来自于淤泥滩宏基因组的基因和从其获得的显示出磷脂酶和脂肪酶共活性的蛋白质

摘要

本发明涉及来自于淤泥滩宏基因组的新基因，并涉及从其获得的显示出磷脂酶和脂肪酶共活性的新蛋白质。特别地，从潮滩土壤微生物的宏基因组文库分离的新基因以及由所述新基因编码的具有磷脂酶和脂肪酶活性的所述蛋白质：以水溶性形式表达，因此可大量生产；通过使用Ni‑NTA柱的单步纯化能够获得超高纯度的蛋白质；在pH5至10的范围内显示良好的活性；在温度达3℃至40℃下维持良好的低温活性和稳定性；并且具有针对多种有机溶剂的高抗性。因此，所述新基因和蛋白质可有用地用于多个工业领域，例如油和脂肪的纯化和转化、生物医学和精细化学。

权利要求

1.多肽，其既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性并且由SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述磷脂酶和脂肪酶的活性pH在5至10的范围内。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述磷脂酶和脂肪酶的活性温度在3℃至30℃的范围内。

4.多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ.ID.NO:3所示核苷酸序列组成。

6.重组表达载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸。

7.转化体，其通过用权利要求6所述的重组表达载体转染宿主细胞来制备。

8.根据权利要求7所述的转化体，其中所述转化体以KCTC 11942BP的登记号保藏。

9.既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

1)构建含有权利要求4所述之多核苷酸的重组表达载体；

2)通过将上述重组表达载体引入到宿主细胞中来制备转化体；以及

3)培养所述转化体并诱导其中所述重组蛋白的表达，随后获得所表达的重组蛋白。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中在步骤1)中还将编码用于分离/纯化的标签及蛋白酶识别位点的多核苷酸与权利要求4所述之多核苷酸的末端相连接，其中权利要求4所述之多核苷酸的所述末端对应于权利要求4所述之多核苷酸所编码多肽的N末端。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述用于分离/纯化的标签为选自GST、多聚Arg、FLAG、His标签和c-myc的一种或更多种标签。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其中包括另外的步骤，所述步骤为使用能够消化所述蛋白酶识别位点的蛋白酶进行处理从而获得原始形式的重组蛋白，所述重组蛋白既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性。

13.既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性并且由SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列构成的多肽用于制备洗涤剂的用途。

说明书

来自于淤泥滩宏基因组的基因和从其获得的显示出磷脂酶和

脂肪酶共活性的蛋白质

技术领域

[0001] 本发明涉及既显示出磷脂酶活性又显示出脂肪酶活性的新蛋白质，更准确地，从潮滩沉积物的微生物宏基因组分离的且既显示出磷脂酶活性又显示出脂肪酶活性的基因以及由其编码的显示出钙依赖的磷脂酶和脂肪酶共活性的蛋白质。

背景技术

[0002] 脂肪酶(lipase；甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)为属于能够分解或合成长链酰基甘油(long-chain acylglycerol)之α/β水解酶的羧基酯水解酶(carboxy ester hydrolase)。目前为止，已经证实多种动物、植物和微生物合成脂肪酶。因此，已经积极地进行了对脂肪酶生物化学性质的研究和对脂肪酶基因的研究。内源脂肪酶不仅参与脂肪代谢，而且在有机溶剂中比较稳定。该内源脂肪酶不需要辅酶，具有宽底物特异性和比较高的光学特异性，使得其在洗涤剂工业、食品添加剂生产、造纸工业中的树脂(pitch)脱除等领域中用于生物转化为极好的生物催化剂。已经进行研究来高效大量生产这种工业可用的且有价值的脂肪酶。特别地，研究已经主要聚焦于微生物产生的脂肪酶。能够产生脂肪酶的宿主例如假丝酵母属(Candida sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、青霉菌属(Penicilium sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、根霉菌属(Rhizopus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和链霉菌属(Streptomyces sp.)。

[0003] 通过磷脂酶水解磷脂产生溶血磷脂(lysophospholipid)，其不仅在血小板聚集的过程中充当功能性基团，而且介导多种生理活动(包括信号转导或作为植物激素在防止果实和植物过熟中起作用)。特别地，溶血磷脂具有高水溶性且甚至可以在不同氢离子浓度和温度下形成稳定的乳液。溶血磷脂还在有镁和钙离子存在下稳定，因此其已经被用在医药、化妆品和食品工业领域中。

[0004] 所述溶血磷脂可由在某些生物化学途径中通过磷脂酶介导的磷脂产生，且此时磷脂酶A水解磷脂的1-酰基或2-酰基以产生溶血磷脂和脂肪酸。所述磷脂酶A在含有有用的脂肪酸(例如由DHA或EPA等示例的多不饱和脂肪酸(PUFA))之磷脂的合成中是必不可少的酶。所述磷脂酶A分离自多种哺乳动物、蛇或蜂毒以及微生物，例如沙雷氏菌属(Serratia sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp.)，且可应用于食品工业。为了使该酶在更多的工业领域中使用，必须改善该酶的底物特异性或酶稳定性(De Maria等,Appl.Microbiol.Biotechnol.74:290-300,2007)。

[0005] 脂肪酶和磷脂酶都显示出彼此相似的机制。然而，从猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)获得的脂肪酶为显示出脂肪酶和磷脂酶共活性的唯一酶(van Oort等,Biochemistry,28:9278-9285,1989)。所述源自猪葡萄球菌的酶难以大规模生产，且具有比较低的稳定性，这使得其在工业中较少使用。

[0006] 在生产高附加值先导化合物(包括药物产品)的精细化学领域中，当通过常规化学方法合成酯化合物时，在高温高压下需要能量的高消耗完成所述合成，这引起许多副反应，其可对产品的品质有不好的影响。此外，常规方法具有低转化率和在一些光学异构体中低纯度的缺点，因此，已经困扰了高纯度精细化学产品的生产。为克服上面的问题，最近的研究已经聚焦于利用使用显示出位点特异性和光学特异性的酶作为生物催化剂的这类反应。然而，因为在低温下丧失酶活性的问题，这样的尝试已经限制了其应用。

[0007] 脂肪酶将脂质泥土水解为水溶性脂肪酸或甘油，表明其使得表面活性剂的功能变得容易。因此，脂肪酶已经成为作为洗涤剂或漂白添加剂的目标，但是到目前为止其并未实践。这是因为脂肪酶在低洗涤温度下丧失其酶活性，意味着油和脂肪组分不被完全除去。

[0008] 适合于培养的微生物是尝试找出具有极好活性和稳定性的酶的主要目标。从这些微生物的一些中鉴定的多种酶已经在工业上使用。然而，最近的分子微生物生态学研究证明自然界中至少99％的微生物不能在实验室中通过常规培养方法进行分离或鉴定(Amann等,Microbiol.Rev.59:143-169,1995；Hugenholtz和Pace,Trends Biotechnol.14:190-197,1996；Ward等,Nature 345:63-65,1990)。因此，已经进行了新的尝试以寻找新基因，其由于来自通过使用宏基因组(metagenome)构建的文库之培养物的困难性而不能被鉴定，直接从自然界提取微生物基因组而没有培养的过程，且进一步从其开发可用的材料。

[0009] 宏基因组为这样的定义，其表明存在于自然界中所有微生物的基因组。通常，宏基因组研究由以下步骤构成：无培养下从自然界中的微生物分离宏基因组；构建其文库；且将所述文库引入适于培养的大肠杆菌(E.coli)中。该方法将从不能培养的那些微生物中获得可用的材料。即使非常难以获得关于此类微生物的信息(目标基因的来源)，该方法具有同时获得可用产物和微生物基因的优点。

[0010] 在美国威斯康星大学的一个研究团队是第一个成功地分离出大量宏基因组且其后通过将所述宏基因组克隆至细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)载体来构建宏基因组文库的研究组。他们还成功地分离了广谱抗生素和其中包含的基因(Gillespie等,Appl.Environ.Microbiol.68:4301-4306,2002；Rondon等,Appl.Environ.Microbiol.66:2541-2547,2000)。一个TIGR(The Institute for Genomic Research)组也在BAC载体中构建了通用海洋微生物宏基因组文库以筛选那些目前为止不能培养之海洋微生物的遗传资源。

[0011] 本发明人从潮滩沉积物获得的微生物宏基因组文库分离了新基因，其中所述潮滩沉积物具有独特的微生物多样性(包括多种不可培养的微生物)，构建了包含所述基因的载体，用所述载体转染了大肠杆菌，并因此确认了从如上构建的转化体产生的蛋白质同时显示出极好的磷脂酶和脂肪酶活性，并甚至在低温下和碱性环境中也具有极好的活性和稳定性，从而完成了本发明。

发明内容

[0012] 本发明的一个目的在于提供从潮滩沉积物微生物的宏基因组分离出的新基因、含有所述基因的重组载体、用所述载体转染的转化体以及由所述基因编码的既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的多肽。

[0013] 本发明的另一个目标在于提供含有既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明多肽作为活性成分的洗涤剂添加剂。

[0014] 本发明的另一个目标在于提供洗涤方法，其包括用既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明多肽处理材料表面的步骤。

[0015] 本发明的另一个目的在于提供既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明多肽用于制备洗涤剂的用途。

[0016] 技术方案

[0017] 为了实现上述目的，本发明提供了多肽，其由SED.ID.NO:5所示氨基酸序列构成并既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性。

[0018] 本发明还提供了编码本发明之多肽的多核苷酸。

[0019] 本发明进一步提供了含有本发明之多核苷酸的重组表达载体。

[0020] 本发明还提供了通过用本发明之重组表达载体转染宿主细胞制备的转化体。

[0021] 本发明还提供了既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

[0022] 1)构建含有本发明之多核苷酸的重组表达载体；

[0023] 2)通过将上述重组表达载体引入到宿主细胞中来制备转化体；以及[0024] 3)培养所述转化体并诱导其中重组蛋白的表达，随后获得所表达的重组蛋白。

[0025] 本发明还提供了含有既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之本发明多肽作为活性成分的洗涤剂添加剂。

[0026] 本发明还提供了洗涤方法，其包括用既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之本发明多肽处理材料表面的步骤。

[0027] 此外，本发明提供了既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之本发明多肽用于制备洗涤剂的用途。

[0028] 在下文中定义在本发明中使用的术语。

[0029] 本发明中使用的术语“重组表达载体”表示能够在适当宿主细胞中表达目标蛋白质或目标RNA的载体，其为线性或环状DNA分子，所述DNA分子由编码与提供用于所述表达载体转录的另外片段可操作地相连接之目标多肽的片段构成。此类另外片段包括启动子和终止子序列。所述表达载体包含一个或更多个复制起始点、一个或更多个选择标记以及多腺苷酸化信号等。所述表达载体通常从质粒或病毒DNA诱导产生，或者含有它们二者。

[0030] 本发明中使用的术语“可操作地连接(operably linked)”表示核酸表达调节序列和编码目标蛋白质或RNA之核酸序列间的功能性连接(functional linkage)，从而完成一般功能。例如，启动子和编码蛋白质或RNA之核酸序列间的功能性连接可影响所述核酸序列的表达。可通过本领域技术人员公知的遗传重组技术进行重组载体的可操作连接，且通过使用本领域技术人员公知的酶完成位点特异性DNA切割和连接。

[0031] 在下文中，详细地描述本发明。

[0032] 本发明提供了多肽，其既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性并由SED.ID.NO:5所示氨基酸序列构成。

[0033] 本发明还提供了编码SED.ID.NO:5所示既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之多肽的多核苷酸。

[0034] 所述磷脂酶和脂肪酶优选地在pH 5至10的范围内，且更优选地在pH 6至9的范围内，且最优选地在pH 8显示极好的活性，但不总限于此。

[0035] 所述磷脂酶和脂肪酶的活性温度优选为3至30℃，且更优选为5至25℃，但不总限于此。

[0036] 本文的多核苷酸优选地由SED.ID.NO:3所示核苷酸序列构成，但不总限于此。

[0037] 在本发明一个优选的实施方案中，从潮滩沉积物样品提取DNA，然后将其克隆至福斯黏粒(fosmid)载体以构建宏基因组文库。将所述文库分布在补充有辛酸甘油酯(tricaprylin)乳液的固体营养培养基中，随后培养。筛选形成亮区的菌落并分离重组的质粒pFosPlaG，随后进行核苷酸测序。在美国GenBank注册经鉴定的基因(SED.ID.NO:1)(登记号：EU285670)。对应于由SED.ID.NO:1所示序列之第2881个核苷酸和第4578个核苷酸之间区域的开放阅读框(open reading frame，ORF)为既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白质编码区，其被鉴定为既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的基因，所述基因由SED.ID.NO:2所示核苷酸序列构成(1698bp)。将具有磷脂酶和脂肪酶两种活性的基因命名为PlaG。

[0038] 在本发明一个优选的实施方案中，使用BLAST数据库将本发明的磷脂酶/脂肪酶PlaG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白质)序列与其他常规蛋白质比较。结果，所述蛋白质在全序列的氨基末端和羧基末端与其他具有不同特征的蛋白质显示出同源性。特别地，氨基末端的287个氨基酸残基显示出与来自贝日阿托氏菌属(Beggiatoa sp.)PS之分泌蛋白质(secreted protein；ZP_02001945)最高的同源性，其高至54％(参见图1A)。同时，羧基末端的167个氨基酸残基显示与来自霍利斯格里蒙菌(Grimontia hollisae)CIP 
101886的磷脂酶最高的同源性，但是显示与之前报道的磷脂酶基因组的低同源性，其低至
30％至35％，表明本发明的基因是编码磷脂酶的新基因。在本发明的磷脂酶/脂肪酶PlaG与类似的磷脂酶氨基酸序列之间比较氨基酸序列的同源性。结果，确认本发明的序列具有催化三联体(catalytic triad)，所述三联体由α/β水解酶保守的Gly-X-Ser-X-Gly共有序列(consensus sequence)中的435位Ser、496位Asp和550位His构成，且周围的氨基酸由磷脂酶A的特征序列构成(参见图1B)。特别地，鉴定氨基末端的26个氨基酸残基为分泌信号肽(signal peptide)且序列从第27个残基(Ala)(分泌信号肽结束的地方)至第157个残基(Gly)重复如下158位Thr至287位Gly之间的范围。也就是说，确认SED.ID.NO:2所示基因具有由氨基末端的287个氨基酸残基形成之结构域构成的结构和由羧基末端的278个氨基酸残基构成的功能性结构域(MPlaG)。基于此发现，通过使用SED.ID.NO:2所示序列设计仅由催化域构成的开放阅读框MPlaG，其如SED.ID.NO:3所示。脂肪酶通常倾向于胞外分泌，并且此过程在不同微生物类型中不同。因此，本文设计的开放阅读框避免了外源蛋白表达的这种困难。既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性并如SED.ID.NO:3所示MPlaG基因中鸟嘌呤-胞嘧啶含量为44.1％，由此获得之蛋白质的分子量为约30.5kDa，且等电点为(PI)4.0。

[0039] 在本发明一个优选的实施方案中，使用由SED.ID.NO:3所示序列编码之多肽磷脂酶/脂肪酶MPlaG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白质)的氨基酸序列(SED.ID.NO:5)与其他多种目前已知的脂肪酶和磷脂酶的氨基酸序列一起构建系统发生树(phylogenetic tree)。结果，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG不属于任何脂肪酶家族，但是与其他磷脂酶在系统发生中具有较高相关性(参见图3)。也就是说，本发明之源自潮滩宏基因组 的磷脂酶/脂肪酶MPlaG具有与脂肪酶或磷脂酶A共同的共有序列，但确实为显示与常规脂肪酶或磷脂酶低同源性的新酶。

[0040] 在本发明一个优选的实施方案中，将SED.ID.NO:3所示MPlaG基因克隆到载体中(参见图2)，并用所述载体转染大肠杆菌。通过SDS-PAGE确认从转化体产生的磷脂酶/脂肪酶MPlaG。经确认的基因具有约31kDa的分子量。还确认了本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG以水溶性形式表达(参见图10)。

[0041] 在本发明一个优选的实施方案中，将本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG滴在补充有磷脂酰胆碱乳液的固体培养基上以研究由SED.ID.NO:3所示MPlaG基因的磷脂酶活性。通过研究其中形成的亮区测量所述活性。结果，在用本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG处理的固体培养基上清晰地形成了亮区，表明所述MPlaG基因也具有磷脂酶活性(参见图4)。

[0042] 本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的特征如下：其在pH 5至10的范围内是稳定的，并在pH 8下显示最大活性(参见图5)；其在温度达40℃下有活性并在25℃下显示最大活性(参见图6)；且其具有38.5℃的熔解温度(melting temperature)，其已经通过差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)确认(参见图7)。研究了本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG对多种磷脂的特异性。结果，其显示了对于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油极好的活性，但是不分解已知通过分泌的磷脂酶A降解的磷脂酰丝氨酸和磷脂酸(参见图8)。MPlaG表现出对于具有长酰基直链的对硝基苯基酯、具有短酰基直链的甘油三酯和具有中等长度酰基直链之磷脂的高偏好，表明其具有对于底物的链长度特异性。经纯化的酶表现出其对于不被酯酶(esterase)水解之油酸甘油酯(triolein)(c18:1)的活性。测量具有提高的丁酸甘油酯(tributyrin)浓度之经纯化的酶的水解酶活性，结果所述酶显示了界面活性，表明MPlaG不是酯酶(参见图9A)。此外，使用1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)通过液相色谱质谱法(Liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)确定MPlaG的水解位点(参见图11)。特别地，在25℃下将MPlaG与OPPC(分子量：759)反应12小时，随后进行LC-MS。LC-MS的结果确认了MPlaG分解OPPC(m/z 804,[M-H+HCOOH]-)以产生反应产物(m/z 540)。如果MPlaG在OPPC的sn-2位点消化棕榈酸(palmitic acid)，则将在m/z 567下已经观察到反应产物。然而，在m/z 540([M-h+COOH-C18:1]-)下检测到对应于2-棕榈酰基-溶血磷脂酰胆碱的MS谱。因此，表明MPlaG可鉴定为能够在磷脂的sn-1位点加速酰基基团水解的磷脂酶A1。此外，还研究了多种添加剂如何影响所述酶。结果，Ca2+约提高了所述酶活性10倍(参见表1)且所述活性不被多种有机溶剂所抑制(参见表2)。

[0043] 具有与具有SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列的本发明之多肽序列不同的序列的氨基酸变体或片段也可包括在本发明的标准中，只要所述变体或所述片段不影响蛋白质的功能，所述变体或蛋白质可通过缺失、插入、替换或所述多肽之氨基酸残基的组合产生。本领域技术人员公知蛋白质和肽中氨基酸的修饰是可接受的，只要其不改变分子的一般活性。这样的修饰(modification)包括磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化(methylation)和法尼基化(farnesylation)。因此，本发明不仅包括具有SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列的多肽，而且包括具有相同氨基酸序列及其变体或其活性片段的多肽。本文中，具有相同氨基酸序列的所述多肽表明其在氨基酸序列中具有至少80％同源性，更优选地至少90％、且最优选地至少
95％同源性，但不总限于此，并且实际上具有至少70％氨基酸序列同源性并显示相同生物化学活性的序列可包括在本发明中。

[0044] 本发明的多核苷酸优选为SEQ.ID.NO:3所示的那个。然而，考虑到被认为表达既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之基因的生物中的密码子简并(degeneracy)或密码子偏好，允许在编码区的多种修饰或转化，只要所述修饰或转化不造成从编码区表达的既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之蛋白质氨基酸序列的任何变化。也可允许这样的修饰或转化在其他区而非编码区，只要所述修饰或转化不影响基因表达即可。这样经修饰的基因也可包括在本发明的标准中，这被本领域技术人员很好地理解。因此，本发明包括实际上具有与SEQ.ID.NO:3所示基因相同核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述基因既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性。“实际上具有相同核苷酸序列的多核苷酸”意指序列具有至少80％同源性，更优选地至少90％同源性，且最优选地至少95％同源性的多核苷酸，但不总限于此。事实上，序列具有至少70％同源性且具有与所编码蛋白相同生物化学活性的多核苷酸也包括在本发明中。如在上文中所解释的，允许本发明的多核苷酸具有替换、缺失、插入或者一个或更多个核酸核苷酸的组合，表明其可被修饰，只要经修饰的多核苷酸仍可编码具有相同活性的蛋白质。这样经修饰的多核苷酸也可包括在本发明的标准中。具有SEQ.ID.NO:5所示的氨基酸序列的多肽优选地由具有SEQ.ID.NO:3所示多核苷酸序列的核酸分子编码，但不总限于此。事实上，本发明的多肽还可由任何核酸分子编码，所述核酸分子具有与SEQ.ID.NO:3所示序列不同但相似的核苷酸序列，只要其可编码本发明的蛋白质即可。所述核酸分子序列可以是单链或双链DNA或RNA(mRNA)。

[0045] 本发明还提供了包含SEQ.ID.NO:3所示本发明多核苷酸的重组表达载体。

[0046] 在构建所述重组表达载体的过程中，根据来产生既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之基因或蛋白质的宿主类型，适当地选择表达调节序列(例如启动子(promoter)、终止子(terminator)或增强子(inhancer))和用于膜靶向或分泌的序列，且那些序列可根据使用目的适当地组合。

[0047] 本发明的表达载体包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体和病毒载体，但不总限于此。可以通过含有表达调节元件(例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子)、用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列构建所述表达载体以满足使用目的。所述表达载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。当宿主为埃希氏菌属(Escherichia sp.)时，信号序列可以是PhoA信号序列或OmpA信号序列。当宿主为芽孢杆菌属时，信号序列可以是α-淀粉酶信号序列或枯草杆菌蛋白酶信号序列。当宿主为酵母(yeast)时，信号序列可以是MFα信号序列或SUC2信号序列。当宿主为动物细胞时，信号序列可以是胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列或抗体分子信号序列，但不总限于此。所述表达载体可包含用于选择适于具有表达载体之宿主细胞的选择标记。如果表达载体是可复制的，则其可包含复制起点。当将含有编码本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG之基因的重组表达载体引入宿主且所述磷脂酶/脂肪酶MPlaG蛋白在其中表达时，可观察到所述蛋白质的活性。因此，可通过向宿主细胞的培养基添加底物(例如辛酸甘油酯)来选择经转化的宿主细胞而无需选择标记。

[0048] 本发明的重组表达载体可含有适于所表达靶标纯化的序列。特别地，与具有磷脂酶和脂肪酶两种活性之基因可操作地连接的编码用于分离和纯化的标签的多核苷酸可与载体相连接。此时，所述用于分离和纯化的标签选自GST、多聚Arg(poly-Arg)、FLAG、His标签(His-tag)和c-myc，或者可逐步连接的那些标签中的两个或更多个。

[0049] 在本发明一个优选的实施方案中，将His标签连接至C末端，然后通过使用Ni-NTA(Ni-次氮基三乙酸，Qiagen，德国)柱纯化所表达的磷脂酶/脂肪酶MPlaG。

[0050] 在本发明一个优选的实施方案中，将SEQ.ID.NO:3所示的MPlaG基因克隆到载体中(参见图2)，并用所述载体转染大肠杆菌。然后，通过SDS-PAGE确认从转化体产生的磷脂酶/脂肪酶MPlaG蛋白。结果，确认成功地产生具有约31kDa分子量的蛋白质。还确认了本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG以水溶性形式表达(参见图10)。

[0051] 本发明还提供了通过用包含SEQ.ID.NO:3所示本发明之多核苷酸的重组表达载体转染宿主细胞而制备的转化体。

[0052] 将本发明的重组表达载体插入合适的宿主细胞(例如大肠杆菌或酵母，优选大肠杆菌)后，培养经转染的宿主细胞以复制或大量生产新基因的DNA或既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的新蛋白质。可基于本领域技术人员公知的常规方法和条件由本领域技术人员选择培养方法、培养基和培养条件。

[0053] 在本发明一个优选的实施方案中，构建含有新MPlaG基因的重组载体pET22b(+)-MPlaG，将其插入大肠杆菌BL21(DE3)中。研究了经转染菌株中所表达磷脂酶/脂肪酶MPlaG的活性。结果，用不含所述基因的pET-22b(+)载体转染的大肠杆菌不降解辛酸甘油酯和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)。相反地，用含有本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的载体转染的大肠杆菌成功降解了辛酸甘油酯和磷脂酰胆碱，因此显示出磷脂酶和脂肪酶两种活性(参见图4)。因此，确认既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明基因在大肠杆菌转化体中表达并在其中有效地显示其活性，所述基因已经从潮滩沉积物的宏基因组文库中分离。为确认磷脂酶和脂肪酶两种活性，将等量的蛋白质加载到含有辛酸甘油酯和磷脂酰胆碱的固体培养基上。结果，在含有辛酸甘油酯(脂肪酶底物)和磷脂酰胆碱(磷脂)的培养基上形成了亮区，表明不仅显示了磷脂酶活性，而且显示了脂肪酶活性(参见图4)。将大肠杆菌转化体BL21(DE3)/pET22b(+)-MPlaG于2011年5月24日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(登记号：KCTC 11942BP)。

[0054] 本发明还提供了既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

[0055] 1)构建含有多核苷酸SEQ.ID.NO:3的重组表达载体；

[0056] 2)通过将上述重组表达载体引入到宿主细胞中来制备转化体；以及[0057] 3)培养所述转化体并诱导其中重组蛋白的表达，随后获得所表达的重组蛋白。

[0058] 在步骤1)中，另外可将编码用于分离和纯化的标签的多核苷酸以及蛋白酶识别位点与所述多核苷酸的N末端相连接。因此，可获得磷脂酶/脂肪酶MPlaG的纯化的或原始的形式。也就是说，可通过添加以下另外步骤来获得原始形式的磷脂酶/脂肪酶MPlaG：通过使用用于分离和纯化的标签来纯化磷脂酶/脂肪酶MPlaG，然后将其用能够消化蛋白酶识别位点的蛋白酶处理。

[0059] 所述用于分离和纯化的标签为优选地选自GST、多聚Arg、FLAG、His标签和c-myc的一种或更多种标签，且更优选His标签，但不总限于此。

[0060] 本发明还提供了含有包含作为活性成分的SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列并既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之多肽的洗涤剂添加剂。

[0061] 本发明还提供了洗涤方法，其包括用既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明多肽处理材料表面的步骤。

[0062] 此外，本发明提供了既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的本发明多肽用于制备洗涤剂的用途。

[0063] 从潮滩沉积物之宏基因组文库分离出的所述新基因以及由所述新基因编码的具有磷脂酶和脂肪酶活性的蛋白质：以水溶性形式表达以大量生产；使用Ni-NTA柱通过单步纯化能够获得超高纯度的蛋白质；在pH 5至10的范围内显示良好的活性；在温度达3℃至40℃下维持良好的低温活性和稳定性；并且具有针对多种有机溶剂的高抗性。因此，所述新基因和所述蛋白质可有用地用于多个工业领域，例如油和脂肪的纯化和转化、生物医学和精细化学。

[0064] 有益的效果

[0065] 如上文中所说明的，从潮滩沉积物微生物的宏基因组文库分离出的新基因以及由所述新基因编码的具有磷脂酶和脂肪酶活性的蛋白质：以水溶性形式表达以可大量生产；使用Ni-NTA柱通过单步纯化能够获得超高纯度的蛋白质；在pH 5至10的范围内显示良好的活性；在温度达3℃至40℃下维持良好的低温活性和稳定性；并且具有针对多种有机溶剂的高抗性。因此，所述新基因和所述蛋白质可有用地用于多个工业领域，例如油和脂肪的纯化和转化、生物医学和精细化学。

附图说明

[0066] 参考附图最好地理解本发明一些优选实施方案的应用，其中：

[0067] 图1为示出本发明之磷脂酶/脂肪酶PlaG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白PlaG)间的同源性的图，所述蛋白质具有与其氨基末端(A)的相似性且所述蛋白质具有与羧基末端(B)的相似性：

[0068] ZP_02001945：来自贝日阿托氏菌属(Beggiatoa sp.)PS的分泌蛋白质；

[0069] EBL22535：来自海洋宏基因组的推测蛋白质(hypothetical protein)；

[0070] AAD10476：来自沙雷氏菌属MK1的磷脂酶A1(phospholipase A1)；

[0071] AAM13978：来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的磷脂酶；

[0072] YP_001005338：来自小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)8081的磷脂酶A；

[0073] YP_001479905：来自变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)568的磷脂酶A1；并且

[0074] 用*标记的氨基酸表示保存完好的脂肪酶特异催化三联体，且加下划线的部分表示在磷脂酶A1Ser附近的共同氨基酸序列。

[0075] 图2为举例说明含有来自潮滩沉积物微生物宏基因组文库的新PlaG基因之催化域MPlaG的重组载体pET22b(+)-MPlaG的示意图。

[0076] 图3为举例说明来自潮滩宏基因组的磷脂酶/脂肪酶MPlaG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白MPlaG)之系统发生树的图，多种脂肪酶选自常规脂肪酶家族、磷脂酶/脂肪酶MPlaG样磷脂酶和其他已知的磷脂酶；通过使用程序MEGALIGN构建所述系统发生树，并且条表示氨基酸替换。

[0077] 图4为一组照片，其举例说明了本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG在补充有辛酸甘油酯或磷脂酰胆碱乳液的固体培养基上的活性。使用大肠杆菌BL21(DE3)(用于转化的宿主细胞)的细胞裂解物作为阴性对照，而使用南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)作为脂肪酶阳性对照。

[0078] 图5为举例说明本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG之pH依赖活性(●)和稳定性(■)的图。

[0079] 图6为举例说明本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG之温度依赖活性的图。

[0080] 图7为举例说明根据0mM(-)、2mM(○)和5mM(●)钙的本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG之熔解温度变化的图。

[0081] 图8为一组照片，其举例说明本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG针对多种磷脂的底物特异性。

[0082] 图9为一组图，其举例说明通过pH-滴定、光谱测定法和LC-MS测量的MPlaG对甘油三酯(a)、对硝基苯基酯(b)和磷脂酰胆碱(c)的链长度特异性；(a)和(b)中的垂直线和水平线分别表示底物碳链长度和对于最大活性(100％)的相对活性；在LC-MS中，通过HPLC分离的对于磷脂酰胆碱的MPlaG反应产物如下：

[0083] diC6PC，8.77分钟(1,2-二己酰基-磷脂酰胆碱，m/z 498,89.6％)和10.36分钟(2-己酰基-溶血磷脂酰胆碱，m/z 400,10.4％)；diC7PC，8.40分钟(1,2-二庚酰基-磷脂酰胆碱，m/z 526,50.5％)和9.99分钟(2-庚酰基-溶血磷脂酰胆碱，m/z 414,49.5％)；diC8PC，8.14分钟(1,2-二辛酰基-磷脂酰胆碱，m/z 554,49.6％)和9.73分钟(2-辛酰基-溶血磷脂酰胆碱，m/z 428,50.4％)；diC14PC，7.68分钟(1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱，m/z 722,
96.5％)和8.91分钟(2-肉豆蔻酰基-溶血磷脂酰胆碱，m/z 512,3.5％)。

[0084] 图10为举例说明进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果以证实本发明的纯化的磷脂酶/脂肪酶MPlaG的照片：

[0085] M：大小标记；

[0086] 泳道1：全长(full-length)磷脂酶/脂肪酶PlaG；

[0087] 泳道2：截短的蛋白质(truncated protein)1；以及

[0088] 泳道3：截短的蛋白质2(磷脂酶/脂肪酶MPlaG)。

[0089] 图11为一组举例说明鉴定MPlaG之磷脂酶A1活性的图；通过LC-MS确定MPlaG对OPPC(1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱)的位点特异性(a)；通过HPLC在16.93分钟的时间点分离的从MPlaG产生的反应产物(m/z804，OPPC，(b)的上图)和在18.14分钟分离的从MPlaG产生的反应产物(m/z 540，2-棕榈酰基-溶血磷脂酰胆碱，(b)的下图)。

[0090] 用于实施本发明的最佳方式

[0091] 本发明实际的和目前的优选的一些实施方案如下面实施例(实验实施例和制造实施例)所述举例说明。

[0092] 然而，应了解的是，本领域技术人员在考虑本公开内容后可在本发明的精神和范围内对其进行修改和改进。

[0093] 实施例1：构建宏基因组文库

[0094] 将从韩国全罗北道，扶安郡，新万金填海土地之潮滩收集的10g土壤样品悬浮在等体积的DNA提取缓冲液中，所述缓冲液含有50μg/ml的蛋白酶K[100mM Tris-HCl(pH 8)、100mM EDTA(乙二胺四乙酸，Sigma，美国)、100mM磷酸钠(pH 8，Sigma，美国)、1.5M NaCl(Junsei，日本)、1％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Sigma，美国)]，以终浓度2％(v/v)向其添加阴离子表面活性剂(十二烷基硫酸钠，SDS，Sigma，美国)，随后在65℃下反应2小时。通过离心获得上清液，向其以等体积添加30％(v/v)含有1.6M NaCl的聚乙二醇(polyethylene glycol)，随后均匀混合。通过离心分离沉淀的DNA，然后将其悬浮在TE缓冲液中。向其中添加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)混合溶液，随后提取两次。通过离心获得上清液，向其添加异丙醇以沉淀DNA。将沉淀的DNA完全干燥，然后溶解于无菌水中。去除杂质后，使用PFGE(脉冲场凝胶电泳，pulse-field gel electrophoresis)进行电泳以将DNA消化成23至48kb的片段。使用琼脂酶(Epicentre，美国)进行凝胶洗脱。使用经纯化的DNA片段通过使用CopyControl福斯黏粒文库构建试剂盒(Epicentre，美国)构建宏基因组文库。

[0095] 为检查所述文库的质量，随机选择转化体并从其提取重组质粒，其用所选的限制性酶处理。结果，它们都含有重组质粒且插入之宏基因组的平均大小为35kb。

[0096] 实施例2：筛选并分离具有脂肪酶活性的重组质粒

[0097] 为从实施例1中构建的宏基因组文库中筛选具有脂肪酶活性的基因，在含有辛酸甘油酯的固体培养基上培养所述宏基因组文库。

[0098] 特别地，将所述宏基因组文库分布在补充有辛酸甘油酯乳液[1％(v/v)辛酸甘油酯、1mM氯化钙(CaCl2)、0.5％(w/v)阿拉伯胶(Gum arabic)]的固体营养培养基[1％蛋白胨(trypton)(w/v)、0.5％(w/v)酵母提取物(yeast extract)、0.5％(w/v)氯化钠(NaCl)、1.5％(w/v)琼脂(agar)]上，随后在37℃下培养。当辛酸甘油酯被脂肪酶分解时，形成亮区。
因此，选择形成这样的亮区的菌落。从这样的显示极好分解辛酸甘油酯之活性的菌落分离出重组质粒并命名为pFosPlaG。

[0099] 实施例3：具有极好脂肪酶活性之重组质粒的测序

[0100] <3-1>重组质粒的测序

[0101] 通过鸟枪法测序(shot-gun sequencing)进行从宏基因组文库分离之重组质粒pFosPlaG的测序。

[0102] 特别地，通过使用移液管吹吸从pFosPlaG物理制备DNA片段，将其亚克隆到pUC118(TaKaRa)载体中。使用自动测序仪(ABI 3730DNA分析仪)进行测序。

[0103] 结果，pFosPlaG大小为28,845bp且基因的核苷酸序列与SEQ.ID.NO:1所示的序列相同，其在美国GenBank注册，登记号为EU285670。

[0104] 通过使用国立生物技术信息中心(NCBI)的ORF寻觅器(ORF finder)仅鉴定出具有e-2下之e值的那些ORF(开放阅读框)。通过使用BlastX预测每个ORF的功能。

[0105] 结果，如表1所示，共鉴定出15个ORF。确认了对应于与SEQ.ID.NO:1所示序列互补的核苷酸序列中核苷酸#2881至#4578之区域的ORF为磷脂酶蛋白编码区。因此，将所述基因命名为plaG。本发明的既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性基因(plaG)由1698个核苷酸构成，且GC含量为44.94％。从所述基因表达的磷脂酶/脂肪酶plaG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白plaG；SEQ.ID.NO:4)由566个氨基酸构成，其被鉴定为具有约61,187Da分子量且既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白质。

[0106] 【表1】

[0107]

[0108] <3-2>同源性分析

[0109] 使用BLAST数据库比较本发明的蛋白质和常规蛋白质间的氨基酸序列。

[0110] 结果，由磷脂酶/脂肪酶PlaG(SEQ.ID.NO:4)表达的，更优选地由所述PlaG之催化域MPlaG表达的磷脂酶/脂肪酶MPalG(既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性的蛋白质；SEQ.ID.NO:5)显示出与霍利斯格里蒙菌CIP 101886最高的同源性，但是显示与之前报道的磷脂酶基因组的低同源性，其低至30％至35％，表明所述基因是编码磷脂酶的新基因。研究本发明的磷脂酶/脂肪酶PlaG与类似的磷脂酶氨基酸序列间的同源性。结果，确认本发明的序列具有催化三联体，所述三联体由α/β水解酶保守的Gly-X-Ser-X-Gly共有序列中的435位Ser、496位Asp和550位His构成，且周围的氨基酸由磷脂酶A的特征序列([LIV]-{KG}-[LIVFY]-[LIVMST]-G-[HYWV]-S-{YAG}-G-[GSTAC])构成(图1B)。同时，磷脂酶/脂肪酶PlaG氨基末端的287个氨基酸残基显示出与来自贝日阿托氏菌属PS之分泌性蛋白质(ZP_
02001945)最高的同源性(54％)(图1A)。特别地，鉴定氨基末端的26个氨基酸残基为分泌信号肽且序列从第27个残基(Ala)(分泌信号肽结束的地方)至第157个残基(Gly)重复如下
158位Thr至287位Gly间的范围(图3)。基于分泌信号肽和重复序列的存在以及BLAST数据库搜索的结果，预测磷脂酶/脂肪酶PlaG由结构域和催化域构成。将磷脂酶/脂肪酶PlaG的功能性结构域命名为磷脂酶/脂肪酶MPlaG。

[0111] <3-3>用系统发生树的系统发生分析

[0112] 使用磷脂酶/脂肪酶MPlaG的氨基酸序列(SEQ.ID.NO:5)与其他多种目前已知的脂肪酶和磷脂酶氨基酸序列一起构建系统发生树。

[0113] 结果，如图3所示，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG不属于任何脂肪酶家族，但是与其他磷脂酶在系统发生上具有较高相关性(图3)。此外，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG与已知不仅具有脂肪酶活性而且具有极好的磷脂酶活性之猪葡萄球菌来源的脂肪酶离得很远。常规的来自沙雷氏菌属MK1、粘质沙雷氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌8081和变形斑沙雷氏菌
568的磷脂酶氨基酸序列显示出高同源性(59.7％至88.1％)，但显示出与本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的氨基酸序列的低同源性(17.2％至20.4％)。就是说，本发明的来自潮滩宏基因组的磷脂酶/脂肪酶MPlaG具有与脂肪酶或磷脂酶A共同的共有序列，但确实为显示与常规脂肪酶或磷脂酶低同源性的新酶。

[0114] 实施例4：构建转化体

[0115] 为构建能够大规模生产本发明之新磷脂酶/脂肪酶MPlaG的重组质粒，设计仅由PlaG催化域(MPlaG)构成的ORF并从其制备。将产物[从SEQ.ID.NO:2所示序列的第862bp起的837bp(SEQ.ID.NO:3)]克隆至pET-22b(+)(Novagen)载体的限制性酶位点(NdeI和XhoI)。通过用所制备的重组载体转染大肠杆菌BL21(DE3)来构建大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-MPlaG。

[0116] 特别地，通过使用从宏基因组文库筛选的重组质粒pFosPlaG作为模板DNA，以及用SEQ.ID.NO:6所示合成的N末端引物和SEQ.ID.NO:7所示合成的C末端引物进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)。

[0117] SEQ.ID.NO:6：5'-CCCCATATGTTAAATCAGTCTGATTATGA-3'

[0118] SEQ.ID.NO:7：5'-CCCCTCGAGAAATTTATCGTTCTCAAGCAT-3'

[0119] 本发明之MPlaG基因的N末端引物和C末端引物分别具有NdeI和XhoI切割位点，且分别为SEQ.ID.NO:6和SEQ.ID.NO:7所示寡核苷酸。重组载体pET22b(+)-MPlaG包含非常强大的T7启动子和其中的阅读信号。当将所述载体引入例如含有T7RNA聚合酶的大肠杆菌BL21(DE3)宿主中时，则可从其大量生产磷脂酶/脂肪酶MPlaG。而且，在C末端形成在磷脂酶和脂肪酶纯化中发挥作用的编码6个组氨酸的标签。

[0120] 用NdeI和XhoI消化通过PCR大量扩增的DNA片段，然后将其连接至用相同限制性酶和小牛肠磷酸酶(calf intestinal phosphatase)处理的表达载体pET-22b(+)来构建用于磷脂酶和脂肪酶表达的重组质粒pET22b(+)-MPlaG(图2)。通过用重组质粒pET22b(+)-MPlaG通过电穿孔转染大肠杆菌BL21(DE3)来构建转化体。将所述构建的转化体命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-MPlaG，将其于2011年5月24日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(登记号：KCTC 11942BP)。

[0121] 实施例5：确认磷脂酶/脂肪酶MPlaG的产生

[0122] <5-1>磷脂酶/脂肪酶MPlaG的表达和纯化

[0123] 将实施例4中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-MPlaG在含有氨苄青霉素(ampicillin,100μg/ml)的液体营养培养基[1％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)氯化钠(NaCl)]中培养直至OD600达到0.6。将IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)添加至培养物溶液(最终浓度：0.5mM)，随后进一步培养12小时。通过离心获得大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-MPlaG，将其悬浮于结合缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8，500mM氯化钠(NaCl)，10mM咪唑)中。通过超声裂解所述细胞悬液。离心细胞裂解物以获得上清液。将所述上清液加在Ni-NTA(次氮基三乙酸)柱上通过咪唑梯度以洗脱磷脂酶和脂肪酶，随后进行透析浓缩。为确认经纯化的磷脂酶/脂肪酶MPlaG，进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，随后用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)染色。

[0124] 结果，如图10所示，在表达诱导后12小时，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG成功地产生为分子量约31kDa的蛋白质。所述分子量非常接近既具有磷脂酶活性又具有脂肪酶活性之氨基酸序列的预期分子量，表明此蛋白质带为本发明的新磷脂酶/脂肪酶MPlaG。本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG以水溶性形式表达。确认了与全长蛋白磷脂酶/脂肪酶PlaG相比，本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的蛋白表达显著提高(图10)。此外，全长蛋白磷脂酶/脂肪酶PlaG总是与非特异性蛋白质(non-specific protein)一起存在，甚至在通过多个纯化过程或通过使用新载体系统表达之后。另一方面，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG可以以高纯度产生，甚至使用Ni-NTA柱的一步纯化过程。

[0125] <5-2>确认磷脂酶活性

[0126] 在补充有辛酸三甘油酯乳液的固体营养培养基中分离来自宏基因组文库的重组质粒pFosPlaG，其已经广泛地用于脂肪酶基因的分离/确认。为研究所述基因的磷脂酶活性，将磷脂酶/脂肪酶MPlaG加载在补充有磷脂酰胆碱乳液[0.5％(w/v)磷脂酰胆碱、0.5％(w/v)牛磺胆酸、20mM氯化钙(CaCl2)]的固体培养基上，随后通过观察亮区来确认活性。使用展示极好脂肪酶活性的脂肪酶CALB(来自南极假丝酵母的脂肪酶B)和大肠杆菌BL21(DE3)(用于构建转化体的宿主细胞)的细胞裂解物作为比较组。

[0127] 结果，如图4所示，大肠杆菌BL21(DE3)的细胞裂解物未显示出在两种固体培养基上的活性。CALB仅在补充有辛酸甘油酯乳液的固体营养培养基上形成了亮区，而本发明的基因在两种固体培养基上都形成了亮区，表明本发明的基因不仅具有脂肪酶活性，而且具有磷脂酶活性(图4)。

[0128] 实施例6：来自潮滩宏基因组之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的特征

[0129] 基于脂肪酶活性研究了实施例5中纯化的磷脂酶/脂肪酶MPlaG随温度和pH的酶活性，对具有不同碳链长度之底物的特异性，以及磷脂酶/脂肪酶MPlaG与多种金属离子、抑制剂和有机溶剂的关系。

[0130] 特别地，通过下面的两种方法测量酶活性。第一种方法为pH-stat。将5ml的三甘油和495ml的阿拉伯胶悬液[20mM氯化钠(NaCl)、1mM氯化钙(CaCl2)、0.5％(w/v)阿拉伯胶]使用韦林搅切器(waring blendor)混合以制备乳液。将25ml制备的三甘油乳液加载在装备有控温装置的反应器中，向其加载10mM NaOH以调节pH为8。向所述乳液加上述纯化的磷脂酶/脂肪酶MPlaG酶溶液，随后在25℃下水解。在水解反应期间，通过pH滴定器(842T Titrando,Metrohm)测量NaOH的量。将1单位(U)的酶定义为能够产生1μmol脂肪酸的酶量。第二种方法为作为本发明之标准方法的分光光度测定。特别地，将磷脂酶/脂肪酶MPlaG酶溶液添加至反应溶液[20μl的10mM对硝基苯基酯底物、40μl的乙醇和940μl的50mM Tris-HCl(pH 8)]，随后反应5分钟。在OD405下测量从所述底物水解之对硝基酚(p-nitrophenol)的提高率。将1单位(U)的酶定义为能够通过水解产生1μmol对硝基酚的酶量。

[0131] <6-1>磷脂酶/脂肪酶MPlaG随温度和pH的特征

[0132] 为研究所述酶随pH的活性，在不同的pH缓冲液中测量活性。结果，在pH 8观察到最大活性。于不同pH下停留180分钟后，测量保留的活性。结果，酶活性在pH 5至10的范围内保持稳定(图5)。还研究了随温度的磷脂酶和脂肪酶活性。结果，在25℃下观察到最大活性。在5℃下仍观察到所述酶的活性(最大活性的39％)。当温度升高到上述最佳活性温度以上时，活性迅速下降(图6)。此外，通过使用差示扫描量热法(DSC)研究熔解温度。结果，熔解温度为38.5℃(图7)。上面的结果表明本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG为低温活化的碱性脂肪酶。

[0133] <6-2>磷脂酶/脂肪酶MPlaG对于多种磷脂的特异性

[0134] 为研究对多种磷脂的底物特异性，将经纯化的磷脂酶/脂肪酶MPlaG添加至分别补充有多种磷脂乳液的固体培养基。然后，通过比较亮区的尺寸研究对于磷脂的活性。所述磷脂乳液由0.5％(v/v)磷脂底物、0.5％(w/v)牛磺胆酸和20mM氯化钙(CaCl2)构成。本文使用的底物为磷脂酰胆碱(PC，99％纯度)、磷脂酰乙醇胺(PE，97％纯度)、磷脂酰丝氨酸(PS，97％纯度)、磷脂酰肌醇(PI，98％纯度)、磷脂酰甘油(PG，99％纯度)和磷脂酸(PA，98％纯度)。

[0135] 结果，如图8所示，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG显示出对于这些底物(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油)极好的活性，但是没有分解已知被分泌性磷脂酶A所降解的磷脂酰丝氨酸和磷脂酸(图8)。

[0136] <6-3>磷脂酶/脂肪酶MPlaG对于碳长度的特征

[0137] 通过使用pH滴定器(842Tirando,Metrohm)滴定游离脂肪酸测量MPlaG水解三酰基甘油酯、橄榄油和磷脂酰胆碱的活性。通过添加10mM NaOH溶液，将底物乳液的pH调节至8.0。然后，将合适量的酶溶液添加至其中。通过使用pH滴定器测量脂肪酸的排出率5分钟。
将1单位的脂肪酶活性定义为能够释放1μmol脂肪酸的酶量。为排除底物的非酶促水解值，对不同条件下的每个测量在不添加酶下测量所述活性，其将为对照反应。

[0138] 结果，MPlaG对于橄榄油和磷脂酰胆碱的特异性酶活性分别为2957±144和1735±-1147Umg 。MPlaG是磷脂酶家族的成员，但是显示出对于橄榄油的显著脂肪酶活性。

[0139] 为进一步研究对各自具有不同碳长度之底物的特异性，用三酰基甘油酯(例如丁酸甘油酯(C4)、辛酸甘油酯(C8)、癸酸甘油酯(C10)、月桂酸甘油酯(C12)、棕榈酸甘油酯(C16)和油酸甘油酯(C18:1))进行pH滴定。结果，观察到对于丁酸甘油酯(C4)最高的酶活性且当链延长，所述酶活性显著降低(图9A)。

[0140] 还在室温下进行分光光度测定以研究MPlaG对多个碳链长度之对硝基苯基酯(合成底物)的活性。在该实验中，使用对硝基苯基丁酸酯(C4)、对硝基苯基辛酸酯(C8)、对硝基苯基癸酸酯(C10)、对硝基苯基月桂酸酯(C12)、对硝基苯基棕榈酸酯(C16)和对硝基苯基硬脂酸酯(C18)作为底物用于活性的比较。特别地，使用分光光度检测(spectrophotometric detection)通过标准评价方法测量MPlaG对于对硝基苯基酯的活性。除非另有告知，使用对2+
硝基苯基癸酸酯(C10)作为底物。将5mM Ca 添加至反应溶液。在OD450下使用DU800分光光度计(spectrophotometer)(Beckman)持续测量反应产物对硝基酚5分钟。将1单位的对于对硝基苯基酯的活性定义为能够释放1μmol对硝基苯基酯的酶量。为排除底物的非酶促水解值，对不同条件下的每个测量在无酶下测量所述活性，其将为对照反应。

[0141] 结果，本发明的MPlaG显示对于对硝基苯基棕榈酸酯(C16)的最高活性(约112倍)以及对于对硝基苯基丁酸酯(C4)次高的活性(图9B)。

[0142] 研究了MPlaG对于磷脂位置和链长的特异性。为了这样做，使用有不同碳链长度(C6、C7、C8和C14)的磷脂酰胆碱以及1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)。将经纯化的MPlaG添加至含有5mM CaCl2和150mM NaCl的50mM tris缓冲液(pH 8.0)，随后在25℃下与1mM底物一起进行酶反应12小时。使用Finnigan LCQ通过液相色谱质谱法(LC-MS)分析反应产物。用电喷雾电离源(electrospray ionization source)装备Advantage Max离子阱质谱分光计(ion trap mass spectrometer)(Thermo Fisher Scientific)。用HILIC保护柱(4×2.0mm,Phenomenex)和Kinetex HILIC柱(2.6μm,2.1×100mm,Phenomenex)进行HPLC分离。流动相A为10mM甲酸铵，将其pH用甲酸调至3.0。流动相B为乙腈。如下以0.2ml/分钟的流量进行梯度洗脱(gradient elution)：0～10分钟，10％～40％A(线性梯度)；10～20分钟，70％A(等度)。柱温度为室温，且注射体积为10μL。在3次微扫描和200ms的最大离子注射时间下于阴离子模式(negative ion mode)100～1200中从m/z获得质谱。

[0143] 结果，在阴离子模式中质谱的特征为[M-H]-和[M-H+HCOOH]-。磷脂酰胆碱至溶血磷脂酰胆碱的水解活性对1,2-二辛酰基-磷脂酰胆碱(diC8PC)最高(图9C)。因此，确认MPlaG对具有长酰基直链的对硝基苯基酯、具有短酰基直链的甘油三酯以及具有中等长度酰基直链的磷脂有高偏好，表明其具有针对底物的链长度特异性。经纯化的酶显示出其对于不被酯酶所水解之油酸甘油酯(C18：1)的活性。随丁酸甘油酯浓度提高测量经纯化之酶的水解酶活性，且结果所述酶显示界面活性，表明MPlaG不是酯酶(图9A)。此外，使用1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)通过液相色谱质谱法(LC-MS)确定MPlaG的水解位点(图11)。特别地，在25℃下将MPlaG与OPPC(分子量：759)反应12小时，随后进行LC-MS。LC-MS的-
结果确认了MPlaG分解OPPC(m/z 804,[M-H+HCOOH] )以产生反应产物(m/z 540)。如果MPlaG在OPPC的sn-2位点消化棕榈酸，则反应产物将会在m/z 567观察到。然而，在m/z 540检测到对应于2-棕榈酰基-溶血磷脂酰胆碱的MS谱([M-h+COOH-C18:1]-)。因此，表明MPlaG可被鉴定为磷脂酶A1，所述磷脂酶A1能够加速磷脂之sn-1位点中酰基的水解。

[0144] 本发明的MPlaG分解不被酯酶降解的油酸甘油酯，并显示出随丁酸甘油酯浓度提高的界面活性，表明其不是磷酸酯酶/酯酶而是磷脂酶/脂肪酶。

[0145] <6-4>磷脂酶/脂肪酶MPlaG对于金属离子和抑制剂的作用

[0146] 如表2中所示，测量了不同浓度下对于多种金属离子和抑制剂的磷脂酶和脂肪酶活性。

[0147] 结果，如图7所示，活性被Ca2+提高了约10倍，而被EDTA强烈抑制。当添加2mM和5mM的钙离子时，本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG的熔解温度从38.5℃分别升高至47.2℃和49.2℃。因此，预期通过钙离子提高结构稳定性(图7)。

[0148] 【表2】

[0149]

[0150] <6-5>磷脂酶/脂肪酶MPlaG对于有机溶剂的酶活性

[0151] 为研究本发明之磷脂酶/脂肪酶MPlaG对于表3所示的二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、乙醇、甲醇、乙腈和丙酮的稳定性，在所述溶剂的不同浓度下测量磷脂酶/脂肪酶MPlaG的酶活性。

[0152] 结果，磷脂酶/脂肪酶MPlaG的酶活性几乎不被那些有机溶剂在高达60％(v/v)的浓度下抑制，表明该酶将在工业中的有机溶剂条件下完全可用。

[0153] 【表3】

[0154]

[0155] <6-6>磷脂酶/脂肪酶MPlaG之酶活性的比较

[0156] 通过pH-stat比较了本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG与CALB(来自南极假丝酵母的脂肪酶)和CRL(来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶)之间的比活性(specific activity)。

[0157] 结果，如表4所示，即使CALB表现出对合成底物丁酸甘油酯(C4)最高的酶活性，然而本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG显示出对于天然底物橄榄油最高的酶活性。仅有本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG显示出对于磷脂酶底物磷脂酰胆碱的酶活性。也就是说，与那些脂肪酶CALB和CRL不同，定量地证实了本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG具有磷脂酶活性。同时，考虑到在一篇研究文章(Biochimica et Biophysica Acta 1259(1995)9-17)中报道过来自类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)的脂肪酶显示出5.7U/mg的磷脂酶活性，且LecitaseTM(Novozyme)显示出6U/mg的磷脂酶活性，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG有代表性地显示出极好的脂肪酶活性和磷脂酶活性(表4)。

[0158] 此外，还使用合成底物研究了本发明之磷脂酶/脂肪酶MplaG与全长蛋白质的比活性。结果，本发明的磷脂酶/脂肪酶MPlaG表现出对于全长蛋白质至少两倍提高的比活性。

[0159] 【表4】

[0160]

[0161] a:未确定。