一种嫩芽金花茶的组培快繁方法

摘要

本发明公开一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）外植体的消毒；（2）愈伤组织培养；（3）愈伤组织分化芽；（4）芽生根。本发明提供一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地。

权利要求

1.一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：采摘5～7月份的金花茶叶，使用20～40％乐果乳剂稀释400～600倍液浸泡5～10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再用3％的次氯酸进行消毒5～10min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长15～18cm，宽10～

15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29～31℃下暗培养8～15天，而后转入26～28℃下进行8～15天的暗培养，获得金花茶愈伤组织；

(3)愈伤组织分化芽：将获得的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6-苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0～6.5，于25～28℃条件下，光暗培养30～45天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.4mg/L的温度为22～25℃的清水在后续5～10天内添加入培养皿中；

(5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5～6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.8～2.5mg/L吲哚乙酸+0.5～1.5mg/L萘乙酸+0.8～1.5mg/L活性炭+0.8～1.5mg/L的硫酸亚铁，于25～28℃条件下，光暗培养20～

30天，培养出幼苗，组培结束，

所述愈伤组织培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6-苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5～7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121～130℃、1.1～1.5kg/cm2条件下进行灭菌30～50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。

2.根据权利要求1所述的嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，每个培养皿放入3～5片的叶条片。

3.根据权利要求1所述的嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，所述培养皿的规格为90×15mm；装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3～1/2。

4.根据权利要求1所述的嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)中的光暗培养周期为光培养20～22h，暗培养2～4h。

5.根据权利要求1所述的嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中光培养的光照强度为1500～1700勒克斯，步骤(5)中光培养的光照强度为2000～3000勒克斯。

6.根据权利要求1所述的嫩芽金花茶的组培快繁方法，其特征在于，所述金花茶叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；金花茶叶的采摘时间为晚上1～2点。

说明书

一种嫩芽金花茶的组培快繁方法

技术领域

[0001] 本发明属于组织培养生产技术领域，本发明涉及一种嫩芽金花茶的组培快繁方法。

背景技术

[0002] 金花茶属于山茶科、山茶属，与茶、山茶、南山茶、油茶、茶梅等为孪生姐妹。金花茶的花金黄色，耀眼夺目，仿佛涂着一层蜡，晶莹而油润，似有半透明之感。金花茶单生于叶腋，花开时，有杯状的、壶状的或碗状的，娇艳多姿，秀丽雅致。以前，人们没有见到过花色金黄的种类。1960年，中国科学工作者首次在广西南宁一带发现了一种金黄色的山茶花，被命名为金花茶。国外称之为神奇的东方魔茶，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”。

[0003] 金花茶是一种古老的植物，极为罕见，分布极其狭窄，全世界90％的野生金花茶仅分布于中国广西防城港市十万大山的兰山支脉一带，生长于海拔700米以下，以海拔200～500米之间的范围较常见，垂直分布的下限为海拔20米左右。如金花茶在防城县大王江附近的滨海丘陵台地仍有分布。垂直分布的上限可达海拔890米，如宁明县那陶大山仍可见到个别小瓣金花茶，数量极少，是世界上稀有的珍贵植物。金花茶喜温暖湿润气候，喜欢排水良好的酸性土壤，苗期喜荫蔽，进入花期后，颇喜透射阳光。对土壤要求不严，微酸性至中性均土壤中可生长。耐瘠薄，也喜肥，耐涝力强。

[0004] 据中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广西壮族自治区疾病预防控制中心、广西壮族自治区卫生监督检验中心、北京疾病预防控制中心中心营养与食品安全所、广西壮族自治区分析测试研究中心、广西中医学院、广西农学院实验中心等权威机构检验表明：金花茶属无毒级、含有400多种营养物质、无毒副作用。富含茶多糖、茶多酚、总皂甙、总黄酮、茶色素、咖啡因、蛋白质、维生素B1、B2、维生素C、维生素E、叶酸、脂肪酸、B-胡萝卜素等多种天然营养成份；金花茶含有茶氨酸、苏氨酸等几十种氨基酸，以及富含有多种对人体具有重要保健作用的天然有机锗(Ge)、硒(Se)、钼(Mo)、锌(Zn)、钒(V)等微量元素，和钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)等宏量元素。自2009年成功举办首届金花茶节以来，金花茶节成为了防城港市主打的四大文化节庆品牌之一。金花茶产业也得到了迅速发展，涌现出桂人堂金花茶、中港高科国宝金花茶、百喜金花茶等一批龙头企业，金花茶系列产品分获广西名牌产品、广西著名商标，产品畅销国内外市场，年产值超过12亿元。

[0005] 由此可见金花茶深受大众的喜爱，提高金花茶的产量就要对金花茶进行后代繁殖，为了满足这一需求，本发明提供一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，能够快速的对金花茶进行组织培养繁殖，且出苗率较高。

发明内容

[0006] 本发明针对上述存在的问题，提供一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地。

[0007] 本发明的方案是通过这样实现的：

[0008] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0009] 外植体的消毒：采摘6～7月份的金花茶叶，使用20～40％乐果乳剂稀释400～600倍液浸泡5～10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒5～10min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；使用乐果乳剂对刚采摘的金花茶叶进行消毒，能将金花茶叶上的害虫爬行过后残留下的有害液体去除，然后使用维生素C浸泡再用次氯酸消毒不仅能有效延缓外植体褐化时间和保持外植体活力，而且能将金花茶叶上的细菌杀死，再使用无菌水冲洗，确保金花茶叶上其他液体无残留，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水，以防将金花茶叶放入愈伤组织培养基中对培养基有稀释作用。

[0010] (2)愈伤组织培养：愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长15～18cm，宽10～15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29～31℃下暗培养8～15天，而后转入26～28℃下进行8～15天的暗培养，获得金花茶愈伤组织；采用光暗培养的方式，暗培养的时间原大于光培养，可以避免金花茶叶修复期间过多的光照使其进行光合作用生成糖类，失去金花茶叶体内的一部分物质和能量，使得完成修复过程的物质和能量的总量减少，造成形成愈伤组织的时间变慢。

[0011] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6～苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0～6.5，于25～28℃条件下，光暗培养30～45天后愈伤组织分化出芽；添加6～苄基嘌呤在培养基中具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。

[0012] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.4mg/L的温度为22～25℃清水在后续5～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0013] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5～6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.8～2.5mg/L吲哚乙酸+0.5～1.5mg/L萘乙酸+0.8～1.5mg/L活性炭+0.8～1.5mg/L的硫酸亚铁，于25～28℃条件下，光暗培养20～30天，培养出幼苗，组培结束。采用萘乙酸为培养基其中之一的添加物质能够促进细胞分裂和扩大，可诱导生根；而抗褐化剂活性炭+0.8～1.5mg/L的硫酸亚铁可降低组培过程中外植体、原球茎和丛生芽产生褐化，目前已达到外植体初诱导、原球茎继代增殖褐化率控制在15％以下，丛生芽生根诱导褐化率低于5％以下。

[0014] 本发明中，作为进一步说明，所述每个培养皿放入3～5片的叶条片。适当放入叶条片能保证每条叶条片能充分的吸收足量的养分，防止养分不足造成培养失败，即提高繁殖率。

[0015] 本发明中，作为进一步说明，所述愈伤组织培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6～苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5～
7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121～130℃、1.1～1.5kg/cm2条件下进行灭菌30～
50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。

[0016] 本发明中，作为进一步说明，所述培养皿的规格为90×15mm；所述装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3～1/2。采用直接倾倒的方法，相比使用量筒量取定量的培养基，具有快速，简便的优点。

[0017] 本发明中，作为进一步说明，所述步骤(3)和步骤(5)中的光暗培养周期为光培养20～22h，暗培养2～4h。在愈伤组织发芽和生根期间，需要吸收足够的光源来形成叶绿素继而能通过吸收光源来完成光合作用，光合作用能够合成能源，补充生长所需的能量。

[0018] 本发明中，作为进一步说明，所述步骤(3)中光培养的光照强度为1500～1700勒克斯，步骤(5)中光培养的光照强度为2000～3000勒克斯。愈伤组织培养时采用弱光的光培养，提高了金花茶组培的增殖倍数，缩短周期培养的时间，且采用较弱光的光培养能够减少日光灯补光时产生的电耗和产生的热量，减少降温所需的费用，因此采用此方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展。芽生根培养加强了光照的强度，顺应金花茶的生活习性，促进其快速生根发芽。

[0019] 本发明中，作为进一步说明，所述金花茶叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；金花茶叶的采摘时间为晚上1～2点。在深夜对金花茶叶进行采摘，深夜的金花茶叶已经停止进行光合作用，但是还是进行呼吸作用，消耗了体内的淀粉，为金花茶叶进行愈伤组织培养提供良好的条件，减少形成愈伤组织的时间。与现有技术中先采摘叶片后进行暗培养一段时间后再进行愈伤组织培养的工序更加简单。

[0020] 本发明的突出的实质性特点和显著进步是：

[0021] 1.本发明利用深夜的金花茶叶进行组培，为金花茶叶进行愈伤组织培养提供良好的条件，能够快速使金花茶叶形成金花茶叶愈伤组织，进而减少了组培的时间。

[0022] 2.本发明形成金花茶叶愈伤组织后发芽、生根都进行光暗培养，并通过生芽前培育，可以增加嫩芽生长效果。不仅仅通过光培养促进金花茶叶愈伤组织形成叶绿素，进行光合作用合成能源提供生长所需能量，而且通过暗培养促进其进行呼吸作用，物质转换，促进生长。

[0023] 3.本发明光培养使用的是较弱的光照强度，不仅提高了金花茶组培的增殖倍数，缩短周期培养的时间，且采用弱光的光培养能够减少日光灯补光时产生的电耗和产生的热量，减少降温所需的费用，因此采用此方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展，通过本发明的方法金花茶的发芽率达到75％以上。

[0024] 4.本发明的方法有利于工业化生产和自动化监控，大大的节约了人力、物力和田间作物的土地；在金花茶苗栽培生产领域中具有极大的推广价值。

具体实施方式

[0025] 下面通过具体实施例进一步说明本发明，以使本发明的优点和特征更易于被理解，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制。

[0026] 实施例1：

[0027] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0028] (1)外植体的消毒：于6月份晚上1点采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金花茶叶，然后使用20％乐果乳剂稀释400倍液浸泡5min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒5min，然后用无菌水冲洗3次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

[0029] (2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长15cm，宽10cm的叶条片，将3片的叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的规格为90×15mm的培养皿中，轻压叶条片，在29℃下暗培养8天，而后转入26℃下进行8天的暗培养，获得金花茶愈伤组织，其中，愈伤组织培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.3mg/L 6～苄基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5；将培养基放入高温灭菌锅，在121℃、1.1kg/cm2条件下进行灭菌30min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3；

[0030] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.3mg/L 6～苄基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0，于25℃条件下，进行光培养20h，暗培养4h的光暗培养30天后愈伤组织分化出芽，其中，光培养的光照强度为1500勒克斯；

[0031] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.4mg/L的温度为22～25℃清水在后续5～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0032] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.8mg/L吲哚乙酸+0.5mg/L萘乙酸+0.8mg/L活性炭+0.8mg/L的硫酸亚铁，于25℃条件下，进行光培养20h，暗培养4h的光暗培养20天，其中，光培养的光照强度为3000勒克斯，至培养出幼苗，组培结束。

[0033] 实施例2：

[0034] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0035] (1)外植体的消毒：于7月份晚上2点采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金花茶叶，然后使用40％乐果乳剂稀释600倍液浸泡10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒10min，然后用无菌水冲洗5次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

[0036] (2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长18cm，宽15cm的叶条片，将5片的叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的规格为90×15mm的培养皿中，轻压叶条片，在31℃下暗培养15天，而后转入28℃下进行15天的暗培养，获得金花茶愈伤组织，其中，愈伤组织培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+0.8mg/L 6～苄基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0；将培养基放入高温灭菌锅，在130℃、1.5kg/cm2条件下进行灭菌50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/2；

[0037] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+0.8mg/L 6～苄基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.5，于28℃条件下，进行光培养22h，暗培养2h的光暗培养45天后愈伤组织分化出芽，其中，光培养的光照强度为1700勒克斯；

[0038] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.2～0.3mg/L的温度为22～25℃清水在后续5～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0039] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+2.5mg/L吲哚乙酸+1.5mg/L萘乙酸+1.5mg/L活性炭+1.5mg/L的硫酸亚铁，于28℃条件下，进行光培养22h，暗培养2h的光暗培养30天，其中，光培养的光照强度为2000勒克斯，至培养出幼苗，组培结束。

[0040] 实施例3：

[0041] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0042] (1)外植体的消毒：于6月份晚上1点20分时采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金花茶叶，然后使用25％乐果乳剂稀释450倍液浸泡6min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒6min，然后用无菌水冲洗4次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

[0043] (2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长16cm，宽11cm的叶条片，将4片的叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的规格为90×15mm的培养皿中，轻压叶条片，在30℃下暗培养9天，而后转入27℃下进行9天的暗培养，获得金花茶愈伤组织，其中，愈伤组织培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.4mg/L 6～苄基嘌呤+0.9mg/L萘2
乙酸，调节培养基的pH值为6.2；将培养基放入高温灭菌锅，在122℃、1.2kg/cm条件下进行灭菌35min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3；

[0044] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.4mg/L 6～苄基嘌呤+0.9mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.6，于26℃条件下，进行光培养21h，暗培养3h的光暗培养33天后愈伤组织分化出芽，其中，光培养的光照强度为1550勒克斯；

[0045] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.6mg/L的温度为23～27℃清水在后续6～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0046] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5.5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.9mg/L吲哚乙酸+0.8mg/L萘乙酸+0.9mg/L活性炭+1.0mg/L的硫酸亚铁，于26℃条件下，进行光培养21h，暗培养3h的光暗培养25天，其中，光培养的光照强度为2300勒克斯，至培养出幼苗，组培结束。

[0047] 实施例4：

[0048] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0049] (1)外植体的消毒：于7月份晚上1点30分时采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金花茶叶，然后使用35％乐果乳剂稀释500倍液浸泡7min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒7min，然后用无菌水冲洗3次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

[0050] (2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长17cm，宽12cm的叶条片，将3片的叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的规格为90×15mm的培养皿中，轻压叶条片，在29℃下暗培养14天，而后转入27℃下进行13天的暗培养，获得金花茶愈伤组织，其中，愈伤组织培养基的配方为MS+7g/L琼脂+28g/L蔗糖+0.7mg/L 6～苄基嘌呤+1.0mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.1；将培养基放入高温灭菌锅，在128℃、1.4kg/cm2条件下进行灭菌40min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/2；

[0051] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.7mg/L 6～苄基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.0，于27℃条件下，进行光培养20h，暗培养4h的光暗培养32天后愈伤组织分化出芽，其中，光培养的光照强度为1600勒克斯；

[0052] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.6mg/L的温度为23～27℃清水在后续6～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0053] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5.3cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+28g/L蔗糖+2.0mg/L吲哚乙酸+1.0mg/L萘乙酸+1.0mg/L活性炭+1.1mg/L的硫酸亚铁，于26℃条件下，进行光培养20h，暗培养4h的光暗培养27天，其中，光培养的光照强度为2100勒克斯，至培养出幼苗，组培结束。

[0054] 实施例5：

[0055] 一种嫩芽金花茶的组培快繁方法，包括如下步骤：

[0056] (1)外植体的消毒：于5月份晚上1点50分时采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金花茶叶，然后使用22％乐果乳剂稀释550倍液浸泡9min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒9min，然后用无菌水冲洗4次，最后使用灭菌滤纸吸干金花茶叶表面的无菌水；

[0057] (2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金花茶叶的茎干位置横切出长17cm，宽14cm的叶条片，将3片的叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的规格为90×15mm的培养皿中，轻压叶条片，在29℃下暗培养11天，而后转入26℃下进行11天的暗培养，获得金花茶愈伤组织，其中，愈伤组织培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.7mg/L 6～苄基嘌呤+1.2mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.4；将培养基放入高温灭菌锅，在129℃、1.2kg/cm2条件下进行灭菌45min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/2；

[0058] (3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.7mg/L 6～苄基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.3，于25℃条件下，进行光培养21h，暗培养3h的光暗培养42天后愈伤组织分化出芽，其中，光培养的光照强度为1650勒克斯；

[0059] (4)芽生根前期护理：用含蔗糖0.3～0.6mg/L的温度为23～27℃清水在后续6～10天内添加入培养皿中；通过清水可以有效加快嫩芽的生长。

[0060] (5)芽生根：待步骤(4)中芽长至5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+2.3mg/L吲哚乙酸+0.9mg/L萘乙酸+1.3mg/L活性炭+1.3mg/L的硫酸亚铁，于25℃条件下，进行光培养22h，暗培养2h的光暗培养29天，其中，光培养的光照强度为2500勒克斯，至培养出幼苗，组培结束。

[0061] 如实施例1～5各条件下进行组培的条件下，对各实施例的组织培养的总数、愈伤组织培养阶段的情况变化和出苗率统计表如表1，愈伤组织培养期间每隔3天进行一次叶片颜色变化的记录，总结变化趋势。

[0062] 表1出苗率统计表