阿魏中的新倍半萜香豆素及其制备方法和医疗用途

摘要

本发明涉及两个新倍半萜香豆素结构、制备方法和在制备预防或治疗癌症、神经退行性疾病药物领域的应用，所述的新倍半萜香豆素1和2，具有如下结构。1 2。

权利要求

1.阿魏中的倍半萜香豆素，其特征在于：具有如下结构

1                     2。

2.一种权利要求1所述倍半萜香豆素的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）阿魏（Ferula sinkiangensis K. M. Shen）树脂用溶剂提取，回收提取液得粗提物；

（2）步骤（1）所得粗提物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱、或以石油醚和丙酮混合溶剂梯度洗脱；

（3）上述步骤（2）中所得流分经ODS色谱分离，以甲醇和水混合溶剂为流动相梯度洗脱，或以乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

（4）上述步骤（3）中所得流分经HPLC-UV色谱分离，以甲醇和水混合溶剂为流动相梯度洗脱，或以乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱，得到倍半萜香豆素1；

（5）上述步骤（2）中所得流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷和丙酮混合溶剂展开，或以二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂展开，得到倍半萜香豆素2；

其中，

步骤（2）中所述洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、或石油醚和丙酮混合溶剂的体积比例为100：1～1：1；

步骤（3）中所述甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂的体积比例为2：8～9：1；

步骤（4）中所述流动相甲醇和水混合溶剂的体积比例为4：6～9：1；

步骤（5）中所述流动相二氯甲烷和丙酮混合溶剂、或二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂的体积比例为6：1～1：1；

所述阿魏树脂为伞形科（Umbelliferae）新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K. M. Shen）植物的根茎中得到的树脂。

3.按照权利要求2所述的倍半萜香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的提取方法为加热回流提取或加热超声提取1～3次，所用溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、环己烷中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1:5～1:15。

4.按照权利要求2所述的倍半萜香豆素的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述流动相乙腈和水混合溶剂的体积比例为2：8～7：3。

5.权利要求1所述的新的倍半萜香豆素在制备预防和治疗癌症、炎症、神经退行性疾病药物中的应用。

6.一种药物制剂，其包含有如权利要求1中所述的倍半萜香豆素或药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。

说明书

阿魏中的新倍半萜香豆素及其制备方法和医疗用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及新疆阿魏中的倍半萜香豆素及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 阿魏是伞形科(Umbelliferae)阿魏属(Ferula L.)植物的总称，是一类具有重要药用价值的珍稀植物资源，乃至人称“黄金有价，阿魏无价”。世界上约有150种，现主要分布于地中海、中亚及其邻近地区。阿魏多生长于内陆干旱荒漠地区，中国有26种、1变种，其中6种能分泌出葱蒜样臭味树脂的仅分布在新疆。近年来由于新疆阿魏资源遭过度采挖及生境地的变迁，分布面积极度萎缩，现为国家二级保护植物。

[0003] 阿魏在我国作为药用早在《唐本草》中就有一记载，其树脂入药，具有杀虫、消积散痞的功效。我国药典收录的中药阿魏是新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)和阜康阿魏(F.fukangensis K.M.Shen)的树脂，在新疆当地也有其他种的阿魏用于治疗胃痛等疾病。现代研究表明其具有抗生育、免疫抑制、解热、镇痛、抗炎等广泛的药理活性，近年来由于发现其中具有植物雌激素活性成分和抗癌物质而倍受人们关注。

[0004] 阿魏属植物化学成分多样，以倍半萜香豆素类(sesquiterpene coumarins)、倍半萜类(sesquiterpenes)及多硫化合物(polysulfanes)为其化学特性，其中倍半萜香豆素类成分多具有显著的生物活性，是阿魏药效成分的主要代表。由于倍半萜香豆素类成分极性差异较小、立体化学问题复杂，因而在分离纯化、结构鉴定和评价单体化合物药理活性过程中有一定困难。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供阿魏中的两个新倍半萜香豆素及其制备方法和新的医药用途。

[0006] 本发明提供了新的倍半萜香豆素1和2，1为双环倍半萜香豆素，2为单环倍半萜香豆素，其具有如下结构。

[0007]

[0008] 本发明还提供了所述新的倍半萜香豆素1和2的制备方法，该方法包括如下步骤：

[0009] (1)阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)树脂用二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯或丙酮、石油醚或环己烷提取，回收提取液得粗提物；

[0010] (2)步骤(1)所得粗提物经硅胶柱色谱法分离，以洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂，或石油醚和丙酮混合溶剂梯度洗脱；

[0011] (3)上述步骤(2)中所得流分经ODS色谱分离，以甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

[0012] (4)上述步骤(3)中所得流分经HPLC-UV色谱分离，以甲醇和水混合溶剂，或乙腈和水混合溶剂为流动相洗脱，得到倍半萜香豆素1。

[0013] (5)上述步骤(2)中所得流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷和丙酮混合溶剂，或二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂展开，得到倍半萜香豆素2。

[0014] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素1和2的制备方法，所述新疆阿魏为新疆阿魏为伞形科(Umbelliferae)新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)植物的根茎中得到的树脂。

[0015] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素1和2的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或加热超声提取1-3次。所用溶剂为：二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯或丙酮、石油醚或环己烷，优选二氯甲烷或氯仿。药材：溶剂重量体积比为1:5～1:15，优选1:6～1:10。

[0016] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素1和2的制备方法，步骤(2)中所述石油醚和乙酸乙酯混合溶剂，或石油醚和丙酮混合溶剂，混合溶剂的比例为100：1～1：1,优选100:2～2:1。

[0017] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素1的制备方法，步骤(3)中所述甲醇和水混合溶剂，或乙腈和水混合溶剂，混合溶剂的比例为2：8～9：1，优选3：7～8：2。

[0018] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素1的制备方法，步骤(4)中所述流动相甲醇和水混合溶剂的比例为4：6～9：1，优选6：4～8：1乙腈和水混合溶剂的比例为2：8～7：3，优选3：7～1：1。

[0019] 本发明提供的所述新的倍半萜香豆素2的制备方法，步骤(2)中所述流动相二氯甲烷和丙酮混合溶剂，或二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂，混合溶剂的比例为6：1～1：1，优选5：1～3：1。

[0020] 本发明以体外抗肿瘤实验模型、LPS刺激的RAW264.7细胞模型和LPS诱导的小胶质细胞过度活化模型，对制备得到的新倍半萜香豆素1和2的抗癌、抗炎、抗神经炎症活性进行了评价。结果显示，化合物1和2能够显著的抑制人肺癌细胞系A549，H292，H358，H226，人白血病细胞HL60、人胶质瘤细胞U87、人前列腺癌细胞DU145的生长，显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞NO释放，显著抑制LPS诱导的小胶质细胞释放NO。因此，本发明中制备的新倍半萜香豆素可在开发抗肿瘤、抗炎和治疗神经退行性疾病药物方面应用。

[0021] 本专利首次提供了以阿魏树脂为原料，大量富集、鉴定两个新的倍半萜香豆素的方法，并系统评价了其抑制肿瘤细胞生长、抗炎、神经保护方面的活性，阐明了其在开发抗肿瘤、抗炎和治疗神经退行性疾病药物方面的应用。

附图说明

[0022] 图1本发明倍半萜香豆素1的1H NMR谱；

[0023] 图2本发明倍半萜香豆素1的13C NMR谱；

[0024] 图3本发明倍半萜香豆素1的HSQC谱；

[0025] 图4本发明倍半萜香豆素1的HMBC谱；

[0026] 图5本发明倍半萜香豆素1的NOESY谱；

[0027] 图6本发明倍半萜香豆素1的ECD谱；

[0028] 图7本发明倍半萜香豆素2的1H NMR谱；

[0029] 图8本发明倍半萜香豆素2的13C NMR谱；

[0030] 图9本发明倍半萜香豆素2的HSQC谱；

[0031] 图10本发明倍半萜香豆素2的HMBC谱；

[0032] 图11本发明倍半萜香豆素2的NOESY谱；

[0033] 图12本发明倍半萜香豆素2的ECD谱；

[0034] 图13本发明倍半萜香豆素1的重要HMBC和NOESY相关信号图；

[0035] 图14本发明倍半萜香豆素2的重要HMBC和NOESY相关信号图。

具体实施方式

[0036] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

[0037] 实施例1

[0038] (1)新疆阿魏树脂900g用二氯甲烷提取1次(用量：5.4L)，减压回收提取液得粗提物；

[0039] (2)步骤(1)所得二氯甲烷提取物经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚：乙酸乙酯100:2,100:6,10:1,8:1,6:1,4:1,2:1洗脱，

[0040] (3)上述步骤(2)中所得的石油醚：乙酸乙酯100:2～100:6流分经ODS色谱分离，以甲醇/水4：6，1:1，6:4，9:1为流动相梯度洗脱；

[0041] (4)上述步骤(3)中所得甲醇：水(6：4)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，以甲醇：水(7：3)为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素1(tR＝96min)(收率0.013％)。

[0042] (5)上述步骤(2)中所得的石油醚：乙酸乙酯4:1～2:1流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷/丙酮5:1为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素2(收率0.28％)；

[0043] 根据倍半萜香豆素1和2的理化性质和波谱数据鉴定了其结构(倍半萜香豆素1和2的核磁谱图见附图1-14)。

[0044] 倍半萜香豆素1的结构鉴定数据如下：

[0045] 无色油状(甲醇)， HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 405.2037[M+Na]+:(calcd.for C24H30NaO4,405.2036)，得其分子式为C24H30O4，不饱和度为
10。1H NMR和13C NMR见表1。HMBC和NOESY相关信号见图13。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的谱图与计算得到的对映异构体为(3'S,8'R,9'S,10'R)-1的ECD图谱进行比较，谱图相吻合，表现为在200-220nm区域有负Cotton效应，在240-270nm，290-310nm和340-360nm区域有正Cotton效应(见附图6)。因此，确定该化合物的绝对构型为3'S,8'R,9'S,10'R。

[0046] 倍半萜香豆素2的结构鉴定数据如下：

[0047] 白色结晶(二氯甲烷-甲醇)， HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 423.2140[M+Na]+:(calcd.for C24H32NaO5,423.2142)，得其分子式为C24H32O5，不饱和度为9。1H NMR和13C NMR见表1。HMBC和NOESY相关信号见附图14。该化合物的绝对构型确定采用与化合物1相同的ECD计算方法，化合物2实际测出的谱图与计算得到的化合物2的对映异构体(3'R,5'R,10'R)-2的ECD图谱进行比较，两者基本吻合。表现为在200-210nm区域有正Cotton效应，在210-215nm区域和290-330nm区域有负Cotton效应(见附图12)。因此，确定该化合物的绝对构型为3'R,5'R,10'R。

[0048] 倍半萜香豆素1和2的NMR数据归属见表1

[0049] 表1倍半萜香豆素1和2的NMR数据

[0050]

[0051] 实施例2

[0052] (1)新疆阿魏树脂1000g用丙酮提取3次(用量：10L)，减压回收提取液得粗提物；

[0053] (2)步骤(1)所得丙酮提取物经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚：丙酮100:3,100:6,10:1,5:1,3:1,2:1洗脱，

[0054] (3)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮100:3流分经ODS色谱分离，以乙腈/水2:8,4:6,6:4，9:1为流动相梯度洗脱；

[0055] (4)上述步骤(3)中所得乙腈：水(4：6)流分经HPLC-UV色谱分离，以乙腈：水(4：6)为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素1(tR＝59min)(收率0.014％)。

[0056] (5)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮3:1流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯3:1为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素2(收率0.31％)；

[0057] 倍半萜香豆素1和2的结构鉴定方法见实施例1。

[0058] 实施例3

[0059] (1)新疆阿魏树脂2000g用环己烷提取2次(用量：10L)，减压回收提取液得粗提物；

[0060] (2)步骤(1)所得环己烷提取物经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚：丙酮100:1,100:8,100:15,5:1,3:1,2:1，1:1洗脱；

[0061] (3)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮100:8流分经ODS色谱分离，以乙腈/水3：7，4:6，1:1，8:2为流动相梯度洗脱；

[0062] (4)上述步骤(3)中所得乙腈：水(4：6)流分经HPLC-UV色谱分离，以乙腈：水(3：7)为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素1(tR＝82min)(收率0.012％)。

[0063] (5)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮3:1流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷/丙酮6:1为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素2(收率0.24％)；

[0064] 倍半萜香豆素1和2的结构鉴定方法见实施例1。

[0065] 实施例4

[0066] (1)新疆阿魏树脂1500g用氯仿提取1次(用量：22.5L)，减压回收提取液得粗提物；

[0067] (2)步骤(1)所得环己烷提取物经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚：乙酸乙酯100:5,100:10,100:15,4:1,3:1,2:1洗脱；

[0068] (3)上述步骤(2)中所得的石油醚：乙酸乙酯100:10和100:15流分合并后经ODS色谱分离，以甲醇/水3：7，1:1，7:3为流动相梯度洗脱；

[0069] (4)上述步骤(3)中所得甲醇：水(1：1)流分经HPLC-UV色谱分离，以甲醇：水(75：25)为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素1(tR＝86min)(收率0.014％)。

[0070] (5)上述步骤(2)中所得的石油醚：乙酸乙酯4:1流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯1:1为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素2(收率0.22％)；

[0071] 倍半萜香豆素1和2的结构鉴定方法见实施例1。

[0072] 实施例5

[0073] (1)新疆阿魏树脂1000g用环己烷提取2次(用量：8L)，减压回收提取液得粗提物；

[0074] (2)步骤(1)所得环己烷提取物经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚：丙酮100:5,100:10,100:15,5:1,2:1，1:1洗脱；

[0075] (3)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮100:10流分经ODS色谱分离，以甲醇/水4:6，5:5，6:4，7:3为流动相梯度洗脱；

[0076] (4)上述步骤(3)中所得甲醇：水(6：4)流分经HPLC-UV色谱分离，以甲醇：水(4：6)为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素1(tR＝175min)(收率0.011％)。

[0077] (5)上述步骤(2)中所得的石油醚：丙酮2:1流分经制备薄层色谱分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯4:1为流动相洗脱得到新倍半萜香豆素2(收率0.26％)；

[0078] 倍半萜香豆素1和2的结构鉴定方法见实施例1。

[0079] 实施例6实施例1-5中制备得到的新倍半萜香豆素1和2的体外抗肿瘤活性测试[0080] (1)实验原理

[0081] 细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3，5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定492nm出的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。

[0082] (2)实验方法

[0083] ①实验细胞株来源及培养方法

[0084] 人肺癌细胞A549；人肺癌细胞H292；人肺癌细胞H358；人肺癌细胞H226；人白血病细胞HL-60；人胶质瘤细胞U87；人前列腺癌细胞DU145均购自ATCC。

[0085] 取对数生长期的癌细胞，以内含10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum)的RPMI-1640培养液稀释为6×103个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板中，100μL/孔，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养48h。

[0086] ②药物配置

[0087] 样品均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mg/mL的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释，稀释为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL及0.1μg/mL进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。阳性药依托泊苷浓度为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L和0.1μmol/L。

[0088] ③MTT法检测受试药物的细胞毒活性

[0089] 取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设6个复孔。药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3-4h，离心，小心吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。

[0090]

[0091] ④统计方法

[0092] 全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。

[0093] ⑤IC50的计算方法

[0094] 将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。

[0095] (3)实验结果：见表2

[0096] 表2倍半萜香豆素1和2对A549，H292，H358，H226，HL-60，U87，DU145人癌细胞的生长抑制活性

[0097]

[0098] CDDP(顺铂)为阳性对照药物

[0099] 结果表明实施例1-5中所制备得到的新倍半萜香豆素1和2具有显著的体外抗肿瘤活性，新倍半萜香豆素1可显著抑制H292，H358，H226，HL-60，U87，DU145其中人癌细胞系的生长；新倍半萜香豆素2可显著抑制A549，H292，H358，H226，HL-60，U87，DU145其中人癌细胞系的生长。

[0100] 实施例7实施例1-5中制备得到的新倍半萜香豆素1和2的抗炎活性测试[0101] (1)实验原理

[0102] 细胞增殖是个复杂的过程，整个过程受到信号通路网络性的调控，包括细胞外信号和细胞内级联放大信号。阻断细胞增殖信号的传递,就能抑制RAW264.7细胞的增殖，减轻炎症发生。一氧化氮(NO)是从血管内皮中发现的气体信号分子，是一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸产生的5个电子的氧化物，有活跃的生化性质，既是一种新的第二信使神经递质，也是一个活性很强的自由基，具有细胞毒性和抗炎保护的双重作用。NO在炎症及其免疫机制中发挥着双重作用，它能抑制细胞内外微生物和肿瘤细胞的活性；同时它又介导细胞毒性。自身免疫炎症疾病的病理过程与NO释放量密切相关。

[0103] (2)实验方法：

[0104] ①RAW264.7巨噬细胞系的培养

[0105] 细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础培养基配制成内含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素及50μM 2-巯基乙醇的细胞培养液。巨噬细胞以约4×105cells/mL的浓度在5％CO2，37℃培养瓶中传代培养。

[0106] ②药物配制方法

[0107] 待测样品均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM或100μg/mL，储存于-20℃。临用时用无血清DMEM培养液进行稀释，依次稀释为100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL和1μg/m。DMSO终浓度<1‰。

[0108] ③Griess法检测化合物对LPS刺激巨噬细胞的抑制作用[3]

[0109] 取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至5×105cells/mL，接种于96孔板内，100μL/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。样品与LPS共同作用。各给药组及阳性对照组中LPS终浓度为10ng/mL。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，
2-
Griess比色法检测上清液中NO 含量。

[0110] ④MTT法检测化合物对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响[4]

[0111] 取对数生长期培养的RAW264.7巨噬细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至5×105cells/mL，接种于96孔板内，100μL/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。样品号与LPS共同作用。同时设空白对照和阳性对照。各给药组及阳性对照组中LPS终浓度为10ng/mL。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μL/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入等体积的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品三个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞存活率(Cell Viability，CV％)：

[0112] 细胞存活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％[0113] ⑤统计方法

[0114] 全部资料采用SPSS13.0统计软件包进行检验分析。结果用Mean±SE表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’stest分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当P>0.05，方差是齐性，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当P<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

[0115] ⑥IC50的计算方法[5]

[0116] 将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。

[0117] (3)实验结果：见表3

[0118] 表3倍半萜香豆素1和2对LPS刺激RAW264.7细胞NO释放(％)的影响

[0119]

[0120] 结果可知，在不影响细胞存活率的条件下，新倍半萜香豆素1和2可降低LPS刺激的RAW264.7细胞炎症因子NO释放，这提示其可能对炎症反应产生调节作用。

[0121] 实施例8实施例1-5中制备得到的新倍半萜香豆素1和2的抑制小胶质细胞过度活化活性测试

[0122] (1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活N9小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价龙血竭提取物和新聚合物1和2的抗炎活性。

[0123] (2)实验方法：

[0124] ①小鼠小胶质细胞系N9的培养

[0125] 细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及50μM 2-巯基乙醇的细胞培养液。小胶质细胞以约4×105cells/ml的浓度在5％CO2，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积50-60％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的N9作为第一代，选择第3-8代N9细胞进行实验。

[0126] ②药物配制方法

[0127] 2种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为50mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为50μM、10μM、1μM、0.1μM。DMSO终浓度<1‰。

[0128] ③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用

[0129] 取对数生长期的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。1种化合物设剂量0.1、1、10、50μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO2-含量。

[0130] ④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响

[0131] 取对数生长期培养的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。2种化合物设剂量0.1、1、10、50μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养
24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育
3h，吸除培养液，然后加入100μl的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品6个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。

[0132] 细胞成活率％＝

[0133] 样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％

[0134] ⑤统计方法

[0135] 全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

[0136] ⑥IC50的计算方法

[0137] 将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50

[0138] (3)实验结果：见表4

[0139] 表4新倍半萜香豆素1和2抑制小胶质细胞活化作用实验结果

[0140]

[0141] 结果可知，阿魏氯仿提取物及实施例1-5中制备得到的新倍半萜香豆素1和2在不影响小胶质细胞N9存活率的情况下，可显著抑制LPS诱导的过度活化的N9细胞的NO释放，从而对神经炎症起到预防和治疗的作用。