本发明涉及一种联合检测基因突变的方法，以20－50ng DNA为样本，同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变。本发明的方法包括：设计特异性探针、建立MLPA扩增突变基因序列的反应体系、通过PCR反应大量扩增目的基因序列。本发明特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号；选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突变型。
1.一种基因联合检测试剂盒，其特征在于，包含34条引物和探针，这34条引物和探针分别是：P_KRAS1_L：P-SEQ-1：gagtacgctagatgttggatttggcatataactcagtacgaacttgtggtagttggagctaP_KRAS1_R：P-SEQ-2：gtggcgtaggcaagagtgcgcctactacgatgctgaattctctagattgcttcgagctggctcP_KRAS2_L：P-SEQ-3：gagtctcgtgaccgttggagtacagagtatacccttgtggtagttggagctgtP_KRAS2_R：P-SEQ-4：tggcgtaggcaagagtgcgtagtccaagcatctagattggatgactctggcaaP_KRAS3_L：P-SEQ-5：ggagactatacaggttggataatcgctctttagtccgctgatatatagccttgtggtagttggagctggtgaP_KRAS3_R：P-SEQ-6：cgtaggcaagagtgcgttgaattgaactcataatctcattgagtttctagattggatcatcctgaaacP_KRAS4_L：P-SEQ-7：gagctctatagacgttggatcattggtacggatatcaacttgtggtagttggagctcP_KRAS4_R：P-SEQ-8：gtggcgtaggcaagagtgcgtcatctttgtatttctagattggatccagcttggacP_KRAS5_L：P-SEQ-9：gagctcaatgagtgttggatgatatgtcagctgccaaggaatgtgataaacttgtggtagttggagcttP_KRAS5_R：P-SEQ-10：tggcgtaggcaagagtgcgttacctagagtgaatcatctagattggatcttgccaggtcP_KRAS6_L：P-SEQ-11：gagatacttgagagctggataacgatgagtgcataagaacttgtggtagttggagctgaP_KRAS6_R：P-SEQ-12：tggcgtaggcaagagtgcgttacctagagtgaatcatctagattagatgatgagtgctcP_KRAS7_L：P-SEQ-13：gagttgactactagtttaataccatctagtaggctatcataatgctaagcttacacttgtggtagttggagctgcP_KRAS7_R：P-SEQ-14：
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2.如权利要求1所述的一种基因联合检测试剂盒，包括以下操作步骤：
模板变性：将模板DNA加入PCR管中，置于PCR仪上，设置温度为95～100℃，维持3～
杂交：在变性后的模板中加入MLPA Buffer和探针的混合物，其中探针的浓度为0.5～
10nM；MLPA Buffer中含有Tris-HCl，浓度为50～500mM，pH8.2～9.0；KCl，浓度为2～5M；
MgCl2，浓度为0.5～5M；EDTA，浓度为0.5～5mM；在PCR仪上运行杂交程序：95℃1min；60℃16～24h；
连接：杂交反应结束后，在每个PCR管中加入超纯水和连接酶，在PCR仪上运行连接程序：50～58℃10～30min；95～100℃10～30min；冷却至20℃；
PCR扩增：连接反应结束后进行PCR扩增，在每个PCR管中加入PCR通用引物、dNTPs和Taq酶，在PCR仪上运行PCR程序；
检测：可以采用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳及毛细管电泳检测扩增的核酸片段。
3.如权利要求1所述的一种基因联合检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片、唾液、痰液、尿液和血液。
一种基因联合检测方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种联合检测基因突变的方法，特别涉及一种以MLPA法为技术平台，同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的方法。
背景技术
[0002] RAS基因包括KRAS、HRAS和NRAS三种，与肺癌相关的主要是KRAS基因，位于12号染色体上，编码P21蛋白，通过接受和传递细胞外生长刺激信号影响细胞内核酶等大生物分子合成，进而对细胞的生长和分化进行调控。当KRAS基因外显子2、3号发生突变时，突变的KRAS基因可以持续激活RAF-MEK-ERK-MAPK信号传导通路，导致细胞恶性增殖、分化及调控紊乱。在白血病、肺癌、大肠癌和胰腺癌等肿瘤中均发现了KRAS基因有较高的突变率。
[0003] 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是一个重要的信号传导通路分子，由一个催化亚基p110和一个调节亚基p85构成。根据PI3K的p110结构特点和底物分子不同可将其分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3个亚型。PI3K介导的信号转导通路在细胞的增殖、转化、凋亡和肿瘤的发生中起重要作用，调节肿瘤细胞的增殖和存活。研究发现，PI3K-AKT信号通路失调可导致肺癌、卵巢癌、乳癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌和鼻咽癌等恶性肿瘤的发生。
[0004] BRAF是人类最重要的原癌基因之一，大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝大部分突变发生在BRAF蛋白激酶激活区或其附近，其中约70％～90％是BRAF基因外显子15的第1799位核苷酸T突变为A，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(即BRAF V600E突变)。BRAF基因位于7号染色体，是细胞促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的丝氨酸/苏氨酸激酶，一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，从而使其介导的信号通路失调并最终导致细胞转化甚至恶变。
[0005] 表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶受体(RTK)，位于第7号染色体，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸，其糖蛋白分子量约170kDa。EGFR是I型酪氨酸激酶受体基因家族成员之一，是传递细胞外信号到细胞核内的重要途径蛋白。EGFR的主要信号转导途径有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PI3K-PDK通路、PLC-γ通路、JAK-STAT通路等。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中外显子19的缺失突变(delE746-A750)和外显子
21上的替代突变(L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90％。此外发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，在分子检测中同样具有重要的参考价值。
[0006] 多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是由Schouten等首先报道的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的多重检测技术。在MLPA反应中，扩增每个靶序列都需要一对探针，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。这一对探针与靶序列进行杂交后，再用连接酶连接成为一条寡核苷酸链。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，也会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp之间。MLPA技术可用于多重检测，通过合理的探针设计，在一次反应中可以同时检测多个靶序列。在采用毛细管电泳对扩增产物进行分离、分析的情况下，同时检测的靶序列可达到45个。多重检测方法有利于提高检测效率，减少模板的使用量，尤其适用于模板量少且待测靶点较多的情况。如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
[0007] 在制定临床治疗方案之前，应用分子诊断技术准确地检测病人肿瘤细胞中各基因突变状态，从而选择合适的靶向治疗药物，是应用靶向药物对癌症实行个性化治疗的前提和基础，同时亦可为临床评判病人的预后提供帮助。目前专门针对EGFR、PIK3CA、BRAF的靶向药物已进入临床使用，而针对KRAS的靶向药物亦在研发中。在肺癌病人中，KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因最常见的突变形式有16种，若使用荧光定量PCR的方法进行检测，则需要大量的临床样本，不但增加了临床取样的难度，也使病人支付更高的检测费用。为了降低临床样本的使用量，简化检测操作，本发明提供了一种基于MLPA技术，高效、高灵敏度的检测方法，可在20－50ng的DNA样本中同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因共16种突变，为临床个体化用药提供依据。
发明内容
[0008] 为了提高临床检验能力，现提供一种基于MLPA技术、可同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的方法，该方法可在20－50ng的DNA样本中同时检测出16种突变。
[0009] 本发明的技术方案包含以下步骤：
[0010] 1.检测基因突变位点
[0011] 根据人类KRAS基因2号、3号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序列，设计出多对特异性探针，检测以下位点的突变情况：
[0012]
[0013] 根据人类PIK3CA基因9号、20号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序列，设计出多对特异性探针，检测以下位点的突变情况：
[0014]
[0015] 根据人类BRAF基因15号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序列，设计出特异性探针，检测BRAF V600E突变。即15号外显子的第1799位核苷酸T突变为A，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(Cosmic ID 476)。
[0016] 根据人类EGFR基因19号、20号和21号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序列，设计出特异性探针，检测19号外显子的缺失突变、21号外显子上的替代突变L858R(Cosmic ID 6224，c.2573T>G)和20号外显子上的替代突变T790M(Cosmic ID 6240，c.2369C>T)。
[0017] 2.探针设计方法
[0018] 需要一对探针对靶序列进行检测，探针的结构中包含了与靶序列严格互补的互补区、调节探针长度的填充区、作为PCR引物的引物区。PCR引物区的引物序列可以为通用引物或特异性引物。探针中可不包含突变或包含突变，突变碱基在探针中的位置可位于最后一个(当互补区位于探针的3’端时)或第一个(当互补区位于探针的5’端时)。一对探针经过连接酶连接之后，长度位于100～250nt之间。
[0019] 3.19号外显子缺失突变检测方法
[0020] 在EGFR基因19号外显子易发生缺失的区域c.2230_2270设计探针对A，当区域c.2230_2270发生缺失时无法扩增出条带A；在EGFR基因保守序列上设计探针对B。当样本DNA中不包含EGFR 19号外显子c.2230_2270区域的缺失时，可扩增出一定比例的A、B两种条带。当样本DNA中含有EGFR 19号外显子c.2230_2270区域的缺失时，A条带和B条带的比例发生变化，从而判定EGFR基因19号外显子发生了缺失突变。
[0021] 4.建立MLPA扩增突变基因序列的反应体系，通过PCR反应大量扩增目的基因序列。MLPA反应体系由以下反应组成：
[0022] 模板变性：将模板DNA加入PCR管中，置于PCR仪上，设置温度为95～100℃，维持3～10min，再冷却至25℃。
[0023] 杂交：在变性后的模板中加入MLPA Buffer和探针的混合物。其中探针的浓度为0.5～10nM；MLPA Buffer中含有Tris-HCl(50～500mM，pH8.2～9.0)，KCl(2～5M)，MgCl2(0.5～5M)，EDTA(0.5～5mM)。在PCR仪上运行杂交程序：95℃1min；60℃16～24h。
[0024] 连接：杂交反应结束后，在每个PCR管中加入超纯水和连接酶，在PCR仪上运行连接程序：50～58℃10～30min；95～100℃10～30min；冷却至20℃。
[0025] PCR扩增：连接反应结束后进行PCR扩增。在每个PCR管中加入PCR通用引物、dNTPs和Taq酶，在PCR仪上运行PCR程序：
[0026]
[0027] 检测：可以采用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳及毛细管电泳等方法检测扩增的核酸片段。
[0028] 本发明提供一种用于检测同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的试剂盒，试剂盒中的特异性探针见表1。
[0029] 表1：特异性探针序列表
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 所述的基于MLPA技术、同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的方法不包括样品DNA提取步骤，但对于从甲醛固定石蜡包埋的样品获得的DNA片段依然具有与从新鲜组织样品中提取的DNA同样的扩增和检测能力。
[0034] 与现有的检测方法相比，本发明具有以下优势：
[0035] (1)同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变；
[0036] (2)特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号；
[0037] (3)选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突变型；
[0038] (4)样品用量低，以20－50ng DNA为样本即可同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变。
附图说明
[0039] 图1：实施例1聚丙烯酰胺凝胶电泳图
[0040] 图2：实施例2聚丙烯酰胺凝胶电泳图
[0041] 图3：实施例3聚丙烯酰胺凝胶电泳图
具体实施方式
[0042] 下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
[0043] 实施例1
[0044] 各取表2中的DNA 2μL于PCR管中作为模板，置于PCR仪上，设置温度为95℃，维持5min，再冷却至25℃。在变性后的模板中加入1.5μL MLPA Buffer和1.5μL Probemix(Probemix中含有表1中的34条探针)，在PCR仪上运行杂交程序：95℃ 1min；60℃ 16h。杂交反应结束后，在每个PCR管中加入15μL超纯水和0.1μL连接酶，在PCR仪上运行连接程序：54℃ 20min；95℃ 10min；冷却至20℃。连接反应结束后进行PCR扩增。在每个PCR管中加入1.0μLPCR通用引物、1.0μL dNTPs和0.5μL Taq酶，在PCR仪上运行PCR程序：
[0045]
[0046] 通过聚丙烯酰胺电泳检测扩增的核酸片段，见图1。每个突变点均被准确检测出来，PCR扩增的核苷酸片段长度与探针的长度相一致。
[0047] 表2：实施例1模板DNA
[0048]
[0049] 实施例2
[0050] 各取表3中的DNA 2μL于PCR管中作为模板，其余检验操作同实施例1，通过聚丙烯酰胺电泳检测扩增的核酸片段，见图2。以健康人血液中提取的DNA作为样本时，PCR扩增出长度为186bp和194bp的两条条带；而以E746-A750缺失的HCC827细胞基因组DNA为样本时，只扩增出长度为194bp的一条条带。
[0051] 表3：实施例2模板DNA
[0052]
[0053] 实施例3
[0054] 各取表4中的DNA 2μL于PCR管中作为模板，其余检验操作同实施例1，通过聚丙烯酰胺电泳检测扩增的核酸片段，见图3。当样本中同时存在多种基因突变时，本检验方法能够同时将突变的基因检测出来。
[0055] 表4：实施例3模板DNA
[0056]
[0057] 实施例4
[0058] 收集临床诊断为肺癌的57例患者的肿瘤组织(包括新鲜组织和石蜡切片)，使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒及石蜡包埋DNA提取试剂盒提取出基因组DNA作为模板。其余检验操作同实施例1，通过毛细管电泳检测扩增的核酸片段。57例样品中检测出的基因突变情况见表5。
[0059] 表5：肺癌患者肿瘤组织DNA基因突变检测结果
[0060]
[0061] 另外将实施例4中的样品进行测序验证，测序结果与本实施例的检测结果完全一致。
