一种雪花草的组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明根据雪花草的生长特性并在MS培养基的基础上配制出适合雪花草组织培养的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根培养基。使用本发明所述的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根培养基能有效提高繁殖系数，降低生产成本；生产周期短，种植效益大大提高；能够有效解决夏季雪花草严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。

权利要求

1.一种雪花草Hottonia inflata的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体选取与消毒，(2)改良MS培养基的制备，(3)不定芽诱导，(4)继代增殖，(5)无菌生根以及(6)炼苗与移栽，其特征在于，具体步骤如下：(1)外植体选取与消毒：

①选取雪花草幼嫩的枝条作为外植体，

②用中性洗涤剂洗涤枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，④立即转入0.3％的升汞溶液中消毒12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；

(2)改良MS培养基的制备：

改良MS培养基的配方为：用Ca(NO3)2·4H2O代替原MS培养基中的CaCl2·2H2O并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；在改良MS培养基中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为300-600mg/L，抗坏血酸的浓度为3-10mg/L；

(3)不定芽诱导：

将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养22天，得到雪花草不定芽；诱导培养条件如下：温度为

26±3℃，湿度为80％，光照时间为15小时/天，光照强度为1000-1200lx；

所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及IBA；在用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为0.1-1mg/L，KT的浓度为0.05-0.5mg/L，IBA的浓度为0.1-0.5mg/L；

(4)继代增殖：

将步骤(3)得到的雪花草不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20-25天，得到雪花草无菌苗；继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为65％，光照时间为12-

15小时/天，光照强度为1000-1200lx；

所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、IBA以及GA；在用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为1.0-5.0mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L，GA的浓度为1-5mg/L；

(5)无菌生根：

将步骤(4)得到的雪花草无菌苗进行切繁并保持每株均有一个不定芽，然后接入用于无菌生根培养基中，进行生根培养20天，得到雪花草幼苗；生根培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为65％，光照时间为15小时/天，光照强度为1000-12001x；

所述的用于无菌生根培养基的配方为：在改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA；在用于无菌生根培养基中6-BA的浓度为0.05-0.5mg/L，NAA的浓度为0.5-3mg/L；

(6)炼苗与移栽：

步骤(5)中雪花草幼苗生长至根长1-2cm、苗高3-4cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘，放入消毒后的水池，塑料大棚，遮光率

75-80％的遮阳网；经室内炼苗7-10天后移栽，将组培苗根部用消毒后的岩棉包裹，植入直径3-5cm的塑料镂空杯中，放入塑料大棚的水池，光照控制在20-30％，保持湿度80％以上，移栽5-7天即可上市。

说明书

一种雪花草的组织培养快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，属于植物快速繁殖技术领域。

背景技术

[0002] 随着国民经济的发展，水族箱逐渐普及，也越来越流行。观赏水草在水族箱中的地位重要，已经发展到以水草为主的水族箱观赏阶段。目前在水族箱中应用的观赏水草品种已经超过500多种，其中绝大多数来原于美洲(皇冠类)、非洲(榕类)、东南亚(椒草类)等地。

[0003] 雪花草(Hottonia inflata)，在水族箱布景中常常作为中、前景水生水草。具3-7次羽状深裂的互生叶片，俯视时很像雪花的结晶图案，会在水上开红紫色花。雪花草的水上草与水中草同型，水上草通常突出水面生长，亦可在湿地上匍匐生长。雪花草的种植比其它水草相对困难，其水上草或水中草，均不耐高温，当温度超过28℃以上时生长不良或死亡，导致在夏季市场上供不应求。

[0004] 观赏水草内生菌多，组织培养十分困难。目前也有一些观赏水草如水榕、红椒、绿椒等已经通过组织培养获得成功，但是对于一些依靠传统繁殖难度高、且具有高观赏和经济价值的品种，如大喷泉、长叶网草等品种由于组织培养困难还没有成功。目前国内专业开展水草组织培养研究和工厂化生产的还不多，工厂化育苗技术体系还有待进一步研究。雪花草的繁殖目前主要依靠其分蘖，繁殖系数低，在生产上需要大量的种苗，增加种苗成本。组织培养技术能够在短期内大量提供雪花草的种苗，同时克服雪花草在夏季由于高温难生长的困境。

[0005] 针对以上的现状，本发明提供了一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，其操作简单。雪花草种苗的全年供应，使得更多喜爱雪花草的消费者能有足够的材料来造景，提高种植和销售者的收入，从而促进观赏水草产业的进一步发展。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于解决当前雪花草种苗的来源，特别是为在夏季保障雪花草种苗。并提供一种快速，低成本的雪花草的组织培养快速繁殖的方法。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下：

[0008] 一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体选取与消毒，(2)培养基的制备，(3)不定芽诱导，(4)继代增殖，(5)无菌生根以及(6)炼苗与移栽，所述的培养基的制备方法如下：

[0009] (1)改良MS培养基的制备，配方为：用Ca(NO3)2·4H2O代替原MS培养基中的CaCl2·2H2O并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；在改良MS培养基中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为300-
600mg/L，抗坏血酸的浓度为3-10mg/L；

[0010] (2)制备用于不定芽诱导的培养基，配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及IBA；在所述诱导培养基中6-BA的浓度为0.1-1mg/L，KT的浓度为0.05-0.5mg/L，IBA的浓度为0.1-0.5mg/L；

[0011] (3)制备用于继代增殖的培养基，配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、IBA以及GA；在所述继代增殖培养基中6-BA的浓度为1.0-5.0mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L，GA的浓度为1-5mg/L；

[0012] (4)制备用于无菌生根培养基，配方为：在改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA；在所述生根培养基中6-BA的浓度为0.05-0.5mg/L，NAA的浓度为0.5-3mg/L。

[0013] 优选的，在改良MS培养基中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为456mg/L，抗坏血酸的浓度为5mg/L。

[0014] 优选的，所述用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为0.5mg/L，KT的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L。

[0015] 优选的，在所述用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，GA的浓度为3mg/L。

[0016] 优选的，在所述的用于无菌生根培养基中6-BA的浓度为0.1mg/L，NAA的浓度为1mg/L。

[0017] 本发明的有益效果是：

[0018] 利用本发明所述培养基对雪花草茎段的腋芽进行组织培养快速繁殖，有效提高繁殖系数，生产周期短，种植效益大大提高，能够有效解决夏季雪花草严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。

具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

[0020] 实施例1

[0021] 一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0022] (1)外植体选取与消毒：

[0023] ①选取雪花草幼嫩的枝条作为外植体，

[0024] ②用中性洗涤剂洗涤枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，

[0025] ③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，

[0026] ④立即转入0.1-0.3％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；

[0027] (2)改良MS培养基的制备：

[0028] 改良MS培养基的配方为：用Ca(NO3)2·4H2O代替原MS培养基中的CaCl2·2H2O并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为456mg/L，抗坏血酸的浓度为5mg/L；

[0029] (3)不定芽诱导：

[0030] 将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养18-22天，得到雪花草不定芽；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-1200lx；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及IBA；其中
6-BA的浓度为0.5mg/L，KT的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L；

[0031] (4)继代增殖：

[0032] 将步骤(3)得到的雪花草不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20-25天，得到雪花草无菌苗；继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-1200lx；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、IBA以及GA；其中6-BA的浓度为2.0mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，GA的浓度为3mg/L；

[0033] (5)无菌生根：

[0034] 将步骤(4)得到的雪花草无菌苗进行切繁并保持每株均有一个不定芽，然后接入用于无菌生根培养基中，进行生根培养15-20天，得到雪花草幼苗；生根培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；所述的用于无菌生根培养基的配方为：在改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA；其中6-BA的浓度为0.1mg/L，NAA的浓度为1mg/L；

[0035] (6)炼苗与移栽：

[0036] 步骤(5)中雪花草幼苗生长至根长1cm、苗高3cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘，放入消毒后的水池，塑料大棚，遮光率75％的遮阳网；经室内炼苗7天后移栽，将组培苗根部用消毒后的岩棉包裹，植入直径3cm的塑料镂空杯中，放入塑料大棚的水池，光照控制在20％，保持湿度80％以上，移栽5-7天即可上市。

[0037] 实施例2

[0038] 一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0039] (1)外植体选取与消毒：

[0040] ①选取雪花草幼嫩的枝条作为外植体，

[0041] ②用中性洗涤剂洗涤枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，

[0042] ③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，

[0043] ④立即转入0.1％的升汞溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；

[0044] (2)改良MS培养基的制备：

[0045] 改良MS培养基的配方为：用Ca(NO3)2·4H2O代替原MS培养基中的CaCl2·2H2O并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为300mg/L，抗坏血酸的浓度为3mg/L；

[0046] (3)不定芽诱导：

[0047] 将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养18天，得到雪花草不定芽；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50％，光照时间为12小时/天，光照强度为800-1000lx；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及IBA；其中6-BA的浓度为0.1mg/L，KT的浓度为0.05mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L；

[0048] (4)继代增殖：

[0049] 将步骤(3)得到的雪花草不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20天，得到雪花草无菌苗；继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50％，光照时间为12小时/天，光照强度为800-1000lx；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、IBA以及GA；其中6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.05mg/L，GA的浓度为1mg/L；

[0050] (5)无菌生根：

[0051] 将步骤(4)得到的雪花草无菌苗进行切繁并保持每株均有一个不定芽，然后接入用于无菌生根培养基中，进行生根培养15天，得到雪花草幼苗；生根培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为50％，光照时间为12小时/天，光照强度为800-10001x；所述的用于无菌生根培养基的配方为：在改良MS培养基的基础上添加6-BA和NAA；其中6-BA的浓度为0.05mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L；

[0052] (6)炼苗与移栽：

[0053] 步骤(5)中雪花草幼苗生长至根长2cm、苗高4cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，移入64孔的穴盘，放入消毒后的水池，塑料大棚，遮光率80％的遮阳网；经室内炼苗10天后移栽，将组培苗根部用消毒后的岩棉包裹，植入直径5cm的塑料镂空杯中，放入塑料大棚的水池，光照控制在30％，保持湿度80％以上，移栽7天即可上市。

[0054] 实施例3

[0055] 一种雪花草的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0056] (1)外植体选取与消毒：

[0057] ①选取雪花草幼嫩的枝条作为外植体，

[0058] ②用中性洗涤剂洗涤枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，

[0059] ③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，

[0060] ④立即转入0.3％的升汞溶液中消毒12min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体；

[0061] (2)改良MS培养基的制备：

[0062] 改良MS培养基的配方为：用Ca(NO3)2·4H2O代替原MS培养基中的CaCl2·2H2O并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2·4H2O的浓度为600mg/L，抗坏血酸的浓度为10mg/L；

[0063] (3)不定芽诱导：

[0064] 将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养22天，得到雪花草不定芽；诱导培养条件如下：温度为26±3℃，湿度为80％，光照时间为15小时/天，光照强度为1000-1200lx；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及IBA；其中6-BA的浓度为1mg/L，KT的浓度为0.5mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L；