本发明公开一种转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组和方法。本发明将多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR结合起来，对引物的设计进行了严格的控制，并对检测流程进行了改进，建立了一套多重巢式荧光定量PCR检测体系，该体系能够定量检测转基因大豆GTS40-3-2品系，以及常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、CaMV35S启动子和大豆内源基因Lectin，该方法灵敏度相比普通荧光定量PCR提高了1个数量级。本发明的方法具有模板需要量少，灵敏度高，通量高，特异性强等优点；能应用于转基因的快速定量检测，为快速、准确、高通量、定量检测转基因提供新方法。
1.转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组，其特征在于：包括大豆内源基因lectin外引物、大豆内源基因lectin内引物、品系特异性RRS外引物、品系特异性RRS内引物、CaMV35S启动子外引物、CaMV35S启动子内引物、NOS终止子外引物、NOS终止子内引物、CP4-EPSPS外引物和CP4-EPSPS内引物，其核苷酸序列分别如下所示：lectin外引物的上游引物：AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA；
lectin外引物的下游引物：ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC；
lectin内引物的上游引物：TGCCTCCACCAGCCTCTT；
lectin内引物的下游引物：AGTCTTCAAATCGACCACATCG；
RRS外引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA；
RRS外引物的下游引物：TGCGTGGTGAACTTTCTGTTGG；
RRS内引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA；
RRS内引物的下游引物：AGTTCTTCTCCGATCCCAAATAG；
CaMV35S启动子外引物的上游引物：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT；
CaMV35S启动子外引物的下游引物：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT；
CaMV35S启动子内引物的上游引物：TCTCCACTGACGTAAGGGATGA；
CaMV35S启动子内引物的下游引物：GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG；
NOS终止子外引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA；
NOS终止子外引物的下游引物：AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC；
NOS终止子内引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA；
NOS终止子内引物的下游引物：CCCATCTCATAAATAACGTCATGC；
CP4-EPSPS外引物的上游引物：GTTGCGGCCCTGCTTGT；
CP4-EPSPS外引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC；
CP4-EPSPS内引物的上游引物：CCGACATCGAAGTCATCAACC；
CP4-EPSPS内引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC。
2.转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：(1)引物液：含有引物液1、引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6，含有权利要求1的检测引物组；其中，引物液1为各个基因外引物的混合液，各个基因外引物的终浓度均为5～20μmol/L；引物液2是lectin内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液3是RRS内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液4是CaMV35S启动子内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液5是NOS终止子内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液6是CP4-EPSPS内引物，浓度均为5～20μmol/L；
(2)反应液：有两种反应液：A溶液和B溶液；分别用于第一轮多重PCR扩增和第二轮荧光定量PCR扩增；其中，A溶液用于第一轮多重PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4，三者的体积比是(7～9):(4～6):(1～3)；B溶液用于第二轮荧光定量PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4、20×SYBR Green I，四者的体积比为(7～9):(4～6):(1～3):(0.4～2)；
(4)对照：阳性对照为转基因大豆GTS 40-3-2的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物液1中各个基因的外引物浓度均为10μmol/L。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物液2、引物液3、引物液4、引物液5或引物液6的浓度均为20μmol/L。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为5U/μL。
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液A中，10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4，三者的体积比是8:5:2。
7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液B中，10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4、20×SYBR Green I，四者的体积比为8:5:2.5:1。
8.利用权利要求2～7任一项所述的试剂盒检测转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的方法，包括以下步骤：(1)待检样品DNA的提取：采用试剂盒法提取样品DNA；
(2)第一轮多重PCR：反应体系中含有A溶液25μL、DNA聚合酶0.25μL、引物液1为0.5μL，待检样品DNA 50～100ng，用ddH2O补足至50μL；第一轮多重PCR反应结束后，用ddH2O稀释PCR产物100倍；
(3)第二轮荧光定量PCR：反应体系中含有B溶液12.5μL，DNA聚合酶0.2μL，引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6分派到不同的PCR反应孔中，每种引物液1μL，重复3孔，第一轮PCR产物的100倍稀释的稀释物1μL作为模板，用ddH2O将体积调整为25μL；
(4)结果判断：第二轮荧光定量PCR的不同的基因，根据Ct值进行判断。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：第一轮多重PCR的反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15～20个循环；72℃5min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：第二轮荧光定量PCR反应条件：95℃30s；
95℃5s，59℃10s，72℃10s，35～40个循环。
转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR
检测引物组和方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种多重巢式荧光定量PCR检测试剂盒及应用，特别涉及一种转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
[0002] 随着转基因作物的大量种植及应用，转基因产品开始大量进入我们的生活。在还不能确定转基因作物及其产品对人类健康和生态环境是否存在潜在的不利影响之前，对其检测以及标识对消费者非常重要。我国的转基因食品技术起步较晚，于2002年3月20日起施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物所涉及的17种转基因产品进行标识，其中也包括了转基因棉花、转基因油菜籽、转基因玉米三种农作物。从目前发展情况来看，转基因检测未来必然向高通量、高灵敏度、定量、能够检测品系的方向发展。因此建立一套能够达到以上要求的方便、快捷转基因检测新技术是贯彻标识制度的重要前提。
[0003] 近年来国内外用于转基因检测的主要方法是PCR、多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等。以上基于PCR的方法都具有各自的优缺点，如多重PCR虽然提高了检测的通量，但体系内含多对引物，反应不稳定；荧光定量PCR具有定量能力，但由于探针的原因导致其检测通量偏低。因此，建立一套快速、准确、高通量、定量检测转基因的方法具有重要的意义。
发明内容
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测试剂盒；
[0006] 本发明的再一个目的在于提供一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测方法。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组，包括大豆内源基因lectin外引物、大豆内源基因lectin内引物、品系特异性RRS外引物、品系特异性RRS内引物、CaMV35S启动子外引物、CaMV35S启动子内引物、NOS终止子外引物、NOS终止子内引物、CP4-EPSPS外引物和CP4-EPSPS内引物，其核苷酸序列分别如下所示：
[0009] lectin外引物的上游引物：AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA(SEQ ID No：1)；
[0010] lectin外引物的下游引物：ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC(SEQ ID No：2)；
[0011] lectin内引物的上游引物：TGCCTCCACCAGCCTCTT(SEQ ID No：3)；
[0012] lectin内引物的下游引物：AGTCTTCAAATCGACCACATCG(SEQ ID No：4)；
[0013] RRS外引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA(SEQ ID No：5)；
[0014] RRS外引物的下游引物：TGCGTGGTGAACTTTCTGTTGG(SEQ ID No：6)；
[0015] RRS内引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA(SEQ ID No：7)；
[0016] RRS内引物的下游引物：AGTTCTTCTCCGATCCCAAATAG(SEQ ID No：8)；
[0017] CaMV35S启动子外引物的上游引物：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT(SEQ ID No：9)；
[0018] CaMV35S启动子外引物的下游引物：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT(SEQ ID No：10)；
[0019] CaMV35S启动子内引物的上游引物：TCTCCACTGACGTAAGGGATGA(SEQ ID No：11)；
[0020] CaMV35S启动子内引物的下游引物：GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG(SEQ ID No：12)；
[0021] NOS终止子外引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA(SEQ ID No：13)；
[0022] NOS终止子外引物的下游引物：AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC(SEQ ID No：14)；
[0023] NOS终止子内引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA(SEQ ID No：15)；
[0024] NOS终止子内引物的下游引物：CCCATCTCATAAATAACGTCATGC(SEQ ID No：16)；
[0025] CP4-EPSPS外引物的上游引物：GTTGCGGCCCTGCTTGT(SEQ ID No：17)；
[0026] CP4-EPSPS外引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC(SEQ ID No：18)；
[0027] CP4-EPSPS内引物的上游引物：CCGACATCGAAGTCATCAACC(SEQ ID No：19)；
[0028] CP4-EPSPS内引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC(SEQ ID No：20)；
[0029] 转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下成分：
[0030] (1)引物液：含有引物液1、引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6，含有上述的检测引物组；其中，引物液1为各个基因外引物(上下游)的混合液，各个基因外引物(上下游)的终浓度均为5～20μmol/L；引物液2是lectin内引物(上下游)，浓度均为5～20μmol/L；引物液3是RRS内引物(上下游)，浓度均为5～20μmol/L；引物液4是CaMV35S启动子内引物(上下游)，浓度均为5～20μmol/L；引物液5是NOS终止子内引物(上下游)，浓度均为5～20μmol/L；引物液6是CP4-EPSPS内引物(上下游)，浓度均为5～20μmol/L；
[0031] (2)反应液：有两种反应液：A溶液和B溶液，分别用于第一轮多重PCR扩增和第二轮荧光定量PCR扩增；其中，A溶液用于第一轮多重PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4，三者的体积比是(7～9):(4～6):(1～3)；B溶液用于第二轮荧光定量PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4、20×SYBR Green I，四者的体积比为(7～9):(4～6):(1～3):(0.4～2)；
[0032] (3)DNA聚合酶：浓度为4～6U/μL；
[0033] (4)对照：阳性对照为转基因大豆GTS40-3-2的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0034] 优选的，所述的引物液1中各个基因的外引物浓度均为10μmol/L；
[0035] 优选的，所述的引物液2、引物液3、引物液4、引物液5或引物液6的浓度均为20μmol/L。
[0036] 优选的，所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为5U/μL。
[0037] 优选的，所述的反应液A中，10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4，三者的体积比是8:5:2；
[0038] 优选的，所述的反应液B中，10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO4、20×SYBR Green I，四者的体积比为8:5:2.5:1。
[0039] 转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
[0040] (1)待检样品DNA的提取：采用试剂盒法提取样品DNA，试剂盒可选用Promega(A1120)等DNA提取试剂盒。
[0041] (2)第一轮多重PCR：反应体系中含有A溶液25μL、DNA聚合酶0.25μL、引物液10.5μL，待检样品DNA 50～100ng，用ddH2O补足至50μL；第一轮多重PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，15～20个循环；72℃ 5min。第一轮多重PCR反应结束后，用ddH2O稀释PCR产物100倍；
[0042] (3)第二轮荧光定量PCR：反应体系中含有B溶液12.5μL，DNA聚合酶0.2μL，引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6分派到不同的PCR反应孔中，每种引物液1μL，重复3孔，第一轮PCR产物的100倍稀释的稀释物1μL作为模板，用ddH2O将体积调整为25μL；第二轮荧光定量PCR反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，59℃ 10s，72℃ 10s，35～40个循环；
[0043] (4)结果判断：第二轮荧光定量PCR不同孔(根据加入的引物液)对应不同的基因，根据不同孔循环阈值(Ct值)进行判断；内源基因lectin的Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常，否则检测无效。在确定lectin基因Ct值＜35时，当外源基因无扩增曲线产生或Ct值＞40时，待测样品的判定结果为阴性；当外源基因Ct值＜35时，待测样品的判定结果为阳性；当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测样品重新进行检测，重新进行检测所得的外源基因Ct值≥40时，待测样品的判定结果为阴性，重新进行检测所得的外源基因Ct值≤35时，待测样品的判定结果为阳性。
[0044] 优选的，所述的第一轮多重PCR的循环数为15。
[0045] 优选的，所述的第二轮荧光定量PCR的循环数为40。
[0046] 本发明将多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR结合起来，改进了普通巢式PCR的方法，组建了多重巢式荧光定量PCR技术，开发一种同时能够定量检测转基因大豆GTS40-3-2品系，以及常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、CaMV35S启动子和大豆内源基因Lectin的试剂盒。
[0047] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0048] (1)本发明成功将多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR整合到一起，吸收各技术的优点，改进其检测流程，开发了同时检测转基因大豆GTS40-3-2品系，以及常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、CaMV35S启动子和大豆内源基因Lectin的试剂盒。
[0049] (2)模板需要量少。如果利用普通荧光定量PCR对某一样品中多个基因进行定性定量分析时，即如果检测5个基因则需要在15管中都加入模板(以每个基因三个重复计算)，以每管50ng模板来计算则需要750ng模板。而该方法则只需要在第一轮多重PCR时加入50ng模板即可，因为第二轮荧光定量PCR是利用第一轮多重PCR产物稀释物作为模板。这样对于一些痕量的样品具有较大的优势。
[0050] (3)灵敏度高。多重巢式荧光定量PCR灵敏度高于普通荧光定量PCR，相比普通荧光定量PCR提高了1个数量级，这对于一些深加工食品的转基因检测具有巨大的优势。
[0051] (4)通量高。本研究建立的方法通过一次实验同时对5个基因进行定性定量检测。
[0052] (5)特异性强。在本方法中，任何一个基因均需要内外2对引物全部配对才能够扩增，特异性高于普通PCR。
附图说明
[0053] 图1是多重巢式荧光定量PCR检测转基因大豆GTS40-3-2品系，以及常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、CaMV35S启动子和大豆内源基因Lectin的扩增曲线图。
[0054] 图2是多重巢式荧光定量PCR检测转基因大豆GTS40-3-2品系，以及常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、CaMV35S启动子和大豆内源基因Lectin的熔融曲线图。
[0055] 图3是多重巢式荧光定量PCR灵敏度测试，检测转基因含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％的样品的NOS终止子基因的扩增曲线图。
[0056] 图4是SN/T 1204-2003普通荧光定量PCR灵敏度测试，检测转基因含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％的样品的NOS终止子基因的扩增曲线图。
具体实施方式
[0057] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0058] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0059] 实施例1
[0060] (1)DNA的提取
[0061] 采用试剂盒法(Wizard Genomic DNA purification kit，A1120，Promega)提取转基因大豆GTS40-3-2样品(购自汕头出入境检验检疫局)的DNA。
[0062] (2)多重巢式荧光定量PCR
[0063] 第一轮多重PCR。反应体系中含有A溶液25μL，DNA聚合酶0.25μL，引物液10.5μL，待检样品DNA 50ng，用ddH2O补足至50μL。第一轮多重PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，15个循环；72℃ 5min；具体循环数可以根据实际情况在范围内调整。第一轮多重PCR反应结束后，用ddH2O稀释PCR产物100倍；
[0064] 第二轮荧光定量PCR。反应体系中含有B溶液12.5μL，DNA聚合酶0.2μL，引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6分派到不同的PCR反应孔中，每种引物液1μL，重复3孔，第一轮PCR产物的100倍稀释的稀释物1μL作为模板，用ddH2O将体积调整为25μL。第二轮荧光定量PCR反应条件：95℃30s；95℃ 5s，59℃ 10s，72℃ 10s，40个循环；熔融曲线分析：65℃～95℃，每0.5℃分析一次。扩增曲线见图1；熔融曲线见图2。
[0065] (3)结果表明：5个基因均有扩增，Ct值均小于35，无非特异性扩增。Lectin扩增表明该样品为大豆，RRS品系特异性引物扩增表明该转基因大豆为GTS40-3-2，并且该转基因大豆内含有CP4-EPSPS、NOS终止子、CaMV35S启动子这3个基因。
[0066] 实施例2
[0067] 用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的转基因大豆GTS40-3-2、A2704-12(购自汕头出入境检验检疫局)，转基因玉米Bt11、T25(购自汕头出入境检验检疫局)，转基因油菜RT73(购自汕头出入境检验检疫局)，非转基因大豆(合丰25，购自东北农业大学大豆研究所)进行鉴定。
[0068] 结果见表1，表明：非转基因大豆仅有大豆内源基因lectin为阳性；转基因大豆GTS40-3-2的5个基因均为阳性；转基因大豆A2704-12有大豆内源基因lectin、CaMV35S启动子这2个基因为阳性；转基因玉米T25有CaMV35S启动子这1个基因为阳性；转基因Bt11有NOS终止子、CaMV35S启动子这2个基因为阳性；转基因油菜RT73有CP4-EPSPS这1个基因为阳性。证明该方法特异性高。
[0069] 表1 多重巢式荧光定量PCR检测转基因样品
[0070]转基因样品 lectin RRS CaMV35S启动子 NOS终止子 CP4-EPSPS
转基因大豆GTS40-3-2 + + + + +
非转基因大豆 + － － － －
转基因大豆A2704-12 + － + － －
转基因玉米T25 － － + － －
转基因玉米Bt11 － － + + －
转基因油菜RT73 － － － － +
[0071] 实施例3
[0072] 运用转基因大豆GTS40-3-2和非转基因大豆(合丰25，购自东北农业大学大豆研究所)按照质量比例配制转基因含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％的样品，用实施例1的鉴定方法对NOS终止子基因进行分析。同时参照SN/T1204-2003中NOS终止子基因的引物和探针：
[0073] 上游引物：ATCGTTCAAACATTTGGCA(SEQ ID No：21)；
[0074] 下游引物：ATTGCGGGACTCTAATCATA(SEQ ID No：22)；
[0075] 探针：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1(SEQ ID No：23)；其中，FAM为荧光基团，BHQ1为淬灭基团。
[0076] 结果表明：普通荧光定量PCR能够检测转基因含量为0.1％的样品，而多重巢式荧光定量PCR能够检测转基因含量为0.01％的样品，高于SN/T 1204-2003标准中普通荧光定量PCR方法1个数量级。多重巢式荧光定量PCR灵敏度实验扩增曲线见图3；SN/T 1204-2003灵敏度实验扩增曲线见图4。
[0077] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
