一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其应用转让专利
申请号 : CN201410632550.5
文献号 : CN104449670B
文献日 : 2016-05-25
发明人 : 杜吕佩 , 李敏勇 , 刘真真
申请人 : 山东大学
摘要 :
本发明公开了一种苯基呋喃类小分子荧光探针及其应用。该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：式中，R1为卤素、烷基或烷氧基的单取代基或多取代基；R2为荧光团；n＝1-6；哌嗪环与荧光团之间以含1-6个碳的烷基链连接。该荧光探针分子可用来标记hERG钾离子通道，可用于hERG钾离子通道抑制剂的活性筛选及上市药物的心脏毒性的评价，另外也可作为工具药来进行hERG钾离子通道相关的药理、病理及生理学研究。此外，该类化合物制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单。
权利要求 :
1.一种苯基呋喃类小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：
式中，R1为卤素；R2为荧光团；n＝1-6；哌嗪环与荧光团之间以含1-6个碳的烷基链连接。
2.如权利要求1所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，所述R1为卤素；R2为萘二酰亚胺类、荧光素类、香豆素类、尼罗红类或Cy类荧光团。
3.如权利要求2所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，所述R1为卤素；R2为萘二酰亚胺类或荧光素类荧光团。
4.如权利要求1所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，该荧光探针选自具有如下结构式的化合物：
5.权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)识别基团的制备：将取代苯胺在酸性条件下，与亚硝酸钠反应，生成重氮盐，再与糠醛在CuCl2的催化下发生偶联反应，生成4-取代苯基呋喃醛，再与1-氨基海因盐酸盐在水溶液中反应,然后与1-溴-4-氯丁烷反应生成(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-
2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮，接着再与单BOC保护的哌嗪发生取代反应，最后将BOC用TFA脱除，得到(E)-1-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-3-(4-(哌嗪-1-基)丁基)咪唑啉-2,4-二酮；
(2)探针分子的制备：在荧光团上引出能发生取代的基团，最后通过取代反应与(E)-1-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-3-(4-(哌嗪-1-基)丁基)咪唑啉-2,4-二酮反应，制备探针分子；或者在荧光团上引入哌嗪环，然后再与(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮发生取代反应，制备探针分子。
6.如权利要求5所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，取代苯胺、亚硝酸钠和糠醛的加入的摩尔比为1：1：1.5。
7.如权利要求5所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述取代苯胺为4-卤素取代的苯胺。
8.如权利要求5所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在荧光团上引出的能发生取代的基团为卤素或磺酸酯。
9.权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道识别中的应用。
10.权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道抑制剂高通量筛选及其在新药心脏毒性评价中的应用。
11.权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道细胞及组织成像中的应用。
说明书 :
一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种苯基呋喃类衍生物及其作为hERG钾离子通道小分子荧光探针,以及其在hERG钾离子通道抑制剂活性筛选、新药心脏毒性评价及细胞成像中的应用，属于药物技术领域。
背景技术
[0002] hERG的全称是human ether-a-go-go related gene，它是从人的海马神经中分离出来的基因。hERG基因编码形成电压激活延迟内向整流的钾离子通道，大量分布在人的神经系统和心脏组织中。在心脏组织中与起调节作用的β亚基KCNE2形成快速激活延迟整流钾通道(IKr)，是心脏动作电位Ⅲ期复极化延迟整流钾电流的快相成分。hERG基因突变将引起LQTS(QT延长综合征)、SQTS(QT缩短综合征)等遗传性疾病。
[0003] hERG通道是III类抗心律失常药物作用的主要靶点。但近年来,发现各类非抗心律失常药物,包括抗生素类药(如磺胺甲基异恶唑)、抗精神病类药(如氯丙嗪)、抗组胺药(如特非那定)、胃动力药(如西沙比利)、抗疟药(如氯氟苯醇)等,易引起促心律失常的副作用，导致用药者突然死亡。这些药物产生导致心律失常副作用的原因是药物与心脏hERG通道有较高的亲和力，进而引起获得性QT延长综合征，引发像早后除极或严重的尖端扭转型心律失常。目前药物临床前研究中都要检测对心脏的毒性，其中检测的靶点为hERG钾通道。
[0004] 目前对hERG离子通道的高通量筛选方法主要四种，即放射性配体结合或取代实验、离子流的测量、膜片钳电流分析以及基于荧光探针的检测方法等。放射性配体结合或取代方法需要使用放射性元素，会造成辐射危害；离子流检测则需要特殊的设备，价格较贵。膜片钳的电流分析是离子通道活性检测的“金标准”，但其筛选通量较低，测量时技术要求很高及劳动量高。虽然目前出现了半自动及全自动的膜片钳仪器，提高了筛选通量，但这种仪器的价格昂贵，一般实验室难以承受。荧光探针的筛选方法无需特殊设备，一般实验室都具备检测，测定方法简便快捷，是目前最为方便的初筛方法，深入筛选采用电压膜片钳技术。而基于荧光探针的筛选方法主要是采用电压敏感荧光探针，像带负电荷的菁类染料DiSBAC4(3)、Molecular Device公司研发的FMP染料、基于荧光共振能量转移的荧光染料对(CC2-DMPE/DiSBAC2(3)或者CC2-DMPE/DiSBAC4(3)染料对)等。这些荧光染料通过检测药物对细胞膜电位的影响，来反映药物对离子通道的抑制活性。但这种荧光测定方法只是反映对细胞所有离子通道的活性的影响，容易出现假阳性的结果。因此，研究建立针对hERG钾离子通道的荧光探针高通量筛选方法对药物研发及临床前评价药物的安全性具有重要意义，这种方法将直接反应化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，可有效降低假阳性结果的出现。
[0005] 另外，在hERG钾离子通道病理、生理学研究中，电压膜片钳技术仍是离子通道研究的最常用手段，也是最可靠的手段，但此方法对实验人员的技术要求较高，且需要特殊设备。因此，人们经常寻找其他的替代方法进行研究。近年来伴随着荧光分析法在生物化学、医学和化学研究中的发展，大量的荧光探针因其高灵敏度、动态分辨率以及与生物细胞和生理学分析的兼容性被广泛应用于各种生物分析中。目前荧光探针的种类主要包括有机小分子、纳米量子点、稀土配合物、蛋白质类等，其中小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量和易自动化等特点，已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。目前还没有文献报道小分子荧光探针在离子通道结构和功能的研究及离子通道参与的病理生理机制研究中的应用，文献大多报道采用功能性荧光蛋白(FPs)标记技术、免疫荧光技术、应用于细胞的Ca2+或Na+荧光探针等对离子通道进行研究，这使得采用荧光小分子探针对离子通道的生物、生理学性质研究发展滞后。因此，如果能构建出针对hERG钾离子通道的高选择性、高灵敏度的小分子荧光探针，并以此探针分子作为工具药去研究hERG钾离子通道生物学和生理学特征，将会为离子通道的研究提供更方便、更有效、全新的研究手段，从而推动离子通道相关研究的发展。
发明内容
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种苯基呋喃类小分子荧光探针及其制备方法和在制药领域的应用。该小分子荧光探针对hERG钾离子通道具有高选择性和高灵敏度，可以作为工具药去研究hERG钾离子通道生物学和生理学特征。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种苯基呋喃类小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：
[0009]
[0010] 式中，R1为卤素、烷基或烷氧基的单取代基或多取代基；R2为荧光团；n＝1-6；哌嗪环与荧光团之间以含1-6个碳的烷基链连接。
[0011] 优选的，所述R1为卤素、甲基、甲氧基及叔丁氧基；R2为萘二酰亚胺类、荧光素类、香豆素类、尼罗红类或Cy类荧光团。
[0012] 进一步优选的，所述R1为卤素；R2为萘二酰亚胺类或荧光素类荧光团。
[0013] 更优选的，本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针选自具有如下结构式的化合物：
[0014]
[0015] 该苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0016] (1)识别基团的制备：各种取代的苯胺(1eq)在酸性条件下，与亚硝酸钠(1eq)反应，生成重氮盐，再与糠醛(1.5eq)在CuCl2(0.2eq)的催化下发生偶联反应，生成4-取代苯基呋喃醛，再与1-氨基海因盐酸盐在水溶液中反应,生成(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮，接着再与单BOC保护的哌嗪发生取代反应，最后将BOC用TFA(三氟乙酸)脱除，得到(E)-1-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-3-(4-(哌嗪-1-基)丁基)咪唑啉-2,4-二酮；
[0017] (2)探针分子的制备：根据现有文献报道，制备各种荧光团，然后在荧光团上引出卤素、磺酸酯或期待可发生取代的基团，最后通过取代反应与(E)-1-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-3-(4-(哌嗪-1-基)丁基)咪唑啉-2,4-二酮反应，制备探针分子；或者在荧光团上引入哌嗪环，然后再与(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮发生取代反应，制备探针分子。
[0018] 优选的，步骤(1)中，所述苯胺为卤素取代的苯胺。
[0019] 步骤(1)中，1-氨基海因盐酸盐与4-取代苯基呋喃醛加入量的摩尔比为2:1；(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮与单BOC保护的哌嗪加入量的摩尔比为1:1.1。
[0020] 步骤(2)中，引出卤素、磺酸酯或能发生取代的基团的荧光团与(E)-1-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-3-(4-(哌嗪-1-基)丁基)咪唑啉-2,4-二酮加入量的摩尔比为(1.16-1.60)：(1.13-1.35)；
[0021] 引入哌嗪环的荧光团与(E)-3-(4-氯丁基)-1-(((5-(4-取代苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)咪唑啉-2,4-二酮加入量的摩尔比为(0.17-0.26)：(0.25-0.33)。
[0022] 本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针可以作为识别hERG钾离子通道的探针进行应用。
[0023] 本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道抑制剂高通量筛选及其在新药心脏毒性评价中的应用。
[0024] 本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道细胞及组织成像中的应用。
[0025] 本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道异常表达肿瘤相关疾病诊断中的应用。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明的苯基呋喃类小分子荧光探针对hERG钾离子通道具有高选择性和高灵敏度，可以用于高通量筛选hERG钾离子通道抑制剂，能够直接反应化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，可有效降低了假阳性结果的出现。
附图说明
[0028] 图1a为探针分子L1与hERG钾离子通道结合后的荧光强度的变化；
[0029] 图1b为探针分子L5与hERG钾离子通道结合后的荧光强度的变化；
[0030] 图2a为基于细胞的阿司咪唑(Astemizole)竞争性结合曲线；
[0031] 图2b为基于细胞的索他洛尔(Sotalol)竞争性结合曲线；
[0032] 图3为探针分子L5的细胞成像图。
具体实施方式
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0034] 实施例1：(E)-2-(5-烯丙基-2,7-二氯-4-((4-(4-(3-(((5-(4-氯苯基)呋喃-2-基)亚甲基)氨基)-2,5-二氧咪唑-1-基)丁基)哌嗪-1-基)甲基)-6-羟基-3-氧-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸的制备
[0035] 具体合成路线如下：
[0036]
[0037] (1)中间体1的制备：
[0038] 向对氯苯胺(2.55g，20mmol)中加入20mL蒸馏水和14mL浓盐酸，出现白色浑浊，加热至70℃，完全溶解；冷却至0℃后，缓慢滴加亚硝酸钠溶液(1.38g溶于10mL蒸馏水，20mmol)，滴毕，反应液澄清，继续反应20min，加入糠醛(2.88g，30mmol)及氯化铜(0.54g，
4mmol)，反应液呈绿色，搅拌过夜，析出棕色固体，抽滤得棕绿色固体，滤饼依次用少量水、饱和碳酸钠溶液及石油醚洗涤，得棕黄色固体，固体用甲醇/乙醇重结晶，活性炭脱色，得银灰色固体，收率为25.4％，1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ＝9.65(s,1H),7.77-7.74(dd,J＝
6.9Hz,2.1Hz,2H),7.41-7.44(dd,J＝6.9Hz,2.1Hz,2H),7.33-7.21(d,J＝3.9Hz,1H),
6.84-6.83(d,J＝3.9Hz,1H)；ESI-MS:[M+H]+:207.1。
4mmol)，反应液呈绿色，搅拌过夜，析出棕色固体，抽滤得棕绿色固体，滤饼依次用少量水、饱和碳酸钠溶液及石油醚洗涤，得棕黄色固体，固体用甲醇/乙醇重结晶，活性炭脱色，得银灰色固体，收率为25.4％，1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ＝9.65(s,1H),7.77-7.74(dd,J＝
6.9Hz,2.1Hz,2H),7.41-7.44(dd,J＝6.9Hz,2.1Hz,2H),7.33-7.21(d,J＝3.9Hz,1H),
6.84-6.83(d,J＝3.9Hz,1H)；ESI-MS:[M+H]+:207.1。
[0039] (2)中间体2的制备：
[0040] 1-氨基海因盐酸盐(0.3g，2mmol)中加入蒸馏水6mL，及中间体1(0.21g，1mmol),80℃搅拌4h，过滤，滤饼用少量冷水洗涤，干燥，得浅粉色固体，收率为89.1％，260℃分解，1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)):δ＝11.30(s,1H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.73(s,1H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H),7.19(d,J＝3Hz,1H),6.96(d,J＝3.6Hz,1H),4.35(s,2H)；ESI-MS:[M+H]+:
304.3。
304.3。
[0041] (3)中间体3的制备：
[0042] 1-溴-4-氯丁烷(0.18mL，1.5mmol)中加入K2CO3(0.14g，1mmol)及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)3mL，将中间体2(0.3g，1mmol)溶于8mL DMF中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加入1-溴-4-氯丁烷溶液中，反应液保持50℃。滴加完毕，升温至65℃，继续反应1h，向反应液中加入适量蒸馏水，抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，得黄色固体，干燥得固体，收率为65.1％。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ7.80(m,3H),7.55(m,2H),7.18(d,J＝3.3Hz,1H),7.00(d,J＝3.3Hz,1H),4.40(s,2H),3.56-3.49(m,4H),1.83-1.68(m,4H)；ESI-MS:([M+H]+):438.4。
[0043] (4)中间体4的制备：
[0044] 将中间体3(0.3g,0.68mmol)溶于10mL乙腈中，加入单BOC保护的哌嗪(0.14g,0.75mmol)及K2CO3(0.19g,1.37mmol)，回流反应4h。然后向反应液中加入适量蒸馏水，抽滤，滤饼用乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂重结晶，得黄色固体，收率为55.9％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ7.94(s,1H),7.69(dt,J＝8.4,1.8Hz,2H),7.38(d,J＝8.7,1.8Hz,2H),6.91(d,J＝3.6Hz,1H),6.75(d,J＝3.6Hz,1H),4.24(s,2H),3.66(t,J＝7.2Hz,2H),3.43(t,J＝
4.8Hz,4H),2.38-2.35(m,6H),1.76-1.66(m,2H),1.57-1.50(m,1H),1.45(s,9H)；ESI-MS:
[M+H]+:544.5。
4.8Hz,4H),2.38-2.35(m,6H),1.76-1.66(m,2H),1.57-1.50(m,1H),1.45(s,9H)；ESI-MS:
[M+H]+:544.5。
[0045] (5)中间体5的制备：
[0046] 将中间体4(0.2g,0.37mmol)溶于2mL CH2Cl2中，加入1mL三氟乙酸，室温搅拌反应3h，加入适量蒸馏水，用NaHCO3饱和溶液调节pH至碱性，用CH2Cl2(40mL×3)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得浅黄色固体，收率75.0％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ7.95(s,1H),7.69(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝3.6Hz,1H),6.75(d,J＝
3.6Hz,1H),4.24(s,2H),3.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.99(m,3H),2.51-2.36(m,8H),1.75-1.66(m,2H),1.58-1.48(m,1H)；ESI-MS:([M+H]+):444.5。
3.6Hz,1H),4.24(s,2H),3.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.99(m,3H),2.51-2.36(m,8H),1.75-1.66(m,2H),1.58-1.48(m,1H)；ESI-MS:([M+H]+):444.5。
[0047] (6)中间体7的制备：
[0048] 将2,7-二氯荧光素(0.50g,1.25mmol)及K2CO3(0.52g，3.75mmol)溶于6mL DMF中，在冰浴下滴加溴丙炔，(0.29g,2.5mmol)，室温搅拌反应4h。反应完毕后，向反应液中加入适量蒸馏水(40mL)，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机层，无水Na2SO4干燥，抽滤，浓缩，得产物粗品，过柱，得橘红色固体，收率58.3％。m.p.177.0-178.5℃.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.35(dd,J＝7.5Hz,1.2Hz,2H),7.82-7.72(m,2H),7.31(dd,J＝7.5Hz,1.2Hz,1H),7.04-
7.03(m,2H),6.97(s,1H),6.68-6.64(m,1H),6.15-6.02(m,1H),5.75-5.62(m,1H),5.56(d,J＝17.1Hz,1H),5.44(d,J＝10.8Hz,1H),5.21-5.14(m,2H),4.77(br d,J＝5.1Hz,2H),
4.54(dd,J＝6Hz,1.2Hz,2H)；ESI-HRMS:([M+H]+)calcd for C26H19Cl2O5:481.0630,found:
481.0639。
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4.54(dd,J＝6Hz,1.2Hz,2H)；ESI-HRMS:([M+H]+)calcd for C26H19Cl2O5:481.0630,found:
481.0639。
[0049] (7)中间体8的制备：
[0050] 将中间体7(0.20g,0.41mmol)溶于1mL二苯醚中，155℃油浴反应3h。然后，将反应液冷却至室温，直接湿法上柱纯化，得橘红色固体，收率55.4％。m.p.200.0-202.5℃.1H-NMR(400MHz,CD3OD):δ8.33(dd,J＝6.4Hz,1.2Hz,1H),7.89-7.82(m,2H),7.47(dd,J＝6.4,1.2Hz,1H),7.06(s,2H),7.00(s,1H),6.01-5.97(m,1H),5.60-5.56(m,1H),5.21-5.16(dd,J＝16.8,1.6Hz,1H),5.10-5.03(m,3H),4.50-4.47(m,2H),3.64(m,2H).ESI-HRMS:([M+H)]+)calcd for C26H19Cl2O5:481.0630,found:481.0635。
[0051] (8)中间体9的制备：
[0052] 将中间体8溶于2mL 1,4-二氧六环和水(2mL:0.6mL)的混合溶剂中，加入LiOH(35mg,0.832mmol)，回流反应2h。然后将反应液冷却至室温，用1N HCl水溶液调节至酸性，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水MgSO4干燥，抽滤，浓缩，得产物粗品，过柱纯化，得橘红色固体，收率67.7％，m.p.105.0-107.0℃.1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.02(d,J＝7.2Hz,1H),7.72-7.63(m,2H),7.17(d,J＝7.5Hz,1H),6.97(s,1H),6.72(s,1H),6.62(s,1H),
6.06-5.96(m,1H),5.77(s,1H),5.69(brs,1H),5.19(dd,J＝17.2,1.6Hz,1H),5.09(dd,J＝+
10.0,1.6Hz,1H),3.69(d,J＝6.3Hz,2H).ESI-HRMS:([M+H] )calcd for C23H15Cl2O5:
441.0297,found:441.0288。
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10.0,1.6Hz,1H),3.69(d,J＝6.3Hz,2H).ESI-HRMS:([M+H] )calcd for C23H15Cl2O5:
441.0297,found:441.0288。
[0053] (9)化合物L1的制备：
[0054] 将中间体5(60.4mg,136μmol)及多聚甲醛(30.04mg,1.13mmol)溶于3mL乙腈中，回流反应0.5h。待反应液冷却至室温，将中间体9(50mg,113μmol)溶于1.5乙腈后，在N2保护下加入到上述反应液中，继续回流反应3.5h。然后将反应液冷却至室温，加入适量蒸馏水，CH2Cl2(40mL×3)萃取，合并有机层，无水MgSO4干燥，抽滤，浓缩，得产物粗品，过柱纯化，得橘红色固体，收率43.3％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.06(d,J＝7.2Hz,1H),7.92(s,1H),7.75-7.65(m,4H),7.39(dt,J＝8.7,1.8Hz,2H),7.21(d,J＝6.9Hz,1H),6.91(d,J＝3.6Hz,
1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.60(s,1H),6.06-5.93(m,1H),5.13(dd,J＝9,
1.5Hz,1H),5.07(brs,1H),4.25(s,2H),4.10(d,J＝3.9Hz,2H),3.67-3.63(m,4H),2.76(brs,6H),2.46(brs,1H),1.77-1.68(m,1H),1.59-1.51(m,1H),168.76,166.81,156.28,
155.10,153.26,151.62,150.83,148.84,148.67,148.11,135.33,135.22,134.48,134.18,
130.74,130.27,129.05,128.20,127.38,126.86,125.63,125.48,125.30,123.96,117.05,
115.91,115.69,115.24,112.35,110.08,108.68,107.84,57.42,54.41,52.52,48.72,
38.85,28.38,25.84.ESI-HRMS:([M+H]+)calcd for C46H41Cl3N5O8:896.2021,found:
896.2024。
1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.60(s,1H),6.06-5.93(m,1H),5.13(dd,J＝9,
1.5Hz,1H),5.07(brs,1H),4.25(s,2H),4.10(d,J＝3.9Hz,2H),3.67-3.63(m,4H),2.76(brs,6H),2.46(brs,1H),1.77-1.68(m,1H),1.59-1.51(m,1H),168.76,166.81,156.28,
155.10,153.26,151.62,150.83,148.84,148.67,148.11,135.33,135.22,134.48,134.18,
130.74,130.27,129.05,128.20,127.38,126.86,125.63,125.48,125.30,123.96,117.05,
115.91,115.69,115.24,112.35,110.08,108.68,107.84,57.42,54.41,52.52,48.72,
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896.2024。
[0055] 实施例2：萘二酰亚胺荧光团类探针的制备
[0056] 具体的合成路线如下：
[0057]
[0058] 本实施例的合成路线中，中间体1-5的制备同实施例1中的中间体1-5的制备方法。
[0059] (1)中间体7a的制备：
[0060] 向1,8-萘二酰亚胺(2.00g,10.14mmol)中加入无水K2CO3(5.59,40.56mmol)、1,3-二溴丙烷(6.14g,30.43mmol)及20mL乙腈，回流反应12h。抽滤，滤液浓缩，过柱，得白色固体，收率44.4％。M.p.:140.0-142.0℃.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.63(dd,J＝7.5,1.2Hz,2H),8.24(dd,J＝8.1,1.2Hz,2H),7.79(dd,J＝8.1,7.5Hz,2H),4.36(t,J＝7.2Hz,2H),
3.53(t,J＝6.9Hz,2H),2.39-2.29(m,2H).ESI-MS:([M+H]+):318.2。
3.53(t,J＝6.9Hz,2H),2.39-2.29(m,2H).ESI-MS:([M+H]+):318.2。
[0061] (2)中间体7b的制备：
[0062] 按中间体7a的制备方法，不同的是：以化合物6(2.00g,10.14mmol)和1,4-二溴丙烷(8.76g,30.43mmol)反应，得白色固体，收率55.1％。M.p.:116.0-119.0℃.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.62(dd,J＝7.2,1.2Hz,2H),8.24(dd,J＝8.4,0.9Hz,2H),7.79(t,J＝8.1Hz,2H),4.26(t,J＝6.9Hz,2H),3.50(t,J＝6.6Hz,2H),2.05-1.86(m,4H).ESI-MS:([M+H]+):332.3。
[0063] (3)中间体9的制备：
[0064] 将1,8-萘二甲酸酐(4.00g,20.18mmol)和2-氨基乙醇(1.23g,20.18mmol)溶于40mL乙醇中，回流反应5h。浓缩部分溶剂，4℃冷藏过夜，抽滤，滤饼用冷乙醇洗涤，得灰白色固体，收率95.7％。M.p.:177.0-180.0℃.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.63(dd,J＝7.5,1.2Hz,
2H),8.24(dd,J＝8.4,0.9Hz,2H),7.79(t,J＝8.1Hz,2H),4.49(t,J＝8.1Hz,2H),4.01(t,J＝5.4Hz,2H).ESI-MS:([M+H]+):242.4。
2H),8.24(dd,J＝8.4,0.9Hz,2H),7.79(t,J＝8.1Hz,2H),4.49(t,J＝8.1Hz,2H),4.01(t,J＝5.4Hz,2H).ESI-MS:([M+H]+):242.4。
[0065] (4)中间体10的制备：
[0066] 先将中间体9(1.00g,4.15mmol)溶于干燥的乙酸乙酯中，将0.8mL三溴化磷溶于5mL干燥乙酸乙酯中，然后在冰浴下滴加入中间体9(1.00g,4.15mmol)的乙酸乙酯溶液中。
滴加完毕后，转移至油浴，回流反应7h。待反应液冷却至室温，加入适量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水MgSO4干燥，抽滤，浓缩，得白色固体，收率81.7％。M.p.:226.0-
229.0℃1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.26(dd,J＝7.2,1.2Hz,2H),8.24(dd,J＝8.1,0.9Hz,
2H),7.79(t,J＝8.1Hz,2H),4.64(t,J＝7.2Hz,2H),3.70(t,J＝7.2Hz,2H).ESI-MS:([M+H]+):304.2。
滴加完毕后，转移至油浴，回流反应7h。待反应液冷却至室温，加入适量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水MgSO4干燥，抽滤，浓缩，得白色固体，收率81.7％。M.p.:226.0-
229.0℃1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.26(dd,J＝7.2,1.2Hz,2H),8.24(dd,J＝8.1,0.9Hz,
2H),7.79(t,J＝8.1Hz,2H),4.64(t,J＝7.2Hz,2H),3.70(t,J＝7.2Hz,2H).ESI-MS:([M+H]+):304.2。
[0067] (5)中间体13的制备：
[0068] 向4-氨基-1,8-萘二酰亚胺(0.90g,2.3mmol)中加入1mL冰乙酸、4mL吡啶，回流反应1h。然后加入8mL乙酸酐，继续回流反应3h。待反应液冷却后，倾入冰水中，抽滤，滤饼用水洗涤，棕色固体，收率67.2％。
[0069] (6)中间体14a的制备：
[0070] 按中间体9的制备方法，不同的是：以中间体13(1.00g,3.91mmol)和4-氨基-1-丁醇(0.42g,4.70mmol)反应，得棕色固体，收率50.78％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.63(dd,J＝7.2,0.9Hz,1H),8.59(d,J＝8.4Hz,1H),8.37(brs,1H),8.19(d,J＝8.1Hz,1H),7.83-7.75(m,2H),4.24(t,J＝7.2Hz,2H),3.76(t,J＝6.3Hz,2H),1.89-1.79(m,2H),1.74-1.57(m,2H).ESI-MS:([M+H]+):327.5。
[0071] (7)中间体14b的制备：
[0072] 按中间体9的制备方法，不同的是：以中间体13(1.00g,3.91mmol)和6-氨基-1-己醇(0.46g,4.70mmol)反应，得棕色固体，收率51.08％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.39(s,1H)，8.72(dd,J＝7.8,0.9Hz,1H),8.54(dd,J＝7.5,0.9Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.91(t,J＝8.4Hz,1H),4.32(t,J＝5.4Hz,1H),4.05(t,J＝7.2Hz,
2H),3.40-3.30(m,2H),2.28(s,3H),1.63-1.61(m,2H),1.44-1.33(m,6H).ESI-MS:([M+H]+):355.6。
2H),3.40-3.30(m,2H),2.28(s,3H),1.63-1.61(m,2H),1.44-1.33(m,6H).ESI-MS:([M+H]+):355.6。
[0073] (8)中间体15a的制备：
[0074] 按中间体10的制备方法，不同的是：以中间体14a(0.61g,1.87mmol)和PBr3(0.60mL)反应，得棕色固体，收率83.56％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.63(d,J＝7.2Hz,1H),8.60(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(brs,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.75(m,2H),4.24(t,J＝6.9Hz,2H),3.49(t,J＝6.3Hz,2H),2.38(s,3H),2.04-1.85(m,4H).ESI-MS:([M+H]+):
389.4。
389.4。
[0075] (9)中间体15b的制备：
[0076] 按中间体10的制备方法，不同的是：以中间体14b(0.65g,1.98mmol)和PBr3(0.65mL)反应，得棕色固体，收率90.24％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.64(dd,J＝7.5,0.9Hz,1H),8.61(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(brs,1H),8.20(d,J＝8.7Hz,1H),7.81-7.76(m,
2H),4.19(t,J＝7.5Hz,2H),3.42(t,J＝6.9Hz,2H),2.38(s,3H),1.93-1.83(m,2H),1.80-
1.70(m,2H),1.49-1.40(m,4H).ESI-MS:([M+H]+):417.5。
2H),4.19(t,J＝7.5Hz,2H),3.42(t,J＝6.9Hz,2H),2.38(s,3H),1.93-1.83(m,2H),1.80-
1.70(m,2H),1.49-1.40(m,4H).ESI-MS:([M+H]+):417.5。
[0077] (10)中间体17的制备：
[0078] 将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.00g,3.61mol)溶于15mL DMF中，再加入40％二甲胺水溶液，及CuSO4·5H2O(90mg,0.361mmol)，回流反应4h，浓缩，得产物粗品，乙醇重结晶，得黄色固体，收率59.8％。M.p.:195.0-199.0℃.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.58(d,J＝7.5Hz,1H),8.50-8.44(m,2H),7.70(t,J＝8.4Hz,1H),7.12(d,J＝8.4Hz,1H),3.18(s,6H)。
[0079] (11)中间体18a的制备：
[0080] 向中间体10(0.20g,0.66mmol),中加入单BOC保护的哌嗪(0.13g,0.79mmol)、4-甲基吗啉(0.2g,1.98mmol)及15mL乙腈，回流反应12h。待反应液冷却后，加入适量蒸馏水，用CH2Cl2萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得产物粗品，过柱纯化，得白色固体，即为中间体11a，收率74.1％。
[0081] 将中间体11a(0.2g,0.49mmol)溶于3mL CH2Cl2中，室温反应6h，加入适量蒸馏水，用CH2Cl2萃取，合并有机层，无水MgSO4，抽滤，浓缩，得白色固体，收率80.0％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.51-8.45(m,4H),7.90(t,J＝7.8Hz,2H),7.47(brs,1H),4.20(t,J＝6.9Hz,2H),2.93(brs,4H),2.61-2.60(m,6H).ESI-MS:([M+H]+):367.3。
[0082] (12)中间体18b的制备：
[0083] 按中间体11a的制备方法，不同的是：以中间体7a(0.50g,1.57mmol)、K2CO3(0.43g,3.14mmol)和单BOC保护的哌嗪(0.44g,2.36mmol)反应，得白色固体，即为中间体11b，收率
60.6％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60-8.57(m,2H),8.22-8.19(m,2H),7.78-7.72(m,2H),
4.28(t,J＝6.9Hz,2H),3.33(t,J＝4.8Hz,4H),2.53(t,J＝6.9Hz,2H),2.39(t,J＝4.8Hz,
4H),1.99-1.89(m,2H),1.43(s,9H).ESI-MS:([M+H]+):424.4。
60.6％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60-8.57(m,2H),8.22-8.19(m,2H),7.78-7.72(m,2H),
4.28(t,J＝6.9Hz,2H),3.33(t,J＝4.8Hz,4H),2.53(t,J＝6.9Hz,2H),2.39(t,J＝4.8Hz,
4H),1.99-1.89(m,2H),1.43(s,9H).ESI-MS:([M+H]+):424.4。
[0084] 将中间体11b(0.34g,0.80mmol)溶于3mL CH2Cl2中，再加入0.8mL三氟乙酸，在室温下搅拌6h，然后，用NaHCO3的饱和溶液调节pH至碱性，CH2Cl2(40mL×3)萃取，合并有机层，无水MgSO4干燥，抽滤，浓缩，得白色固体，收率80.0％。
[0085] (13)中间体18c的制备：
[0086] 按中间体11a的制备方法，不同的是：以中间体7b(0.50g,1.51mmol)、K2CO3(0.42g,3.01mmol)和单BOC保护的哌嗪(0.42g,2.26mmol)反应，得白色固体，即为中间体11c，收率
77.3％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60(d,J＝7.5Hz,2H),8.22(d,J＝7.5Hz,2H),7.78(m,
2H),4.23(t,J＝7.2Hz,2H),3.43(t,J＝4.8Hz,4H),2.43-2.36(m,6H),1.82-1.72(m,2H),
1.66-1.56(m,2H),1.45(s,9H).ESI-MS:([M+H]+):438.5。
77.3％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60(d,J＝7.5Hz,2H),8.22(d,J＝7.5Hz,2H),7.78(m,
2H),4.23(t,J＝7.2Hz,2H),3.43(t,J＝4.8Hz,4H),2.43-2.36(m,6H),1.82-1.72(m,2H),
1.66-1.56(m,2H),1.45(s,9H).ESI-MS:([M+H]+):438.5。
[0087] 按中间体18b的制备方法，不同的是：以中间体11c(0.20g,0.46mmol)和三氟乙酸(0.8mL)反应，得白色固体，收率73.3％。
[0088] (14)中间体18d的制备：
[0089] 将中间体13(0.30g,1.18mmol)及1-(氨乙基)-哌嗪(0.18g,1.41mmol)溶于15mL乙醇中，回流反应2h，浓缩，得产物粗品，过柱纯化，得棕色固体，收率40.20％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.64-8.59(m,2H),8.40(s,1H),8.21(d,J＝7.5Hz,1H),7.82-7.77(m,2H),4.35(t,J＝6.9Hz,2H),2.93(t,J＝4.8Hz,4H),2.73(t,J＝6.9Hz,2H),2.64(brs,4H),
2.38(s,3H).ESI-MS:([M+H]+):367.3。
2.38(s,3H).ESI-MS:([M+H]+):367.3。
[0090] (15)中间体18e的制备：
[0091] 按中间体18d的制备方法，不同的是：以中间体17(0.20g,0.83mmol)和1-(氨乙基)-哌嗪(0.14g,1.08mmol)反应，得白色固体，收率56.3％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.56(d,J＝7.2Hz,1H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.46(d,J＝7.8Hz,1H),7.69(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,1H)4.32(t,J＝6.3Hz,2H),3.11(s,6H),3.04(t,J＝4.5Hz,4H),2.77-
2.70(m,6H).ESI-MS:([M+H]+):353.6。
2.70(m,6H).ESI-MS:([M+H]+):353.6。
[0092] (16)化合物L2的制备：
[0093] 将中间体18a(80mg,0.26mmol)溶于10mL乙腈中，加入中间体3(0.14g,0.31mmol)及K2CO3(71.4mg,0.52mmol)，回流反应12h，抽滤，滤液浓缩，过柱，得白色固体，收率52.7％。.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60(dd,J＝7.2,0.9Hz,2H),8.23(d,J＝8.4Hz,2H),
7.91(s,1H),7.78(t,J＝7.8Hz,2H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(d,J＝8.7Hz,2H),6.91(d,J＝3.6Hz,1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),4.35(t,J＝6.9Hz,2H)4.26(s,2H),3.66-3.61(m,2H),2.88-2.58(m,10H),1.70(brs,4H).13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ166.79，164.15,
155.03,153.27,148.79,135.26,134.12,133.90,131.60,131,19,129.03,128.24,128.20,
126.93,125.62,122.70,115.52,107.82,57.83,55.62,53.18,53.08,48.83,38.99,37.50,
25.98,23.86.HRMS(ESI)m/z calcd.for C36H36ClN6O5([M+H]+)667.2436；found 667.2430。
7.91(s,1H),7.78(t,J＝7.8Hz,2H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(d,J＝8.7Hz,2H),6.91(d,J＝3.6Hz,1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),4.35(t,J＝6.9Hz,2H)4.26(s,2H),3.66-3.61(m,2H),2.88-2.58(m,10H),1.70(brs,4H).13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ166.79，164.15,
155.03,153.27,148.79,135.26,134.12,133.90,131.60,131,19,129.03,128.24,128.20,
126.93,125.62,122.70,115.52,107.82,57.83,55.62,53.18,53.08,48.83,38.99,37.50,
25.98,23.86.HRMS(ESI)m/z calcd.for C36H36ClN6O5([M+H]+)667.2436；found 667.2430。
[0094] (17)化合物L3的制备：
[0095] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体18b(80mg,0.25mmol)、中间体3(0.13g,0.30mmol)、K2CO3(68.4mg,0.49mmol)反应，得白色固体，收率47.6％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.60(d,J＝7.2Hz,2H),8.23(d,J＝7.5Hz,2H),7.93(s,1H),7.78(t,J＝7.8Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝3.6Hz,1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),4.27-4.23(m,4H),3.64(t,J＝6.9Hz,2H),2.55-2.29(m,10H),1.99-1.90(m,2H),1.72-1.62(m,2H),1.56-1.50(m,2H),1.33-1.24(m,2H).13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ
166.79，164.26,155.07,153.28,148.77,135.28,134.16,133.86,131.61,131.16,129.04,
128.25,128.20,126.93,125.63,122.80,115.56,107.82,57.78,56.03,53.00,52.81,+
48.82,38.99,38.91,25.96,24.99,23.79；HRMS(ESI)m/z calcd.for C37H38ClN6O5([M+H] )
681.2592；found 681.2593。
166.79，164.26,155.07,153.28,148.77,135.28,134.16,133.86,131.61,131.16,129.04,
128.25,128.20,126.93,125.63,122.80,115.56,107.82,57.78,56.03,53.00,52.81,+
48.82,38.99,38.91,25.96,24.99,23.79；HRMS(ESI)m/z calcd.for C37H38ClN6O5([M+H] )
681.2592；found 681.2593。
[0096] (18)化合物L4的制备：
[0097] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体18c(80mg,0.23mmol)、中间体31
(0.12g,0.28mmol)、K2CO3(65.5mg,0.47mmol)反应，得白色固体，收率60.7％。H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.61(dd,J＝7.5,0.9Hz,2H),8.23(d,J＝8.4,0.9Hz,2H),7.94(s,1H),
7.78(t,J＝8.1Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.39(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(d,J＝3.6Hz,
1H),6.75(d,J＝3.6Hz,1H),4.24-4.18(m,4H),3.66-3.62(m,2H),2.53-2.42(m,10H),
1.90-1.49(m,10H),.13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ166.80，164.21,155.07,153.28,148.78,
135.33,134.16,133.91,131.60,131.22,129.05,128.26,128.18,126.94,125.64,122.72,
115.55,107.82,57.17,57.79,52.92,48.86,40.13,39.00,26.13,25.98,23.89；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H40ClN6O5([M+H]+)695.2749；found 695.2749。
(0.12g,0.28mmol)、K2CO3(65.5mg,0.47mmol)反应，得白色固体，收率60.7％。H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.61(dd,J＝7.5,0.9Hz,2H),8.23(d,J＝8.4,0.9Hz,2H),7.94(s,1H),
7.78(t,J＝8.1Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.39(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(d,J＝3.6Hz,
1H),6.75(d,J＝3.6Hz,1H),4.24-4.18(m,4H),3.66-3.62(m,2H),2.53-2.42(m,10H),
1.90-1.49(m,10H),.13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ166.80，164.21,155.07,153.28,148.78,
135.33,134.16,133.91,131.60,131.22,129.05,128.26,128.18,126.94,125.64,122.72,
115.55,107.82,57.17,57.79,52.92,48.86,40.13,39.00,26.13,25.98,23.89；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H40ClN6O5([M+H]+)695.2749；found 695.2749。
[0098] (19)化合物L5的制备：
[0099] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体18d(80mg,0.22mmol)、中间体31
(0.14g,0.33mmol)、K2CO3(60.1mg,0.44mmol)反应，得白色固体，收率20.1％。H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.43(s,1H),8.74(d,J＝8.4Hz,1H),8.54(d,J＝7.2Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.92(t,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.77(m,3H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝3.6Hz,1H),6.99(d,J＝3.6Hz,1H),4.18(brs,2H),3.47(brs,
13
2H),2.51(brs,2H),2.28(s,4H),1.56(brs,4H). C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ169.57,
167.64，163.49,162.91,153.34,152.93,149.32,140.42,133.35,132.61,131.65,130.88,
129.39,129.10,128.31,126.34,125.56,124.02,122.18,119.40,117.36,115.64,109.01,
48.05,24.04；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H39ClN7O6([M+H]+)724.2650；found 724.2645。
(0.14g,0.33mmol)、K2CO3(60.1mg,0.44mmol)反应，得白色固体，收率20.1％。H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.43(s,1H),8.74(d,J＝8.4Hz,1H),8.54(d,J＝7.2Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.92(t,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.77(m,3H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝3.6Hz,1H),6.99(d,J＝3.6Hz,1H),4.18(brs,2H),3.47(brs,
13
2H),2.51(brs,2H),2.28(s,4H),1.56(brs,4H). C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ169.57,
167.64，163.49,162.91,153.34,152.93,149.32,140.42,133.35,132.61,131.65,130.88,
129.39,129.10,128.31,126.34,125.56,124.02,122.18,119.40,117.36,115.64,109.01,
48.05,24.04；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H39ClN7O6([M+H]+)724.2650；found 724.2645。
[0100] (20)化合物L6的制备：
[0101] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体15a(50mg,128.45μmol)、中间体5(51.84mg,116.78μmol)、K2CO3(29.97mg,233.56μmol)反应，得白色固体，收率6.94％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.41(s,1H),8.73(d,J＝8.4Hz,1H),8.54(d,J＝6.9Hz,1H),8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.91(t,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.78(m,3H),7.54(d,J＝8.7Hz,2H),7.19(d,J＝3.6Hz,1H),6.98(d,J＝3.6Hz,1H),4.39(s,2H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H),3.48(t,J＝6.6Hz,2H),2.38-2.28(m,9H),1.64-1.45(m,8H).13C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ169.55,167.62，163.48,162.92,153.33,152.94,149.34,140.33,133.30,
132.61,131.59,130.82,129.26,129.10,128.31,126.33,125.56,124.00,122.27,119.36,
117.45,115.62,109.01,57.11,56.92,52.21,52.10,48.02,38.05,25.32,24.04；HRMS(ESI)m/z calcd.for C40H43ClN7O6([M+H]+)752.2963；found 752.2950。
132.61,131.59,130.82,129.26,129.10,128.31,126.33,125.56,124.00,122.27,119.36,
117.45,115.62,109.01,57.11,56.92,52.21,52.10,48.02,38.05,25.32,24.04；HRMS(ESI)m/z calcd.for C40H43ClN7O6([M+H]+)752.2963；found 752.2950。
[0102] (21)化合物L7的制备：
[0103] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体15b(60mg,0.135mmol)、中间体5(67.68mg,0.16mmol)、K2CO3(37.32mg,0.27mmol)反应，得白色固体，收率11.7％。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.40(s,1H),8.73(d,J＝7.8Hz,1H),8.54(d,J＝6.6Hz,1H),8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.91(t,J＝7.5Hz,1H),7.81-7.78(m,3H),7.54(d,J＝8.7Hz,2H),7.19(d,J＝3.6Hz,1H),6.99(d,J＝3.6Hz,1H),4.39(s,2H),4.05(t,J＝13
6.9Hz,2H),3.48(t,J＝6.9Hz,2H),2.50-2.28(m,12H),1.63-1.33(m,12H). C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ169.55,167.62，163.45,162.89,153.34,152.95,149.34,140.33,133.32,
133.01,132.62,131.59,130.81,130.63,129.10,128.93,128.32,126.33,125.56,124.00,
122.25,119.35,117.43,115.62,109.01,48.02,38.05,27.37,26.29,25.30,24.04；HRMS+
(ESI)m/z calcd.for C42H47ClN7O6([M+H])780.3276；found780.3270。
6.9Hz,2H),3.48(t,J＝6.9Hz,2H),2.50-2.28(m,12H),1.63-1.33(m,12H). C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ169.55,167.62，163.45,162.89,153.34,152.95,149.34,140.33,133.32,
133.01,132.62,131.59,130.81,130.63,129.10,128.93,128.32,126.33,125.56,124.00,
122.25,119.35,117.43,115.62,109.01,48.02,38.05,27.37,26.29,25.30,24.04；HRMS+
(ESI)m/z calcd.for C42H47ClN7O6([M+H])780.3276；found780.3270。
[0104] (22)化合物L8的制备：
[0105] 按化合物L2的制备方法，不同的是：以中间体18e(60mg,0.17mmol)、中间体3(0.11g,0.25mmol)、K2CO3(47.0mg,0.34mmol)反应，得白色固体，收率26.7％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.57(dd,J＝7.5,0.9Hz,1H),8.48-8.42(m,2H),7.94(s,1H),7.69-7.60(m,3H),7.39(d,J＝8.7Hz,2H),7.13(d,J＝8.4Hz,1H),6.92(d,J＝3.6Hz,1H),6.74(d,J＝3.6Hz,1H),4.34(t,J＝6.9Hz,2H),4.26(s,2H),3.66(t,J＝6.6Hz,2H),3.10(s,6H),2.75-
2.50(m,12H),1.71-1.66(m,4H).13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ167.80,163.76,163.09,156.74,
153.51,153.14,149.54,133.46,132.79,132.45,131.70,130.73,129.78,129.28,128.51,
125.75,125.17,124.39,122.46,115.80,113.45,113.16,109.18,57.35,55.38,53.01,
52.93,48.20,44.54,38.32,36.98,25.60,23.50；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H41ClN7O5([M+H]+)710.2858；found 710.2850。
2.50(m,12H),1.71-1.66(m,4H).13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ167.80,163.76,163.09,156.74,
153.51,153.14,149.54,133.46,132.79,132.45,131.70,130.73,129.78,129.28,128.51,
125.75,125.17,124.39,122.46,115.80,113.45,113.16,109.18,57.35,55.38,53.01,
52.93,48.20,44.54,38.32,36.98,25.60,23.50；HRMS(ESI)m/z calcd.for C38H41ClN7O5([M+H]+)710.2858；found 710.2850。
[0106] 实施例3：生物活性的测定
[0107] 以阿齐利特(Azimilide)及阿司咪唑(Astemizole)为阳性药，采用放射性配体竞争性结合实验(参考文献:Identification of Human Ether-`a-go-go Related GeneModulators by Three Screening Platformsin an Academic Drug-Discovery Setting)，测定荧光探针分子与hERG钾离子通道的结合活性，结果如表1，合成的探针分子比识别基团Azimilde的活性都有所提高，探针分子与hERG钾离子通道有较高的活性。但在荧光性质方面有较大的差别，探针分子L2-4，由于萘二酰亚胺环上无取代基，荧光较弱同时激发波长及发射波长较短，因此在进一步的研究中，我们选择L1及L5进行进一步的筛选及成像研究。
[0108] 表1 探针分子的光学特征及与hERG钾离子通道的亲和力
[0109]
[0110] 注：IC50为化合物与hERG钾离子通道结合50％的浓度，Ki代表化合物与hERG钾离子通道的结合常数。
[0111] 实施例4：探针分子在hERG钾离子通道抑制剂活性筛选中的应用
[0112] 以探针分子L1和L5为研究对象，在探针分子的设计中，我们引入了光致电子转移(PET)的开关机制，探针分子在游离状态，荧光较弱，与hERG钾离子通道结合后，荧光增强。与最初设想一致，固定探针分子的浓度(L1:5μM，L5：10μM)，探针分子的荧光强度随蛋白浓度的增加而增强，显示了较强的PET效应，同时探针分子L5对hERG钾离子通道的检测灵敏度要高于L1,如图1a和图1b所示。因此，进一步评价了探针分子L5用于hERG钾离子通道抑制剂基于细胞的活性筛选
[0113] 选择阿司咪唑及盐酸索他洛尔作为阳性药，评价探针L5能否用于hERG离子通道抑制剂基于细胞的活性筛选，选择的细胞为hERG转染的HEK293细胞。具体操作步骤为:每孔种板3×104个细胞，培养18-24h,吸出培养基，用缓冲液洗两次，加入90μL的1μM的探针L5(用缓冲液配制，缓冲液成分：160mM NaCl,4.5mM KCl,2mM CaCl2，1mM MgCl210mM glucose,10mM HEPES，pH＝7.4)，孵育30min,再加入10μL系列不同浓度的阿司咪唑(缓冲液配制，成分与上述缓冲液一致)继续孵育30min,在350nm激发测定460nm处的荧光强度变化，结果如图2a和图2b所示。用Graphpad prism软件对数据进行非线性拟合，计算得到阿司咪唑的IC50为895.9nM(膜片钳报道的活性为10nM左右)，索他洛尔的IC50大于1mM(膜片钳报道的活性为
2μM左右)。结果显示，该种基于细胞的筛选方法，能用于不同活性区域的化合物测定，尤其对hERG钾离子通道有高亲和力的化合物。这种基于细胞的测定方法与文献报道的基于膜片钳的结果有差距，虽然两种都是基于细胞的测定方法，但后者采用的竞争性结合来测定活性，这也是测定活性整体偏低的原因。
2μM左右)。结果显示，该种基于细胞的筛选方法，能用于不同活性区域的化合物测定，尤其对hERG钾离子通道有高亲和力的化合物。这种基于细胞的测定方法与文献报道的基于膜片钳的结果有差距，虽然两种都是基于细胞的测定方法，但后者采用的竞争性结合来测定活性，这也是测定活性整体偏低的原因。
[0114] 实施例5：探针分子在hERG钾离子通道细胞成像中的应用
[0115] 以探针分子L1为研究对象，考察期在细胞成像中的应用，选择hERG转染的HEK293细胞为阳性细胞，未转染任何基因的HEK293细胞为阴性细胞。具体步骤为：hERG转染的HEK293细胞用含10％胎牛血清和400μg/mL G418的高糖DMEM培养基，在5％CO2空气及37℃的环境中进行培养，阴性细胞即未染任何基因的HEK293细胞在相同的条件下培养，只是不加G418。成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，然后培养12-24h,然后将培养基吸掉，用不含血清的培养基洗涤两次，用探针(用不含血清的培养基进行配置，浓度为5μM)孵育20min，用Zeiss Axio Observer A1成像。
[0116] 结果如图3所示，由图3可以看出，探针分子L1能够选择性的标记hERG钾离子通道，该探针在hERG钾离子通道病理、生理及相关疾病诊断中有着广阔的应用前景。