一种次血红素二肽及其制备方法和用途

摘要

本发明的一种次血红素二肽及其制备方法和用途，属于生物技术的领域，所述的次血红素二肽，是次血红素的羧基与二肽分子中丙氨酸残基上的氨基以酰胺键相连，其中二肽的链接方式依次为α‑Ala残基、His残基。制备采用次血红素二肽的固相合成方法。次血红素二肽的用途可以作为辣椒红色素稳定剂。本发明经过优选的次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂具有成本低、稳定性好、疏水性强、保护作用强等优点，具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种次血红素二肽，是次血红素的羧基与二肽分子中丙氨酸残基上的氨基以酰胺键相连，其特征在于，所述的二肽，连接方式依次为α-Ala残基、His残基。

2.根据权利要求1所述的次血红素二肽，其特征在于，具体结构式是：

3.一种权利要求1的次血红素二肽的制备方法，具体过程是次血红素二肽的固相合成：①树脂溶胀：称取Rink-NH2树脂，加入二氯甲烷溶胀2h，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤Rink-NH2树脂3次；二氯甲烷和二甲基甲酰胺用量按照每5mmol Rink-NH2树脂分别加入

100ml计算；

②保护:加入二氯甲烷2倍体积的20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液(v/v)，于室温震荡

30min，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤Rink-NH2树脂3次，用显色剂检测氨基脱保护情况，当树脂颗粒全部变为蓝色为脱保护完全；

③连接氨基酸：将Fmoc-α-Ala-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉和Rink-NH2树脂按摩尔比为2.5∶2.5∶2.5∶2.5∶1依次加入反应器中，加入与二氯甲烷等体积的二甲基甲酰胺室温震荡1h，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，用显色剂检测氨基酸连接情况，树脂颗粒全部变为黄色即反应完全；

④重复步骤②和用Fmoc-His(MMt)-OH替换Fmoc-α-Ala-OH重复步骤③；

⑤重复步骤②和用次血红素替换Fmoc-α-Ala-OH重复步骤③；

⑥切割和沉淀：加入二氯甲烷2倍体积的切割试剂，室温反应3h，将切割液旋转蒸发；将所得残留液在二氯甲烷5倍体积的乙醚中沉淀，离心，收集，得次血红素二肽粗品；所述的切割试剂，按体积计由96.0％三氟乙酸、2.0％三异丙基硅烷和2.0％超纯水组成；

⑦纯化：将粗品用反相C18制备柱纯化，流动相：0.1％三氟乙酸/25～85％乙腈/水梯度洗脱，接收主峰，旋转蒸发，冻干，得产物次血红素二肽纯品。

4.一种权利要求1的次血红素二肽的用途，作为辣椒红色素稳定剂。

5.根据权利要求4所述的次血红素二肽用途，其特征在于，次血红素二肽的添加量是次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.4～1.0∶100。

6.根据权利要求4或5所述的次血红素二肽的用途，其特征在于，次血红素二肽的添加量是次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.4～0.6∶100。

说明书

一种次血红素二肽及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术的领域，特别涉及一种作为辣椒红色素稳定剂的次血红素二肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 辣椒红色素(Capsicum red pigment)又名辣红素，是一种成熟红辣椒中的提取物，是类胡萝卜素类色素的一种，其主要的成分是辣椒红素(Capsanthin)和辣椒玉红素(Capsonrubin)，占总量50％～60％，如结构式Ⅰ。

[0003]

[0004] 辣椒红色素不仅色泽鲜艳、色阶高、着色力强、保色效果好、可以有效地延长食品的货架期，而且安全性高，对人体有益无害，已被联合国粮食组织(FAO)和世界卫生组织(WTO)列为A类色素，在使用中不加以限制。

[0005] 辣椒红色素目前作为着色剂已被广泛使用在食品添加剂、化妆品以及医药等领域的天然色素，随着其用途的进一步研究和开发，辣椒红色素必将有着更为广阔的应用前景。

[0006] 然而，由于辣椒红色素含有不饱和键，稳定性弱，会在运输、贮存以及使用当中易于遭到多种外界条件的影响而发生结构的改变，从而褪色，色价降低，应用性能下降。已知光照、温度和氧化等因素，均影响辣椒红色素的稳定性，尤其是光照，容易引起辣椒红色素结构的改变而变质，严重影响辣椒红色素的应用。

[0007] 已有研究显示，加入适量的维生素C等能够提高辣椒红色素的稳定性，但维生素C稳定性差，易失活，保护效果较差。

[0008] 近年来，三价铁卟啉-短肽化合物因具有较好的生物学活性而较受关注。如：中国专利CN02144902.3公开了三价铁卟啉及衍生物-短肽化合物及其合成方法。研究显示，这些血红素或次血红素与短肽相连构成的血红素-短肽化合物或次血红素-短肽化合物，由于短肽上氨基酸残基组成、构型和顺序的差异，其空间结构、亲水性、疏水性、及生物学活性也差异较大。

[0009] 中国专利CN200610131682.5报道了几种三价铁卟啉短肽化合物在抗冠心病药物制备中的用途，其中公开了一种次血红素二肽(Deuterohemin-β-Ala-His，DhHP-2)和几种次血红素-短肽化合物，然而，目前该类次血红素-短肽化合物在作为辣椒红色素稳定剂的用途，未见公开报道。

[0010] 本发明为了克服现有辣椒红色素稳定性方面的不足，提供一种优选的以次血红素和二肽相连构成的次血红素二肽化合物，以及其在作为辣椒红色素稳定剂的应用。

发明内容

[0011] 本发明要解决的技术问题，是克服现有技术的不足，提供一种特定的次血红素二肽(Deuterohemin-α-Ala-His，DhHP-2)，以及在作为辣椒红色素稳定剂的应用。

[0012] 本发明的次血红素二肽的技术方案如下：

[0013] 一种次血红素二肽，是次血红素(用Dh表示)的羧基与二肽分子中丙氨酸残基上的氨基以酰胺键相连，其特征在于，所述的二肽，链接方式依次为α-Ala残基、His残基；具体结构式(记为结构式Ⅱ)是：

[0014]

[0015] 即，本发明中所指的次血红素二肽是结构式Ⅱ中A和B两种结构化合物的混合物，也包括结构式Ⅱ中A和B两种结构化合物的任何一种；研究显示，结构式Ⅱ中A和B两种化合物生物学活性相同，没有差异。

[0016] 本发明次血红素二肽的分子式表示为Dh-α-Ala-His；将肽链中的二个氨基酸残基改变组成、或改变构型、或变换顺序、或分别用现有20种氨基酸中的任选2种氨基酸残基替换组合，可以得到多种与本发明的次血红素二肽相近的次血红素二肽类似物，如：类似物ⅠDh-β-Ala-His；类似物II Dh-His-α-Ala；类似物Ⅲ Dh-His-β-Ala；类似物IV Dh-α-Ala-Lys；类似物V Dh-β-Ala-Lys；类似物VI Dh-Thr-Lys；类似物VIII Dh-His-Lys等.[0017] 研究表明，次血红素二肽类似物活性较差，只有次血红素与α-丙氨酸、组氨酸以酰胺键结合，且结合顺序为Dh、α-Ala、His时，形成的次血红素二肽，相比Dh-β-Ala-His和其它次血红素二肽类似物，分子稳定性更强，尤其是作为辣椒红色素稳定剂，在光照、高温等影响因素下显示了更强的保护作用，能够显著阻止辣椒红色素色价的降低，与其它次血红素-短肽相比具有突出的优点和特征。

[0018] 本发明所说的次血红素二肽是通过固相合成方法制得，固相合成法与传统的液相合成方法相比具有操作简单、收率高、纯度高、成本低等优点；进一步来说，本发明次血红素二肽是通过Fmoc固相合成方法制得，该方法与Boc固相肽合成方法相比，反应可控、污染小、收率更高、纯度更高。

[0019] 本发明的次血红素二肽制备方法的技术方案如下。

[0020] 一种次血红素二肽的制备方法，具体过程是次血红素二肽的固相合成：

[0021] ①树脂溶胀：称取Rink-NH2树脂，加入二氯甲烷溶胀2h，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤Rink-NH2树脂3次；二氯甲烷和二甲基甲酰胺用量按照每5mmol Rink-NH2树脂分别加入100ml计算；

[0022] ②保护:加入二氯甲烷2倍体积的20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液(v/v)，于室温震荡30min，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤Rink-NH2树脂3次，用显色剂检测氨基脱保护情况，当树脂颗粒全部变为蓝色为脱保护完全；

[0023] ③连接氨基酸：将Fmoc-α-Ala-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉和Rink-NH2树脂按摩尔比为2.5∶2.5∶2.5∶2.5∶1依次加入反应器中，加入与二氯甲烷等体积的二甲基甲酰胺室温震荡1h，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，用显色剂检测氨基酸连接情况，树脂颗粒全部变为黄色即反应完全；

[0024] ④重复步骤②和用Fmoc-His(MMt)-OH替换Fmoc-α-Ala-OH重复步骤③；

[0025] ⑤重复步骤②和用次血红素替换Fmoc-α-Ala-OH重复步骤③；

[0026] ⑥切割和沉淀：加入二氯甲烷2倍体积的切割试剂，室温反应3h，将切割液旋转蒸发；将所得残留液在二氯甲烷5倍体积的乙醚中沉淀，离心，收集，得次血红素二肽粗品；所述的切割试剂，按体积计由96.0％三氟乙酸、2.0％三异丙基硅烷和2.0％超纯水组成；

[0027] ⑦纯化：将粗品用反相C18制备柱纯化，流动相：0.1％三氟乙酸/25～85％乙腈/水梯度洗脱，接收主峰，旋转蒸发，冻干，得产物次血红素二肽纯品。

[0028] 上述的Rink-NH2树脂为市售商品。

[0029] 本发明的次血红素二肽的用途的技术方案如下：

[0030] 一种次血红素二肽的用途，作为辣椒红色素稳定剂。

[0031] 次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂时，次血红素二肽的添加量是：次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.4～1.0∶100；更优选的次血红素二肽的添加量是：次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.4～0.6∶100。

[0032] 本发明在次血红素-短肽中优选了次血红素二肽，在次血红素二肽中的氨基酸残基优选了Ala残基、His残基；Ala残基中优选了α-构型；在二肽段中又优选了次血红素、Ala残基、His残基的特定顺序，使本发明的肽次血红素二肽与现有次血红素-短肽化合物比较，具有分子量小、稳定性更好、疏水性强、保护作用强等优点，具有较好的应用前景。因此，本发明一种次血红素二肽及其制备方法和作为辣椒红色素稳定剂的用途是十分必要和有效的。

附图说明

[0033] 图1是实施例1制得的次血红素二肽(DhHP-2)的质谱图。

具体实施方式

[0034] 下面结合实施例，对本发明中次血红素二肽做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。

[0035] 实施例1次血红素二肽的固相合成

[0036] ①树脂溶胀：称取5mmol Rink-NH2树脂，加入100ml二氯甲烷溶胀2h，抽滤，用100ml DMF(二甲基甲酰胺)洗涤树脂3次；

[0037] ②脱保护:加入200ml 20％哌啶/DMF溶液，于室温震荡30min，抽滤，用DMF洗涤树脂3次，用显色剂检测氨基脱保护情况，当树脂颗粒全部变为蓝色为脱保护完全；

[0038] ③连接氨基酸：将Fmoc-α-Ala-OH、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、NMM(N-甲基吗啉)和Rink-NH2树脂按摩尔比为2.5:2.5:2.5:2.5:1依次加入反应器中，加入100ml二甲基甲酰胺室温震荡1h，抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，用显色剂检测氨基酸连接情况，树脂颗粒全部变为黄色即反应完全；

[0039] ④重复步骤②和③，用Fmoc-His(MMt)-OH替换Fmoc-α-Ala-OH；

[0040] ⑤连接血红素：重复步骤②和③，用次血红素替换Fmoc-α-Ala-OH；

[0041] ⑥切割和沉淀：加入200ml切割试剂(96.0％三氟乙酸、2.0％三异丙基硅烷和2.0％超纯水)，室温反应3h，将切割液旋转蒸发；将所得残留液加入500ml乙醚中沉淀，离心，收集，得次血红素二肽粗品4.0克；

[0042] ⑦纯化：将粗肽用反相C18制备柱纯化，流动相：0.1％三氟乙酸/25～85％乙腈/水梯度洗脱，接收主峰，旋转蒸发，冻干，得产物次血红素二肽纯品3.3克。

[0043] 将实施例1制得的次血红素二肽经质谱检测，理论值为771.3(C39H41FeN9O5)，实际测定结果为771.3[M+H+]，与理论一致，证实合成得到的是目标产物次血红素二肽，质谱图见说明书附图中图1。

[0044] 实施例2维生素C、次血红素二肽、次血红素二肽类似物及其它次血红素-短肽化合物在光照条件下对提高辣椒红色素稳定性的保护作用比较

[0045] 按照表1取25μL浓度为50μg/mL的维生素C/丙酮溶液、次血红素二肽/丙酮溶液、次血红素二肽类似物/丙酮溶液及次血红素-短肽化合物/丙酮溶液，加入5.0mL浓度为50μg/mL的辣椒红素/丙酮溶液(质量比为1:100)，混匀，于光照条件下放置5天，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表1。

[0046] 辣椒红色素的色价 按照国家标准GB10783-2008[14]采用紫外分光光度法测量。 表示被测试样为0.5％，1cm比色皿在460nm处的吸光度。

[0047]

[0048] 表1：次血红素二肽与维生素C、次血红素二肽类似物及其它次血红素-短肽化合物对辣椒红色素保护作用的比较

[0049]

[0050] 溶液颜色越深，溶液色价越高、溶液色价残留率越高。表1可见，本发明的次血红素二肽与维生素C、次血红素二肽类似物、以往报道的次血红素-短肽化合物相比，溶液的稳定性更高，对辣椒红色素的保护作用更强。

[0051] 实施例3维生素C、次血红素二肽、次血红素二肽类似物及其它次血红素-短肽化合物在高温条件下对提高辣椒红色素稳定性的保护作用比较

[0052] 按照表1取25μL浓度为50μg/mL的维生素C/丙酮溶液、次血红素二肽/丙酮溶液、次血红素二肽类似物/丙酮溶液及次血红素-短肽化合物/丙酮溶液，加入5.0mL浓度为50μg/mL的辣椒红素/丙酮溶液(质量比为1:100)，混匀，于60℃条件下放置5天，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表2

[0053] 表2：次血红素二肽与维生素C、次血红素二肽类似物及其它次血红素-短肽化合物对辣椒红色素保护作用的比较

[0054]次血红素-短肽 色价残留率(％) 颜色
空白 17.8 淡黄色
维生素C 41.5 橙黄色
Dh-α-Ala-His 74.3 橙红色
Dh-α-Ala 15.7 淡黄色
Dh-β-Ala 16.5 淡黄色
Dh-His 16.9 淡黄色
Dh-His-α-Ala 28.5 淡黄色
Dh-His-β-Ala 21.8 淡黄色
Dh-α-Ala-Lys 7.8 淡黄色
Dh-β-Ala-Lys 19.7 淡黄色
Dh-Thr-Lys 17.2 淡黄色
Dh-His-Lys 18.4 淡黄色
Dh-α-Ala-His-Lys 37.2 橙黄色
Dh-β-Ala-His-Lys 35.9 淡黄色
D1:Dh-β-Ala-His 39.2 橙黄色
D2:Dh-β-Ala-His-Ala-Arg 15.9 淡黄色
D3:Dh-β-Ala-His-Ala-Lys 26.7 淡黄色
D4:Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys(DhHP-6) 23.5 淡黄色
D5:Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala 24.7 淡黄色
D6:Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala 18.6 淡黄色
D7:Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala 17.1 淡黄色
D8:Dh-β-Ala-Arg-Ala-Arg-Ala 19.2 淡黄色
D9:Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg 18.7 淡黄色D10:Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arg-Pro-Arg-Arg 16.5 淡黄色[0055] 溶液颜色越深，溶液色价越高、溶液色价残留率越高。表Ⅱ可见，本发明的次血红素二肽与维生素C、次血红素二肽类似物、以往报道的次血红素-短肽化合物相比，溶液在高温条件下稳定性更高，对辣椒红色素的保护作用更强。

[0056] 实施例4次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂的最适添加量

[0057] 取5.0mL浓度为50μg/mL的辣椒红色素/丙酮溶液，按照次血红素二肽与辣椒红色素的质量比分别为0.1:100、0.2:100、0.3:100、0.4:100、0.5:100、0.6:100、0.7:100、0.8:100、0.9:100、1:100、1.1:100、1.2:100的比例依次加入浓度为50μg/mL的次血红素二肽化合物/丙酮溶液，混匀，于光照条件下放置5天，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表3。

[0058] 表3：次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂的最适添加量

[0059]质量比(次血红素二肽/辣椒红色素) 色价残留率(％) 颜色
空白 5.2 无色
维生素C 35.2 橙黄色
0.1:100 21.5 淡黄色
0.2:100 31.6 橙黄色
0.3:100 39.3 橙黄色
0.4:100 67.6 橙红色
0.5:100 69.8 橙红色
0.6:100 72.2 橙红色
0.7:100 71.4 橙红色
0.8:100 70.8 橙红色
0.9:100 70.4 橙红色
1.0:100 70.1 橙红色

[0060] 由表3可见，本发明的次血红素二肽添加量是次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.1:100～0.3:100时，次血红素二肽相比维生素C对于辣椒红色素的色价残留率提高不够显著；次血红素二肽与辣椒红色素质量比为0.4:100～0.6:100，次血红素二肽能够显著提高辣椒红色素的稳定性，且呈明显的剂量依赖关系；次血红素二肽与辣椒红色素的质量比为0.7:100～1.0:100时，次血红素二肽能够显著提高辣椒红色素的稳定性，但色价残留率不再显著上升，且有所下降。可见，次血红素二肽与辣椒红色素的质量比为0.4:100～0.6:100，是次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂有效的最适添加量。

[0061] 实施例5

[0062] 取5份100.0克辣椒红色素，依次为空白、加入0.5克维生素C、加入0.4克次血红素二肽、0.5克次血红素二肽、0.6克次血红素二肽，充分震荡混匀，于光照条件下放置5天，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表4。

[0063] 表4：次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂的应用

[0064]辣椒红色素样品 色价残留率(％)
空白 45.8
0.5克维生素C 68.5
0.4克次血红素二肽 91.1
0.5克次血红素二肽 91.6
0.6克次血红素二肽 92.2

[0065] 实施例6

[0066] 取5份100.0克辣椒红色素，依次为空白、加入0.5克维生素C、加入0.4克次血红素二肽、0.5克次血红素二肽、0.6克次血红素二肽，充分震荡混匀，于60℃条件下放置5天，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表5。

[0067] 表5：次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂的应用

[0068]辣椒红色素样品 色价残留率(％)
空白 58.3
0.5克维生素C 76.3
0.4克次血红素二肽 91.5
0.5克次血红素二肽 92.4
0.6克次血红素二肽 93.1

[0069] 实施例7

[0070] 取5份1.0公斤辣椒红色素，依次为空白、加入5克维生素C、加入4.0克次血红素二肽、5.0克次血红素二肽、6.0克次血红素二肽，充分震荡混匀，于阴凉、干燥、避光条件下室温放置2年，测定各溶液色价，并计算各溶液色价残留率，各溶液色价残留率见表6。

[0071] 表6：次血红素二肽作为辣椒红色素稳定剂的应用

[0072]辣椒红色素样品 色价残留率(％)
空白 58.3
0.5克维生素C 76.3
0.4克次血红素二肽 93.6
0.5克次血红素二肽 93.9
0.6克次血红素二肽 94.3