汗腺细胞诱导培养基及其应用

摘要

本发明公开了一种汗腺细胞诱导培养基及其应用，所述汗腺细胞诱导培养基包括DMEM/F12细胞培养基、角质化细胞培养基、胎牛血清、表皮生长因子、三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠、L‑谷氨酰胺、青霉素、链霉素、肝细胞生长因子以及骨形态发生蛋白4。采用本发明的汗腺细胞诱导培养基可以成功诱导干细胞定向分化为汗腺样细胞，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺细胞，大大改善病人的生活质量。也为研究汗腺的分化发育提供的理论依据，具有潜在的临床应用前景。

权利要求

1.一种汗腺细胞诱导培养基，其特征在于：所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为（0.8～1）∶1的DMEM/F12细胞培养基和角质化细胞培养基；还包括以下成分，各成分的用量为：胎牛血清                        3～6%表皮生长因子                    40～55μg/L三碘甲状腺原氨酸                0.5～1.5mmol/L氢化可的松                      0.1～0.3mg/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠       0.5～2%L-谷氨酰胺                      0.5～2mmol/L青霉素                          0.02～0.08U/L链霉素                          0.02～0.09μg/L肝细胞生长因子                  20～30μg/L骨形态发生蛋白4                 8～12μg/L。

2.根据权利要求1所述汗腺细胞诱导培养基，其特征在于：所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为0.9∶1的DMEM/F12细胞培养基和角质化细胞培养基；还包括以下成分，各成分的用量为：胎牛血清                       5%表皮生长因子                   50μg/L三碘甲状腺原氨酸               1mmol/L氢化可的松                     0.2mg/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠       1%L-谷氨酰胺                     1mmol/L青霉素                         0.05U/L链霉素                         0.05μg/L肝细胞生长因子                 25μg/L骨形态发生蛋白4                10μg/L。

3.根据权利要求1或者2所述汗腺细胞诱导培养基，其特征在于：所述角质化细胞培养基为KGM2细胞培养基。

4.权利要求1或者2所述汗腺细胞诱导培养基在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述干细胞为羊水干细胞或者多潜能干细胞。

说明书

汗腺细胞诱导培养基及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种汗腺细胞诱导培养基及其在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用，属于汗腺细胞培养技术领域。

背景技术

[0002] 我国烧伤年发病率约为1.5%～2%，即每年约有千万人遭受不同程度烧伤，近万人严重烧伤，其中约10%病人由于缺乏皮源无法挽救其性命。大面积烧伤获救病人由于无功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能，严重影响病人生活质量。大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。

[0003] 皮肤是人体最大的器官，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。其中汗腺作为重要的功能性皮肤附属器，在调节体温，分泌汗液及排出人体部分代谢产物的过程中发挥着重要的作用。人体中汗腺分为两种，顶泌汗腺和外泌汗腺。顶泌汗腺较大，有较大的官腔，与体温调节无关。外泌汗腺较小，分布于人体全身，参与体温调节。

[0004] 外泌汗腺分为导管部和分泌部。分泌部位于真皮层或皮下组织内，是卷曲的小管，而导管部开口于表皮层，连接分泌部和外界环境。

[0005] 轻度烧伤，汗腺的导管细胞可以其深部未受创部分为模版，通过干细胞的分化形成它特有的三维结构而完全修复。但是，全层皮肤大面积深度烧伤，汗腺则不能依赖干细胞的分裂增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。

[0006] 人体内存在的汗腺数量是一定的，由于其发育是一个复杂的过程，一旦大面积受损，将无法快速有效的恢复有功能性的汗腺。故创面虽经覆盖，但无排汗功能，严重影响病人生活质量。

[0007] 皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。目前，汗腺组织的发育机制还不明确，无法实现临床大量移植。研究表明，干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织；然而对于真皮层组织中的功能性皮肤附属器，目前干细胞汗腺细胞定向分化尚未见报道。

[0008] 利用胶原酶消化皮肤，待汗腺个体游离出来在倒置显微镜下吸取分离出至培养皿中培养可以形成汗腺细胞。但目前对此研究存在一些问题，如汗腺分离纯化困难且在体外培养传代有限，限制其应用；同时，体外培养汗腺所用的培养基目前还没有确定，对于汗腺细胞体外培养效果均不理想。

[0009] 现有研究发现，与汗腺细胞共培养的干细胞可分化为汗腺细胞。将汗腺细胞进行热休克处理，收集热休克后汗腺细胞的培养上清，与间充质干细胞共培养，发现间充质干细胞可以分化成具有汗腺表型的细胞。但是这一方法也存在问题，由于汗腺细胞分离纯化和传代培养效率低，获取大量培养上清存在困难；而且培养上清成分不清楚，其具体作用机制也不明；特别是能否获得具有功能性的汗腺细胞还不确定。

[0010] 因此研发新的诱导分化培养基，建立新型高效的干细胞汗腺细胞定向分化方法十分必要。

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种可以将干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的诱导分化培养基；并公开了利用其将干细胞诱导分化为汗腺样细胞的方法，从而解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。

[0012] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种汗腺细胞诱导培养基，所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为（0.8～1）∶1的DMEM/F12细胞培养基和角质化细胞培养基；还包括以下成分，各成分的用量为：

[0013] 胎牛血清                    3～6%

[0014] 表皮生长因子                40～55μg/L

[0015] 三碘甲状腺原氨酸            0.5～1.5mmol/L

[0016] 氢化可的松                  0.1～0.3mg/L

[0017] 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠    0.5～2%

[0018] L-谷氨酰胺                  0.5～2mmol/L

[0019] 青霉素                     0.02～0.08U/L

[0020] 链霉素                     0.02～0.09μg/L

[0021] 肝细胞生长因子              20～30μg/L

[0022] 骨形态发生蛋白4             8～12μg/L。

[0023] 优选的，所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为0.9∶1的DMEM/F12细胞培养基和角质化细胞培养基；还包括以下成分，各成分的用量为：

[0024] 胎牛血清                   5%

[0025] 表皮生长因子               50μg/L

[0026] 三碘甲状腺原氨酸           1mmol/L

[0027] 氢化可的松                 0.2mg/L

[0028] 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠   1%

[0029] L-谷氨酰胺                 1mmol/L

[0030] 青霉素                     0.05U/L

[0031] 链霉素                     0.05μg/L

[0032] 肝细胞生长因子             25μg/L

[0033] 骨形态发生蛋白4            10μg/L。

[0034] 上述技术方案中，所述角质化细胞培养基为KGM2细胞培养基。

[0035] 本发明还公开了上述汗腺细胞诱导培养基在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用。

[0036] 上述技术方案中，所述干细胞为羊水干细胞或者多潜能干细胞。

[0037] 利用上述汗腺细胞诱导培养基诱导干细胞分化为汗腺样细胞的方法，包括取干细胞铺于培养皿中，贴壁培养；待所述干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基，开始诱导干细胞；然后每天更换汗腺细胞诱导培养基；待诱导后的干细胞生长至汇合率为70 80%，进行~消化传代，按1传3的比例接种至新的培养皿中，添加汗腺定向诱导分化培养基；诱导分化一段时间后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测。干细胞的数量与培养器具有关，如果太多细胞的生长会太快导致消化传代的次数会增多，比如取1×105干细胞种在6孔板里，密度比较合适。

[0038] 本发明中，羊水干细胞（Amniotic Fluid Stem Cell, AFS）具有良好的增殖效率以及低免疫源性，是一种新型的干细胞。

[0039] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

[0040] 1．本发明公开了一种新的汗腺诱导培养基，能有效的诱导干细胞分化为汗腺样细胞；运用本发明的汗腺诱导培养基可很好地将干细胞在体外诱导分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞，并且该汗腺样细胞在胶中可形成类似于汗腺结构的管状结构。

[0041] 2．本发明以DMEM/F12细胞培养基和角质化细胞培养基为基础培养基配置新的汗腺诱导培养基，用于诱导干细胞转化为汗腺细胞时的培养设备简单，操作步骤简便、快速，成本低，适用于大量干细胞的诱导分化，易于推广普及。

附图说明

[0042] 图1为实施例一中人羊水干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的形态图；

[0043] 图2为实施例一中mRNA水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图；

[0044] 图3为实施例一中诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图；

[0045] 图4为实施例一中人羊水干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的透射电镜图；

[0046] 图5为实施例一中人汗腺组织、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的汗腺样导管结构图；

[0047] 图6 为实施例一中人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程图；

[0048] 图7为实施例二中多潜能干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的形态图；

[0049] 图8为实施例二中mRNA水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图；

[0050] 图9为实施例二中诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图；

[0051] 图10为实施例二中多潜能干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的透射电镜图；

[0052] 图11为实施例二中人汗腺组织、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的汗腺样导管结构图；

[0053] 图12 为实施例二中多潜能干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程图。

具体实施方式

[0054] 下面结合实施例与附图对本发明作进一步描述:

[0055] 实施例一：诱导人羊水干细胞分化为汗腺样细胞

[0056] 汗腺细胞诱导培养基，包括450mL DMEM/F12细胞培养基（Hyclone，SH30023.01B），500mL角质化细胞培养基（KGM2）（Lonza，CC-3107），额外添加50mL特级胎牛血清、1mmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.2mg/L氢化可的松、1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.05U/L青霉素和0.05μg/L链霉素；再加入50μg/L表皮生长因子（EGF），25μg/L肝细胞生长因子（HGF）以及10μg/L骨形态发生蛋白4（BMP4）。

[0057] 诱导羊水干细胞分化为汗腺样细胞，包括以下步骤：

[0058] （1）取5×104个/孔的人羊水干细胞铺于6孔板中，使用羊水干细胞培养基培养；

[0059] 羊水干细胞培养基：α-MEM培养基中添加 15%胎牛血清（FBS），1 mM L-谷氨酰胺和0.05U/L青霉素，0.05μg/L链霉素，18%Chang B 和2%Chang C 培养基；

[0060] （2）20h后，待羊水干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；

[0061] （3）待诱导后的羊水干细胞生长至汇合率为80%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，使用1mL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按1传3的比例接种细胞至新的培养皿中；

[0062] （4）重复步骤（3），诱导分化28天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测。

[0063] 附图1为体外培养的人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出人羊水干细胞，细胞较小，呈梭型，排列无规则；由人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，排列规则；人汗腺细胞，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。人羊水干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。

[0064] 附图2为mRNA水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图。Realtime-PCR 结果显示，人羊水干细胞在诱导的过程中，逐渐表达汗腺细胞指标EDA、EDAR、K8 和CEA，且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。人羊水干细胞（hAFS）作为阴性对照，人汗腺细胞（hSG）作为阳性对照。

[0065] 附图3为诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图。经过28天的诱导，用流式细胞仪技术检测诱导后的细胞在汗腺细胞指标上的表达。经过分析，人羊水干细胞诱导后的汗腺样细胞表达EDA大约36%，EDAR大约43%， K8大约45%，CEA大约32%。人羊水干细胞可以很好的被诱导分化为汗腺养细胞。

[0066] 附图4为透射电镜在细胞器水平上检测人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺指标图。人羊水干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在细胞器水平上接近人汗腺细胞，具体表现在诱导后的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛（黑色箭头），而人羊水干细胞则没有微绒毛。

[0067] 附图5为人汗腺组织，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺样导管结构图，图中可见汗腺管状结构的横截面，能观察到汗腺管腔；人羊水干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺管状结构，可见管状结构横截面以及管腔；人汗腺细胞在胶中形成的管状结构，可见管状结构横截面以及管腔。

[0068] 附图6 为人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。

[0069] 实施例二：诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞

[0070] 汗腺细胞诱导培养基，包括450mLDMEM/F12细胞培养基、450mL角质化细胞培养基（KGM2），额外添加55mL特级胎牛血清、1.5mmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.3mg/L氢化可的松、2%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1.5mmol/L L-谷氨酰胺、0.08U/L青霉素和0.09μg/L链霉素；再加入55μg/L表皮生长因子（EGF），30μg/L肝细胞生长因子（HGF）以及8μg/L骨形态发生蛋白4（BMP4）。

[0071] 诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞，包括以下步骤：

[0072] （1）取1×105个/孔的多潜能干细胞铺于6孔板中，使用多潜能干细胞培养基培养；

[0073] 多潜能干细胞培养基：含20%KnockOut血清、1%非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-2-巯基乙醇、4μg/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.1ug/L链霉素的 DMED F12 细胞培养基。

[0074] （2）24h后，待多潜能干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；

[0075] （3）待诱导后的多潜能干细胞生长至汇合率为70%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，使用0.8mL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按1传4的比例接种细胞至新的培养皿中；

[0076] （4）重复步骤（3），诱导分化21天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测，利用汗腺细胞诱导培养基可以成功将多潜能干细胞诱导为汗腺样细胞。

[0077] 附图7为体外培养的多潜能干细胞，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出多潜能干细胞，细胞较小，呈克隆样生长，细胞核质比较高；由多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，核质比变小；人汗腺细胞，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。多潜能干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。

[0078] 附图8为mRNA水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图。Realtime-PCR 结果显示，多潜能干细胞在诱导的过程中，逐渐表达汗腺细胞指标EDA、EDAR、K8 和CEA，且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。多潜能干细胞（SG-iPS）作为阴性对照，人汗腺细胞（SG）作为阳性对照。

[0079] 附图9为诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图。经过21天的诱导，用流式细胞仪技术检测诱导后的细胞在汗腺细胞指标上的表达。经过分析，多潜能干细胞诱导后的汗腺样细胞表达EDA大约63%，EDAR大约65%， K8大约76%，CEA大约56%。多潜能干细胞可以被高产率的诱导分化为汗腺养细胞。

[0080] 附图10为透射电镜在细胞器水平上检测多潜能干细胞，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺指标图。多潜能干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在细胞器水平上接近人汗腺细胞，具体表现在诱导后的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛（黑色箭头），而多潜能干细胞则没有微绒毛。

[0081] 附图11为人汗腺组织，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺样导管结构图，图中可见汗腺管状结构的横截面，能观察到汗腺管腔；多潜能干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺管状结构，可见管状结构横截面以及管腔；人汗腺细胞在胶中形成的管状结构，可见管状结构横截面以及管腔。

[0082] 附图12 为多潜能干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。

[0083] 综上所述，可以使用本发明的汗腺细胞诱导培养基成功诱导干细胞定向分化为汗腺样细胞，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺细胞，大大改善病人的生活质量。也为研究汗腺的分化发育提供的理论依据，具有潜在的临床应用前景。