天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒

摘要

本发明公开一种天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，组成为：试剂1：缓冲液pH6.5～8.00.02～0.5mol/L，L-天冬氨酸钾0.15～0.3mol/L，苹果酸脱氢酶0.3～5KU/L，乳酸脱氢酶0.3～5KU/L，人源cAST抗体5～20mL/L，抗体稳定剂0.01～3％，酶稳定剂0.01～10％，防腐剂0.01～1％；试剂2：缓冲液pH7.0～9.00.02～0.5mol/L，α-酮戊二酸0.005～0.02mol/L，还原型辅酶Ⅰ0.1～0.5mmol/L，防腐剂0.01～1％，还原型辅酶Ⅰ稳定剂0.01～10％。具有稳定性好的优点。

权利要求

1.一种天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂1和试剂2两种液体试剂构成，其中：试剂1：

缓冲液pH6.5~8.0 0.02~0.5 mol/L，L-天冬氨酸钾 0.15~0.3 mol/L，苹果酸脱氢酶 0.3~5 KU/L，乳酸脱氢酶 0.3~5 KU/L，人源cAST抗体 5~20 mL/L，抗体稳定剂 0.01~3 %，酶稳定剂 0.01~10 % ，防腐剂 0.01~1 %，

试剂2：

缓冲液pH7.0~9.0 0.02~0.5 mol/L，α-酮戊二酸 0.005~0.02 mol/L，还原型辅酶Ⅰ 0.1~0.5 mmol/L，防腐剂 0.01~1 %，

还原型辅酶Ⅰ稳定剂 0.01~10 %；

所述的抗体稳定剂为甘氨酸和柠檬酸、甘氨酸和肝素、柠檬酸和组氨酸、肝素和组氨酸组合中的一种；

所述的酶稳定剂为海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或者几种；

所述的还原型辅酶Ⅰ稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂1或2中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-羟基乙烷磺酸）缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-乙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、

4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于：所述的抗体稳定剂为组氨酸和柠檬酸的组合。

4.根据权利要求1所述的天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为NaN3或proclin300中的一种。

说明书

天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶(m-AST或mAST线粒体型天门冬氨酸氨基转移酶)检测试剂盒。

背景技术

[0002] 天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)广泛存在于人体各种组织细胞中，尤以肝、心组织细胞含量最为丰富，而正常人血清中AST活性很低。人体中AST存在两种同工酶，一种是cAST，主要来源于细胞浆，另一种是mAST，存在于线粒体内。这两种同工酶在基因组成上有差异，在氨基酸组成、免疫学特性以及在体内的半衰期等均不同。

[0003] 在机体轻度病变时，组织细胞的细胞膜通透性增高，cAST透过细胞膜进入血液系统中，但mAST有两层线粒体膜的保护，不易释放入血；而当机体严重疾病时，出现细胞坏死、线粒体崩解，附着在线粒体上的mAST可迅速释放进入血中。因此，血清mAST活性可反映组织细胞的坏死程度，若血清中检测出高水平mAST，则表明心肌、肝脏严重受损；另外mAST在血中的半衰期比cAST短，当细胞不再破坏或修复时，血清中mAST很快降至正常水平，因此mAST又是心肌、肝脏损害预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗具有重要的价值。

[0004] 目前，血清中mAST测定主要有电泳法、层析法以及免疫抑制法等，尤以免疫抑制法具备特异、准确、快速简便、可用于自动化检测的优点，适合于临床大规模标本的应用。其检测原理是：人源cAST抗体与血清样本中cAST作用形成免疫复合物，使cAST活性被抑制，而mAST活性不受影响，mAST可与苹果酸脱氢酶(MDH)催化的反应偶联，使还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化成NAD+，通过检测特定波长处NADH吸光度下降的速率，计算可得mAST的活性。反应式如下：

[0005]

[0006]

[0007] 由上述反应原理可知，人源cAST抗体是mAST活性测定体系的关键原料，人源cAST抗体成为能否精确测定人血清样本中mAST活性的关键。然而，根据本领域常识，抗体以溶液状态长期存放时，会发生化学分解物的生成、不溶性凝集物的生成、可溶性缔合物的生成等现象，从而导致抗体的生物活性大大降低，因此抗体多数以在-20℃环境下保存为最佳，为了保持抗体的活性，只能在使用时临时配置试剂盒，而这显然不适用于商品化的液体试剂盒。

发明内容

[0008] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种稳定性优良的天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒。

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，该试剂盒由以下两种液体试剂构成，其中：

[0010] 试剂1：

[0011]

[0012] 试剂2：

[0013]

[0014] 其中，所述的试剂1或2中的缓冲液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液中的一种或几种；

[0015] 所述的抗体稳定剂可以是甘氨酸和柠檬酸、甘氨酸和肝素、柠檬酸和组氨酸、肝素和组氨酸组合中的一种，优选组氨酸和柠檬酸的组合，上述顺序组合之间的重量配比为：组氨酸：柠檬酸＝10～100：1；

[0016] 所述的酶稳定剂是海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或者几种；

[0017] 所述的防腐剂是NaN3或proclin300中的一种；

[0018] 所述的还原型辅酶Ⅰ稳定剂是海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或几种。

[0019] 本发明的优点和有益效果：本发明的mAST检测试剂盒通过添加抗体稳定剂，提高了试剂盒中人源cAST抗体在液体状态的稳定性，另外通过联合添加酶稳定剂及还原型辅酶Ⅰ稳定剂，因此更有效地保证了试剂盒整体的稳定性，极大地满足了临床检测和诊断的需求。具体实施例

[0020] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

[0021] 实施例1

[0022] 一种mAST检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，其中：

[0023] 试剂1：

[0024]

[0025] 试剂2：

[0026]

[0027] 实施例2

[0028] 一种mAST检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，其中：

[0029] 试剂1：

[0030]

[0031]

[0032] 试剂2：

[0033]

[0034] 下面对本发明实施例1所得试剂的稳定性能进行说明。

[0035] 1、抗体稳定性：

[0036] 按照下述方法配置以下三组试剂：

[0037] 组①：按照实施例1所述配方配置试剂，并于2～8℃贮存18月；

[0038] 组②：除不添加抗体稳定剂外，其余按照实施例1所述配方配置试剂，并于2～8℃贮存18月；

[0039] 组③：18月后，按照实施例1所述配方新配置试剂(加入的抗体为-20℃冻存的同一批抗体)。

[0040] 将上述三组试剂置于全自动生化分析仪上，按照以下方法设置测定参数并同时测定10份人血清mAST的活性：反应温度37℃，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测血清样本/空白对照与试剂比为：样本/对照：试剂1：试剂2＝18uL:240uL:60uL，反应为降反应。测试方法为：样本/对照先与试剂1混合孵育5min，之后加入试剂2，1.5min中后开始读数，并在测定波长下连续监测3min内各样本吸光度的变化，计算平均每分钟的吸光度变化值△A/min，并按照以下公式计算mAST活性值：mAST活性(U/L)＝(△A测定/min-△A空白/min)×F(2840.3)。测定结果如表1所示。

[0041] 表1mAST检测试剂盒抗体稳定性结果

[0042]

[0043] 由表1结果可以看出：未添加抗体稳定剂的试剂在贮存18月后，所测得的结果比新配置的试剂高出10％左右，说明在液体试剂中的抗体存放18月后生物活性有所降低，抑制能力有所下降；而添加了抗体稳定剂的试剂，测定的结果与新配试剂仍能保持一致(±3％)，表明抗体稳定剂能有效地保护液体试剂中抗体的生物活性，提高了抗体的稳定性。

[0044] 2、热稳定性：

[0045] 按照实施例1所述配方配置试剂，置于37℃水浴环境下热破坏7d，测定并记录7d内试剂的空白吸光度变化值，并于第7d测定10份人血清样本的mAST值。

[0046] 表2mAST检测试剂37℃水浴7d内各空白吸光度值