一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法

摘要

本发明的目的是提供一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法，首先制备圆柱体形明胶海绵的底垫，再制备用于盛装膜片套筒的明胶海绵圆柱环；将底垫和圆柱环灭菌后放入培养孔中，然后将培养完全的重组羊膜培养上皮膜片套筒放入海绵环的内部，加入细胞培养基浸湿细胞膜片和填充明胶海绵，然后封口膜封口后进行远程投递。本发明以明胶海绵做三维立体支架，其加入营养液后高度膨胀，可将培养套筒牢固固定，同时在底部的明胶海绵内吸附的营养液对细胞保持良好的营养作用，较好的保持细胞活性。且明胶海绵吸附的营养液可使细胞保持无菌、活性状态，同时添加的营养液不会因外漏造成细胞的污染，方便远程投递。

权利要求

1.一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：首先制备圆柱体形明胶海绵的底垫，再制备用于盛装膜片套筒的明胶海绵圆柱环；将底垫和圆柱环灭菌后放入培养孔中，然后将培养完全的重组羊膜培养上皮膜片套筒放入海绵环的内部，加入细胞培养基浸湿细胞膜片和填充明胶海绵，然后封口膜封口后进行远程投递。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底垫的直径为32mm，高度为6mm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的圆柱环的内径大于上皮膜片套筒的外径。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的圆柱环的内径为25mm，高度为10mm，厚度为3mm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底垫和圆柱环用环氧乙烷进行灭菌。

说明书

一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法。

背景技术

[0002] 角膜病是我国第二大致盲性眼病，据统计全国有单眼和双眼角膜盲人约400-500万，其中由于各种原因导致的角膜缘干细胞缺乏症患者占有相当比例。角膜缘干细胞的缺乏使角膜上皮失去再生和修复的能力，引起角膜结膜上皮化、新生血管长入、持续慢性炎症、反复的上皮缺损、基质瘢痕化以及角膜的自溶及溃疡，严重者可导致失明。对于全部角膜缘干细胞缺失的病人，必须采用自体或异体角膜缘干细胞移植才能得到稳定的角膜上皮表型，重建眼表。体外培养的角膜缘上皮移植或口腔黏膜上皮移植因要求材料小，对供体自身造成的损伤轻，体外扩增允许小量材料治疗大范围干细胞缺损，避免了异体材料免疫排斥，解决了双眼角膜缘干细胞全部缺失患者自体角膜缘无法取材的难题，成为治疗角膜缘干细胞缺乏症极具前景的技术，也是再生医学最早的成功实例之一。但是成熟的培养体系过程繁琐，且多采用饲养层细胞，培养基成分复杂，并不很好掌握，因此能将培养性状良好的膜片安全运送给需要移植的患者改善眼表状况尤为重要。但是目前远途运输重组羊膜培养上皮膜片时经常出现培养基缺失，细胞易污染凋亡的问题。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种远程投递重组羊膜培养上皮膜片的方法，即以三维立体支架，浸满营养液进行远程投递重组细胞上皮膜片的运送方法，从而有效弥补现有运输方法存在的问题，为现有的眼表重建手术治疗开辟广阔前景。

[0004] 本发明的方法，首先制备圆柱体形明胶海绵的底垫，再制备用于盛装膜片套筒的明胶海绵圆柱环；将底垫和圆柱环灭菌后放入培养孔中，然后将培养完全的重组羊膜培养上皮膜片套筒放入海绵环的内部，加入细胞培养基浸湿细胞膜片和填充明胶海绵，然后封口膜封口后进行远程投递。

[0005] 作为实施例的优选，底垫和圆柱环用明胶海绵制备的。底垫的一种尺寸为直径32mm，高6mm；

[0006] 且圆柱环的内径大于上皮膜片套筒的外径，其一种具体尺寸为内径25mm，高10mm，厚3mm。

[0007] 作为实施例的一种优选，底垫和圆柱环是用环氧乙烷进行灭菌的。

[0008] 本发明以明胶海绵做三维立体支架，其加入营养液后高度膨胀，可将培养套筒牢固固定，同时在底部的明胶海绵内吸附的营养液对细胞保持良好的营养作用，较好的保持细胞活性。且明胶海绵吸附的营养液可使细胞保持无菌、活性状态，同时添加的营养液不会因外漏造成细胞的污染，方便远程投递。

附图说明

[0009] 图1：本发明所使用的底垫和圆柱环的组装结构示意图，其中1为底垫，2为圆柱环。

[0010] 图2：本发明所使用的底垫和圆柱环的组装结构的剖面图。

具体实施方式

[0011] 本发明利用可吸收明胶海绵制备成了三维立体支架，固定细胞膜片，同时将明胶海绵吸满营养液保持细胞膜片活性，行远程投递，满足不同地区的角膜缘干细胞的缺乏病人手术治疗。本发明使用的明胶海绵符合药典，其主要成分为胶原蛋白、蛋白质。无菌、无热原能被人体组织所吸收，可任其留在人体内不必取出，可自然消化。

[0012] 下面对本发明的方法进行详细的描述。

[0013] 一、三维立体明胶支架的制备：

[0014] 制备明胶海绵底垫：将明胶海绵用圆规画出直径32mm的圆，量高度6mm，裁取圆垫制成底垫；

[0015] 制备明胶圆柱环：将明胶海绵用圆规画出直径25mm的圆，量高度10mm，截取圆柱，保留圆柱壁厚3mm，其余用环形不锈钢刀切去。将制备好的底垫和圆柱环用环氧乙烷灭菌备用(图1和图2)。

[0016] 二、三维立体明胶支架包装细胞膜片：

[0017] 将灭菌明胶海绵垫垫入6孔培养板底部，明胶海绵环置于培养孔边缘，培养的细胞膜片套筒从transwell中取出，上皮面朝上卡入明胶海绵环内，加入角膜缘干细胞培养液或口腔黏膜细胞培养液至饱和，封口膜密闭培养板，装入带有微电脑定时微控器保温盒内(温度控制为37℃)快递送出。

[0018] 三、运输48小时后细胞膜片检测

[0019] 1.细胞活性检测：取出细胞膜片，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA，37℃消化10min，1500rpm/min离心5min，加入细胞培养基离心重悬制成单细胞悬液，取10μl细胞悬液，加入等体积0.4％台盼蓝溶液混匀，细胞计数仪统计活细胞比例和总细胞量。

[0020] 2.细胞复层检测：取出细胞膜片，置于PBS中漂洗，加入快速固定液固定24小时后，脱水、包埋、切片、HE染色。细胞膜片紧密贴敷于羊膜面，细胞复层3-5层。

[0021] 实施例1

[0022] 运输48小时后，取出细胞膜片，一半膜片加入0.25％胰酶-0.02％EDTA，37℃消化10min，1500rpm/min离心5min，加入细胞培养基离心重悬制成单细胞悬液，取10μl细胞悬液，加入等体积0.4％台盼蓝溶液吹打混匀，使用细胞计数仪统计活细胞比例和总细胞量，
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细胞总量为6.26×10 ，其中活细胞比例为56％；另一半细胞膜片使用多聚甲醛固定、石蜡包埋后制作石蜡切片，行HE染色，观察细胞形态及膜片结构，镜下可见细胞膜片呈复层结构紧密贴附于均质的羊膜表面，约3-5层，细胞间排列紧密，底层细胞近立方状，而上层细胞较为扁平。

[0023] 实施例2

[0024] 按照常规方法制备三维立体明胶支架，灭菌明胶海绵垫垫入6孔培养板底部，明胶海绵环放入其上，将培养好的细胞膜片自transwell中取出，上皮面朝上卡入明胶海绵环内，向海绵中加入营养液至其饱和，盖上培养板上盖，封口膜密闭培养板，装入保温盒内快递运送。

[0025] 传统运输方法，将培养好的细胞膜片取出后，直接放在60mm培养皿中，加入少量培养基覆盖膜片，封口膜密闭后即装盒快递。由于细胞膜片无法固定，在运输过程中极易因为位置变化造成细胞膜片或细胞的脱落，且培养皿中的培养基容易溢出，均会影响细胞膜片的临床使用效果。本发明方法可使套筒在运输过程中保持稳定，从而避免细胞膜片发生脱落；其次，明胶海绵在运输过程能够保证膜片在较长时间的营养供给，对细胞活性影响较小。