021的低血清的RPMI1640培养基。

[0204] 工序(A2)的培养时期为例如1～3天、优选为1～2天。

[0205] (工序(B2))

[0206] 工序(B2)中，将工序(A2)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养。

[0207] 作为属于TGF-β超家族的生长因子，可以举出激活素、Nodal、BMP等，其中优选激活素。作为激活素，可以举出激活素A、激活素B、激活素AB等，其中优选激活素A。

[0208] 属于TGF-β超家族的生长因子的浓度优选为5～250ng/mL、更优选为10～200ng/mL、进一步优选为50～150ng/mL。

[0209] 用于培养的容器、培养基可以与工序(A2)相同。即，优选的实施方式中，可以使用添加有激活素A的低血清的RPMI1640培养基。

[0210] 工序(B2)的培养时期为例如1～4天、优选为1～3天。

[0211] (工序(C2))

[0212] 工序(C2)中，将工序(B2)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0213] 作为类视黄醇，可以举出视黄醇、视黄醛、视黄酸等，其中优选视黄酸。

[0214] 类视黄醇的浓度优选为0.2～10μM、更优选为0.4～8μM、进一步优选为1～4μM。

[0215] 此外，工序(C2)中，优选向培养基中添加BMP受体抑制剂。

[0216] 作为BMP受体抑制剂，可以举出Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(6-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridyl)pyrazolo[1,5-a]py rimidine))、LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉(4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]
pyrimidin-3-yl)quinoli ne))等，其中优选Dorsomorphin。

[0217] BMP受体抑制剂的浓度优选为0.2～5μM、更优选为0.3～3μM、进一步优选为0.5～2μM。

[0218] 此外，工序(C2)中，优选向培养基中添加TGF-β1型受体抑制剂。

[0219] 作为TGF-β1型受体抑制剂，可以举出SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁茂-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯酰胺(4-[4-(1,3-benzodioxole-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benza mide))、SB525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-1,2-吡啶基)-1H-咪唑基-4-基]喹喔啉(6-[2-(1,1-dimethylethyl)-5-(6-methyl-1,2-
pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline))、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]喹啉(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]quinoline))等，其中，优选SB431542。此外，作为TGF-β1型受体抑制剂，也可使用Calbiochem制的Alk5Inhibitor II。

[0220] TGF-β1型受体抑制剂的浓度优选为1～50μM、更优选为2～30μM、进一步优选为5～20μM。

[0221] 用于培养的容器可以与工序(B2)相同。关于培养基，可以除上述各因子以外与工序(B2)基本相同。但是，优选在培养基中添加血清替代物来代替血清。作为血清替代物的市售品，可得到Invitrogen制的B-27TM添加剂、N-2添加剂、KnockoutTM血清替代物等，其中优选B-27TM添加剂。

[0222] B-27TM添加剂的浓度优选为0.1～10％(v/v)、更优选为0.2～5％(v/v)、进一步优选为0.4～2.5％(v/v)。需要说明的是，由于所述B-27TM添加剂是以50倍储备液的形式出售的，所以为了将B-27TM添加剂的浓度制成0.1～10％(v/v)，可将其以稀释5～500倍的方式添加在培养基中。

[0223] 优选的实施方式中，可以使用添加有视黄酸、Dorsomorphin、SB431542、B-27TM添加剂的、无血清的IMEM Zinc Option培养基。

[0224] 工序(C2)的培养时期为例如5～9天、优选为6～8天。

[0225] (工序(D2))

[0226] 工序(D2)中，在选自由cAMP增多剂、地塞米松、TGF-β1型受体抑制剂及烟酰胺组成的组中的至少一种的因子的存在下，对工序(C2)中得到的细胞进行培养。

[0227] 对于cAMP增多剂、地塞米松、TGF-β1型受体抑制剂及烟酰胺，优选添加其中的2种以上、更优选添加3种以上。

[0228] 作为cAMP增多剂，可以举出毛喉素等腺苷酸环化酶激活剂；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine)等磷酸二酯酶抑制剂；二丁酰cAMP等cAMP类似物(analog)；等，其中，优选毛喉素。

[0229] cAMP增多剂的浓度优选为1～50μM、更优选为2～30μM、进一步优选为5～20μM。

[0230] 地塞米松的浓度优选为1～50μM、更优选为2～30μM、进一步优选为5～20μM。

[0231] 作为TGF-β1型受体抑制剂，可以举出SB431542、SB525334、LY364947等，其中优选SB431542。此外，作为TGF-β1型受体抑制剂，也可使用Calbiochem制的Alk5Inhibitor II。

[0232] TGF-β1型受体抑制剂的浓度优选为1～50μM、更优选为2～30μM、进一步优选为5～20μM。

[0233] 烟酰胺的浓度优选为1～30mM、更优选为3～20mM、进一步优选为5～15mM。

[0234] 用于培养的容器、培养基可以与工序(C2)相同。即，优选在培养基中添加血清替代物。

[0235] 优选的实施方式中，可以使用添加有毛喉素、地塞米松、Alk5Inhibitor II、烟酰胺、B-27TM添加剂的、无血清的IMEM Zinc Option培养基。

[0236] 工序(D2)的培养时期为例如9～13天、优选为10～12天。

[0237] 通过上述工序(D2)，能够得到胰激素产生细胞。

[0238] 对于向胰激素产生细胞的分化诱导的进行，可通过对胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等胰激素的产生进行确认来评价，除此以外，也可以利用RT-PCR对基因表达进行确认由此来评价。随着从多能干细胞向胰激素产生细胞的分化的进行，作为胰激素产生细胞标记基因的INS、GCG、GHRL、SST、PPY等中的至少一个基因的表达亢进。

[0239] <从胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导方法(胰激素产生细胞的制造方法)>

[0240] 本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法中，在从胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导过程中，向培养基中添加上文所述的分化诱导促进剂。作为从胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导方法，没有特别限定，可以任意地采用以往已知的方法。作为分化诱导促进剂添加多肽或突变体多肽时，其浓度优选为10～200ng/mL、更优选为50～150ng/mL、进一步优选为60～120ng/mL。此外，作为分化诱导促进剂添加培养上清液时，其浓度优选为0.5～20％(v/v)、更优选为1～10％(v/v)、进一步优选为1.5～5％(v/v)。

[0241] 以下，对从胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导方法(胰激素产生细胞的制造方法)的一个例子进行说明，但本发明涉及的胰激素产生细胞的制造方法并不限定于该例子。

[0242] 以下分化诱导方法基于非专利文献2中记载的方法。该文献以引用方式并入本申请中。

[0243] 该分化诱导方法包括下述工序(A3)～(E3)。在其中的至少一个工序中，向培养基中添加上文所述的分化诱导促进剂。添加分化诱导促进剂的工序优选为工序(D3)～(E3)中的至少一个工序、特别优选为工序(E3)。需要说明的是，在某工序中添加分化诱导促进剂时，可以在该工序之初添加，也可以在工序的中途添加。

[0244] 工序(A3)，在不存在属于TGF-β超家族的生长因子、类视黄醇、FGF及烟酰胺的条件下，对胰组织干/祖细胞进行培养。

[0245] 工序(B3)，将上述工序(A3)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养。

[0246] 工序(C3)，将上述工序(B3)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0247] 工序(D3)，将上述工序(C3)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养。

[0248] 工序(E3)，将上述工序(D3)中得到的细胞在烟酰胺的存在下进行培养。

[0249] (工序(A3))

[0250] 工序(A3)中，在不存在属于TGF-β超家族的生长因子、类视黄醇、FGF、烟酰胺的条件下，对胰组织干/祖细胞进行培养。

[0251] 作为用于培养的容器，从分化诱导能力、功能表达能力、生存能力等的观点考虑，优选包被有使用了生物相容性的材料的骨架的培养板。作为骨架，可以举出层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、明胶、巢蛋白、聚鸟氨酸等。作为市售品，能够得到Becton Dickinson制的MATRIGELTM、生长因子减少型MATRIGELTM等。特别优选使用被MATRIGELTM包被的培养板。

[0252] 用于培养的培养基如下进行制作：在可用于动物细胞培养的基本培养基中，添加维持细胞生长所必需的各种营养源、其他成分。

[0253] 作为基本培养基，可以举出RPMI1640培养基、DMEM培养基、CMRL1066培养基、Ham F12培养基、Eagle MEM培养基、GlasgowMEM培养基、IMEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、William E培养基、Fischer培养基、McCoy培养基、BME培养基、αMEM培养基、BGJb培养基、Medium199培养基、或者它们的混合培养基等。

[0254] 作为营养源，可以举出甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等碳源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇等烃类；硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源；钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐等无机盐类；各种维生素类；各种氨基酸类；等。

[0255] 作为其他成分，可以举出青霉素、链霉素等抗生素；霍乱毒素；胰岛素；转铁蛋白；亚硒酸；2-巯基乙醇；白蛋白；血清或血清替代物；等。作为胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸，Invitrogen制的ITS-X、ITS-A、ITS-G等作为市售品能够得到。此外，作为血清替代物，Invitrogen制的B-27TM添加剂、N-2添加剂、KnockoutTM血清替代物等作为市售品能够得到。

[0256] 优选的实施方式中，可以使用添加有青霉素、链霉素等抗生素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、2-巯基乙醇、白蛋白的、无血清的DMEM/Ham F12。

[0257] 胰岛素的浓度优选为2～30μg/mL、更优选为5～20μg/mL。转铁蛋白的浓度优选为1～20μg/mL、更优选为3～10μg/mL。亚硒酸的浓度优选为1～20ng/mL、更优选为5～20ng/mL。2-巯基乙醇的浓度优选为50～200μM、更优选为50～100μM。白蛋白的浓度优选为1～10ng/mL、更优选为2～5ng/mL。

[0258] 工序(A3)的培养时期为例如1～3天、优选为1～2天。

[0259] (工序(B3))

[0260] 工序(B3)中，将工序(A3)中得到的细胞在属于TGF-β超家族的生长因子的存在下进行培养。

[0261] 作为属于TGF-β超家族的生长因子，可以举出激活素、Nodal、BMP等，其中优选激活素。作为激活素，可以举出激活素A、激活素B、激活素AB等，其中优选激活素A。

[0262] 属于TGF-β超家族的生长因子的浓度优选为5～250ng/mL、更优选为10～200ng/mL、进一步优选为50～150ng/mL。

[0263] 用于培养的容器可以与工序(A3)相同。关于培养基，可以除了添加属于TGF-β超家族的生长因子以外与工序(A3)相同。即，优选的实施方式中，可以使用添加有青霉素、链霉素等抗生素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、2-巯基乙醇、白蛋白的、无血清的DMEM/Ham F12。

[0264] 工序(B3)的培养时期为例如2～6天、优选为3～5天。

[0265] (工序(C3))

[0266] 工序(C3)中，将工序(B3)中得到的细胞在类视黄醇的存在下进行培养。

[0267] 作为类视黄醇，可以举出视黄醇、视黄醛、视黄酸等，其中优选全反式视黄酸。

[0268] 类视黄醇的浓度优选为0.2～10μM、更优选为0.4～8μM、进一步优选为1～4μM。

[0269] 用于培养的容器可以与工序(A3)相同。关于培养基，可以除了添加属于TGF-β超家族的生长因子以外与工序(A3)同样相同。

[0270] 优选的实施方式中，可以使用添加有全反式视黄酸、青霉素、链霉素等抗生素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、2-巯基乙醇、白蛋白的、无血清的DMEM/Ham F12。

[0271] 工序(C3)的培养时期为例如2～6天、优选为3～5天。

[0272] (工序(D3))

[0273] 工序(D3)中，将工序(C3)中得到的细胞在FGF的存在下进行培养。

[0274] 作为FGF，可以举出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-
19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，优选FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10。

[0275] FGF的浓度优选为1～30ng/mL、更优选为2～20ng/mL、进一步优选为5～15ng/mL。

[0276] 用于培养的容器可以与工序(A3)相同。关于培养基，可以除了添加FGF以外与工序(C3)基本相同。

[0277] 优选的实施方式中，可以使用添加有FGF-2(bFGF)、青霉素、链霉素等抗生素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、白蛋白的、无血清的DMEM/Ham F12。

[0278] 工序(D3)的培养时期为例如1～5天、优选为2～4天。

[0279] (工序(E3))

[0280] 工序(E3)中，将工序(D3)中得到的细胞在烟酰胺的存在下进行培养。

[0281] 烟酰胺的浓度优选为1～30mM、更优选为3～20mM、进一步优选为5～15mM。

[0282] 此外，工序(E3)中，优选向培养基中添加FGF。

[0283] 作为FGF，可以举出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-
19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，优选FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10。

[0284] FGF的浓度优选为1～30ng/mL、更优选为2～20ng/mL、进一步优选为5～15ng/mL。

[0285] 用于培养的容器可以与与工序(A3)相同。关于培养基，可以除了添加烟酰胺以外与工序(D3)基本相同。

[0286] 优选的实施方式中，可以使用添加有烟酰胺、FGF-2(bFGF)、青霉素、链霉素等抗生素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、白蛋白的、无血清的DMEM/Ham F12。

[0287] 工序(E3)的培养时期为例如3～20天、优选为3～10天。

[0288] 通过上述工序(E3)，能够得到胰激素产生细胞。

[0289] 对于向胰激素产生细胞的分化诱导的进行，可通过对胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等胰激素的产生进行确认来评价，除此以外，也可以通过利用RT-PCR对基因表达进行确认来评价。随着从胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化的进行，作为胰激素产生细胞标记基因的INS、GCG、GHRL、SST、PPY等中的至少一个基因的表达亢进。

[0290] <胰激素产生细胞的应用例>

[0291] 如上所述得到的胰激素产生细胞可以应用于糖尿病等的治疗药物中。例如，在胰激素产生细胞产生·分泌胰岛素的情况下，可直接将该胰岛素产生细胞、或者通过过滤器过滤进行浓缩得到的细胞沉淀等细胞团用作糖尿病治疗药物。也可以在添加DMSO等保护剂后对该糖尿病治疗药物进行冷冻保存。需要说明的是，为了更安全地利用，优选在保留作为糖尿病治疗药物的功能、同时能使病原体的蛋白质变性的程度的条件下进行加热处理、射线处理、丝裂霉素C处理等处理。

[0292] 作为将使用了胰岛素产生细胞的糖尿病治疗药物施用于人的形态(移植方法)，可以举出例如下述方法：在人患者的右下腹部切开小切口，暴露肠系膜的细血管，直视下插入导管并移植细胞的方法；通过回声(echo)找到肝脏门静脉，穿刺导管并移植细胞的方法；或者通过在腹部回声指引(echo guide)下直接穿刺脾脏，移植至脾脏的方法。施用量(移植量)优选为1×108～1×1010细胞/个体、更优选为5×108～1×1010细胞/个体。需要说明的是，施用量(移植量)可根据被施予的患者的年龄、体重、症状等进行适当变更。

[0293] 此外，也可以将通过上文所述那样得到的胰激素产生细胞用作研究试剂。例如，可以通过在培养有胰激素产生细胞的培养容器、或者封入了胰激素产生细胞的生物反应器内添加新药来进行新药筛选。

[0294] 进而，也能够使用通过上文所述那样得到的胰激素产生细胞来制造生物人工胰脏。作为生物人工胰脏，可以举出组合了中空纤维型生物反应器(装置(Dvice))和胰激素产生细胞的混合型(hybrid)人工胰脏。生物人工胰脏存在以下形态：安装在体外，与血管连接；留置在体内，与血管连接；以不与血管连接的方式留置在腹腔内；以不与血管连接的方式留置在皮下；等，任意形态的生物人工胰脏均可适用。

[0295] 实施例

[0296] 以下，通过实施例对本发明进行详细的说明，但应理解为本发明并不受以下记载的任何限定。

[0297] <实施例1>

[0298] (1)分化诱导促进剂的制备

[0299] 分化诱导促进剂如下进行制备。使用添加有10％FBS(胎牛血清)(Nichirei，171012)、1％青霉素/链霉素(Life Technologies Japan，15140-122)的Ham F12培养基(Sigma，N6658)对CHO-K1细胞进行传代培养，然后将CHO-K1细胞以5×105个涂板到10cm培养皿上。接种翌日，使用FuGENE6(Roche)，将由包含序列号1所示的碱基序列的DNA编码的多肽(以下称作“IBCAP”)的表达载体(pCAGGS-IBCAP)转染至CHO-K1细胞中，使IBCAP强制表达。48小时后，将细胞稀释成1/20浓度，再次涂板到10cm培养皿上。接种翌日，添加最终浓度为400μg/mL的G418(Nacalai tesque，09380-44)，之后，每隔3～5天更换培养基，使菌落形成。采用有限稀释法分离经克隆化的菌落，增殖后，采用Southern印迹法及Northern印迹法对基因表达进行确认，制作稳定表达IBCAP的CHO-K1细胞株(以下称作“IBCAP表达稳定的CHO细胞”。)。

[0300] 然后，将上述IBCAP表达稳定的CHO细胞在添加有1％GLUTAMAX I(Life Technologies Japan，35050-061)及1％青霉素/链霉素(Life Technologies Japan，
15140-122)的CD OptiCHO(LifeTechnologies Japan，12681-011)中进行驯化。进一步地，将经驯化的IBCAP表达稳定的CHO细胞在强制通气式CO2培养箱(Taitec、CO2-BR-43FL，温度：
37℃，振荡速度：120rpm，气体条件：5％CO2、20mL/min/瓶)中进行振荡培养，之后，使用该细胞制作培养上清液。

[0301] 对于培养上清液，确认细胞的生存率为90％以上，进行传代，使细胞数为5×105个/mL(培养液量：150mL培养液/500mL瓶)，于5天后进行回收(细胞数约为4～5×105个/mL)。然后，将回收的培养上清液用Centriprep(Millipore，4302，YM-3)浓缩至约10倍(将300mL浓缩成约30mL)，进而对2L的30mM HEPES(pH7.6)进行透析3次。然后，准备透析后的培养上清液(以下称作“IBCAP培养上清液”)，作为分化诱导促进剂。

[0302] 此外，作为Mock对照组，将空载体(pCAGGS)转染至CHO-K1细胞中，与上述同样地准备透析后的培养上清液(以下称作“Mock培养上清液”)。

[0303] (2)从人iPS细胞至胰激素产生细胞的分化诱导

[0304] 作为人iPS细胞，使用由埼玉医科大学的Mitani博士提供的TIG3/KOSM细胞。该细胞是由产业技术综合研究所通过使用仙台病毒(Sendai virus)将4种因子(OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因)导入TIG-3细胞中而建立的(Nishimura,K.等人,J.Biol.Chem.,286,pp.4760-4771(2011))。TIG3/KOSM细胞在添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、20％(v/v)KnockoutTM血清替代物(Gibco)、1％(v/v)非必需氨基酸(Gibco)、2.5mM L-谷氨酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇(Gibco)、5ng/mL FGF-2(R&D Systems)、5mM氯化钠的DMEM/Ham F12培养基中维持。

[0305] 在开始分化诱导的前一天，将在10cm培养皿上增殖后的TIG3/KOSM细胞以1×109个/孔的细胞密度涂板到经MATRIGELTM(Becton Dickinson)包被的6孔板上，在利用STO饲养细胞(feeder cell)的驯化培养基中培养一夜。然后，除去培养基，添加1mL的CTK(含有0.25％胰蛋白酶、1mg/mL Collagenase IV、20％KSR、1mM CaCl2的PBS)，37℃下处理5分钟，除去STO饲养细胞后，通过吹吸(pipetting)悬浮、剥离TIG3/KOSM细胞。其后，将剥离的TIG3/KOSM细胞移至15mL管中,以1000rpm(150×g)离心5分钟后，除去上清液，以1×109个/孔的细胞密度涂板至经MatrigelTM包被的6孔板上。

[0306] 需要说明的是，上述驯化培养基如下进行制备。即，将7.5×106个经丝裂霉素处理过的STO细胞涂板至15cm培养皿上，翌日，将培养基更换为人iPS培养基(无FGF-2)，处理1～3小时后，再次更换为人iPS培养基，培养24小时。翌日，回收上清液，通过以1500rpm(330×g)离心10分钟除去细胞，于-20～30℃贮存。

[0307] 在开始分化诱导的第一天，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100ng/mL激活素A(Humanzyme)、25ng/mL Wnt3a
(Nacalai tesque)的Advanced RPMI1640培养基(Gibco)，培养1天(工序(A1-1))。然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、0.2％(v/v)FBS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100ng/mL激活素A(Gibco)的Advanced RPMI1640培养基(Gibco)，培养2天(工序(A1-2))。

[0308] 然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、50ng/mL FGF-10(R&D Systems)、0.25μM KAAD-环巴胺(Nacalai tesque)的Advanced RPMI1640培养基(Gibco)，培养2天(工序(B1))。

[0309] 然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2％(v/v)B-27TM添加剂(Gibco)、2μM视黄酸(Sigma)、0.25μM KAAD-环巴胺(Nacalai tesque)、50ng/mL FGF-10(R&D Systems)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)，培养4天(工序(C1))。

[0310] 然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2％(v/v)B-27TM添加剂(Gibco)、10μM DAPT(Sigma)、55nM毒晰外泌肽-4(Phoenix Pharmaceuticals)、并且还添加有2％(v/v)IBCAP培养上清液或Mock培养上清液的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)，培养3天(工序(D1))。

[0311] 最后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2％(v/v)B-27TM添加剂(Gibco)、55nM毒晰外泌肽-4(Phoenix Pharmaceuticals)、50ng/mL HGF(Humanzyme)、50ng/mL IGF-1(Humanzyme)、并且还添加有2％(v/v)IBCAP培养上清液或Mock培养上清液的CMRL1066培养基(Gibco)，培养6天(工序(E1))。

[0312] (3)定量性RT-PCR分析

[0313] 对于分化诱导前的TIG3/KOSM细胞、及经由工序(E1)得到的细胞，通过定量性RT-PCR确认了胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的基因表达。具体而言，首先，使用TM TM
NucleoSpin  RNA II(Takara-bio)从细胞提取RNA，使用Fast SYBR  Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行定量性RT-PCR分析。引物序列如下所示。

[0314] HsGCG_264F：GCATTTACTTTGTGGCTGGA(序列号4)

[0315] HsGCG_368R：CCTGGGAAGCTGAGAATGAT(序列号5)

[0316] HsSST_206F：CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(序列号6)

[0317] HsSST_313R：TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(序列号7)

[0318] 对于PCR产物，通过3％琼脂糖凝胶电泳进行分离，通过溴化乙锭(ethidium bromide)、BioDoc-It Imaging System(BMbio)使其可见。

[0319] 经由工序(E1)得到的细胞中的胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量分别示于图1(a)、(b)。该图1(a)、(b)用将分化诱导前的TIG3/KOSM细胞中的胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量设为1时的相对值(诱导倍率)来表示。

[0320] 如图1(a)所示，无添加的情况下，胰高血糖素(GCG)的诱导倍率为约22.6倍，与此相对，在工序(D1)、(E1)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约12.8倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约36.8倍。

[0321] 此外，如图1(b)所示，无添加的情况下，生长抑素(SST)的诱导倍率几乎为0倍，与此相对，工序(D1)、(E1)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约0.4倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约9.5倍。

[0322] 由上述结果可知，通过在工序(D1)、(E1)中添加IBCAP培养上清液，从人iPS细胞向胰激素产生细胞的分化诱导效率提高。

[0323] <实施例2>

[0324] 在工序(A1-1)、(A1-1)、或者工序(B1)、(C1)中添加IBCAP培养上清液或Mock培养上清液，并且将工序(E1)的培养时期设定为3天，除此以外，与实施例1同样地，对TIG3/KOSM细胞进行培养，通过定量性RT-PCR对胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的基因表达进行确认。

[0325] 经由工序(E1)得到的细胞中的胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量分别示于图2(a)、(b)。该图2(a)、(b)用将分化诱导前的TIG3/KOSM细胞中的胰高血糖素(GCG)及生长抑素(SST)的表达量设为1时的相对值来表示。

[0326] 如图2(a)所示，无添加的情况下，胰高血糖素(GCG)的诱导倍率为约120.1倍，与此相对，工序(A1-1)、(A1-2)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约100.7倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约193.8倍。此外，在工序(B1)、(C1)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约31.2倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约218.5倍。

[0327] 此外，如图2(b)所示，无添加的情况下，生长抑素(SST)的诱导倍率为约117.6倍，与此相对，工序(A1-1)、(A1-2)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约16.6倍；工序(A1-1)、(A1-2)中添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约65.2倍。此外，工序(B1)、(C1)中添加有Mock培养上清液的情况下，诱导倍率为约8.8倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率为约164.1倍。

[0328] 由上述结果可知，在工序(A1-1)、(A1-2)中添加IBCAP培养上清液的情况下、和在工序(B1)、(C1)中添加IBCAP培养上清液的情况下，从人iPS细胞至胰激素产生细胞的分化诱导效率均提高。

[0329] <实施例3>

[0330] (1)从小鼠胰组织干/祖细胞至胰激素产生细胞的分化诱导

[0331] 作为小鼠胰组织干/祖细胞，使用由埼玉医科大学的Matsumoto博士提供的Tec3DR细胞。该细胞是通过将从小鼠胎儿期的胰脏分离得到的组织干/祖细胞进行克隆化而建立的。Tec3DR细胞在添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、15％(v/v)FBS、50μM 2-巯基乙醇(Gibco)的DMEM培养基中被维持。

[0332] 在开始分化诱导的第一天，将Tec3DR细胞以1×105个/孔的细胞密度涂板到24孔板上，用添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、0.1％(v/v)BSA(牛血清白蛋白)(Sigma)、1％(v/v)ITS-X(Gibco)、55μM 2-巯基乙醇(Gibco)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)培养2天(工序(A3))。

[0333] 然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、0.1％(v/v)BSA(Sigma)、1％(v/v)ITS-X(Gibco)、55μM 2-巯基乙醇(Gibco)、50ng/mL激活素A(Humanzyme)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)，培养4天(工序(B3))。

[0334] 然后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、0.1％(v/v)BSA(Sigma)、1％(v/v)ITS-X(Gibco)、55μM 2-巯基乙醇(Gibco)、1μM视黄酸(Sigma)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)，培养4天(工序(C3))。

[0335] 然后，用胰蛋白酶-EDTA进行处理，由此回收培养中的细胞，以1×105个/孔的细胞密度涂板到24孔板上，用添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2mg/mL BSA(Sigma)、1％(v/v)ITS-X(Gibco)、10ng/mL FGF-2(Nacalai tesque)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)培养3天(工序(D3))。

[0336] 最后，将培养基更换为添加有1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)、2mg/mL BSA(Sigma)、1％(v/v)ITS-X(Gibco)、10ng/mL FGF-2(Nacalai tesque)、10mM烟酰胺(Sigma)的DMEM/Ham F12培养基(Gibco)，培养5天。在培养中途，经过2～3天后更换为新的培养基。
其后，向培养基中添加2％(v/v)IBCAP培养上清液或Mock培养上清液，进一步培养6天(工序(E3))。

[0337] (2)定量性RT-PCR分析

[0338] 对于分化诱导前的Tec3DR细胞、及经由工序(E3)得到的细胞，通过定量性RT-PCR确认了小鼠胰岛素-1(Ins1)的基因表达。具体而言，首先，使用NucleoSpinTM RNA II(Takara-bio)从细胞提取RNA，使用Power SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行定量性RT-PCR分析。引物序列如下所示。

[0339] MnIns1_qPCR_Fw：CACTTCCTACCCCTGCTGG(序列号8)

[0340] MnIns1_qPCR_Rv：ACGCCAAGGTCTGAAGGTC(序列号9)

[0341] 对于PCR产物，通过3％琼脂糖凝胶电泳进行分离，用溴化乙锭进行染色，通过BioDoc-It Imaging System(BMbio)使其可见。

[0342] 经由工序(E3)得到的细胞中的胰岛素-1(Ins1)的表达量示于图3。该图3用将分化诱导前的Tec3DR细胞中的胰岛素-1(Ins1)的表达量设为1时的相对值来表示。

[0343] 如图3所示，工序(E3)中添加有Mock培养上清液的情况下，胰岛素-1(Ins1)的诱导倍率约为0.3倍；添加有IBCAP培养上清液的情况下，诱导倍率约为17.0倍。

[0344] 由上述结果可知，通过在工序(E3)中添加IBCAP培养上清液，从小鼠胰组织干/祖细胞向胰激素产生细胞的分化诱导效率提高。