一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用

摘要

本发明公开了一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用，移植系统包括凝胶支架以及黏附在凝胶支架上的骨髓间充质干细胞，凝胶支架的制备方法为：在交联剂存在下，HA与ADH发生交联反应，经冷冻干燥获得支架骨架；按反应官能团计，HA、ADH、交联剂的摩尔比为1:(2～4):(7～15)；对支架骨架进行脱水、活化、溶胀，利用RGD多肽对溶胀的支架骨架进行修饰，经冷冻干燥获得凝胶支架。本发明在一定的原料配比下制备获得支架骨架，使支架骨架具备较高的孔隙率，呈现较规则的三维网状结构；采用RGD多肽对支架骨架进行修饰，大大改善了干细胞在凝胶支架上的粘附性，使得该移植系统与中枢神经组织具有更好的相容性。

权利要求

1.一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统，包括凝胶支架以及黏附在凝胶支架上的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述凝胶支架通过以下步骤制备获得：(1)在交联剂存在下，透明质酸和己二酸二酰肼发生交联反应，经冷冻干燥后获得支架骨架；

按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:(2～4):(7～15)；

所述反应官能团分别是指透明质酸中的羧基、己二酸二酰肼中的伯胺基、交联剂中的肿胺基；

(2)对所述支架骨架进行脱水、活化、溶胀，利用RGD多肽对溶胀的支架骨架进行修饰，经冷冻干燥后获得所述凝胶支架；

6

所述透明质酸的分子量不低于1×10Da。

2.如权利要求1所述的凝胶支架移植系统，其特征在于，按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:4:15。

3.如权利要求1所述的凝胶支架移植系统，其特征在于，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

4.如权利要求1所述的凝胶支架移植系统，其特征在于，步骤(1)中，所述交联反应在pH 4.5～4.75下进行。

5.如权利要求1所述的凝胶支架移植系统，其特征在于，步骤(2)中，采用1,1'-羰基二咪唑对脱水后的支架骨架进行活化，活化的时间为15～20min。

6.如权利要求1所述的凝胶支架移植系统，其特征在于，步骤(2)中，将溶胀后的支架骨架置于含230mM RGD多肽的碳酸氢钠溶液中，反应48h。

7.如权利要求1～6任一所述的凝胶支架移植系统的制备方法，其特征在于，对所述凝胶支架进行浸泡灭菌、溶胀后，将骨髓间充质干细胞悬液注入凝胶支架中，置于培养液中培养，获得所述凝胶支架移植系统。

8.如权利要求1～6任一所述复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统在制备神经组织修复药物中的应用。

说明书

一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于制剂材料制备和再生医学领域，具体涉及一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统及其应用。

背景技术

[0002] 中枢神经系统(CNS)疾病如慢性退行性疾病以及各种损伤如脊髓损伤等，常会导致神经元、轴突及神经胶质细胞的丢失，从而造成患者的知觉或运动功能障碍甚至瘫痪。由于CNS变性或损伤后的再生能力差，难以产生新的神经元而完成自我修复，使得干细胞移植成为神经组织修复再生研究的主要趋势。第一例采用胚胎干细胞移植治疗人体脊髓损伤的临床试验已于2009年获得美国FDA批准。然而，由于取材来源、伦理道德以及免疫排斥反应等因素，使得胚胎干细胞和神经干细胞的研究应用受到了严重的限制。

[0003] 骨髓间充质干细胞(BMSC)是一类以骨髓组织中含量最为丰富的多能干细胞，具有向损伤和炎症部位定向迁移的特性，可在一定条件下分化为神经元样细胞，并分泌多种在神经发育及分化过程中发挥重要作用的细胞因子。BMSC以其取材方便、体内免疫排斥和不良反应较低，以及可自体移植无伦理学争议等优点，而被视为最具前景的神经系统疾病的细胞移植来源。但是由于体内损伤部位微环境细胞外基质受到严重破坏，外源性细胞植入后存活率较低，并且损伤部位恶劣的微环境也对内源性神经细胞核轴突的再生产生抑制作用。

[0004] 透明质酸是一种广泛存在于生物体细胞外基质中的粘性多糖成分，是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺构成的二糖单元重复交替连接而成的线性多糖。具有良好的生物相容性，可为细胞提供信息并有利于营养物质的供应和代谢物的排放。研究表明HA能够调节细胞的黏附、增殖、迁移和分化，在中枢神经系统的形成和发育过程中起重要作用，同时其自身尚具有一定的抗炎作用从而可一定程度上抑制神经组织内瘢痕的形成。

[0005] 然而HA由于自身力学性质不佳、以及细胞识别吸附位点的相对缺乏，使其难以单独作为神经组织的生物支架，传统研究几乎均采用将其与其他材料复合应用的形式，如公告号为CN 102805880A的中国专利文献公开了一种组织工程凝胶支架材料及其制备方法和用途，该方法先将含有透明质酸或其盐的溶液与1,4-丁二酸缩水甘油醚混合，得到混合溶液，再将该混合溶液平铺使厚度为2-10mm、干燥，得到组织工程凝胶支架材料。

[0006] RGD多肽是一种存在于细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合从而促进细胞粘附的多肽，由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。如申请号为200610019493.9的中国专利文献公开了一种RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-L-乳酸)/β-磷酸三钙复合材料及其制备方法，该方法采用RGD多肽修饰磷酸三钙，可作为神经导管或多孔骨支架材料。

[0007] 目前还未有RGD多肽、透明质酸以及骨髓间充质干细胞联合构建移植系统，用于神经组织修复的相关报道。

发明内容

[0008] 本发明提供了一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统，该移植系统无毒、柔软、粘弹性好，且构建方法简单，重现性好，便于控制。

[0009] 一种复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统，包括凝胶支架以及黏附在凝胶支架上的骨髓间充质干细胞，所述凝胶支架通过以下步骤制备获得：

[0010] (1)在交联剂存在下，透明质酸和己二酸二酰肼发生交联反应，经冷冻干燥后获得支架骨架；

[0011] 按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:(2～4):(7～15)；

[0012] 所述反应官能团分别是指透明质酸中的羧基、己二酸二酰肼中的伯胺基、交联剂中的肿胺基；

[0013] (2)对所述支架骨架进行脱水、活化、溶胀，利用RGD多肽对溶胀的支架骨架进行修饰，经冷冻干燥后获得所述凝胶支架。

[0014] 本发明在一定的原料配比下制备获得支架骨架，使得支架骨架具备较高的孔隙率，呈现较为规则的三维网状结构，孔隙直径在80～100μm，可以很好地支持骨髓间充质干细胞的生长和聚集；并且，采用RGD多肽对支架骨架进行修饰，大大改善了骨髓间充质干细胞在凝胶支架上的粘附性，使得该凝胶支架移植系统与中枢神经组织具有更好的相容性。

[0015] 具体地，所述凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

[0016] (1)在交联剂存在下，透明质酸(HA)和己二酸二酰肼(ADH)发生交联反应，经冷冻干燥后获得支架骨架；

[0017] 作为优选，按反应官能团计，透明质酸、己二酸二酰肼、交联剂的摩尔比为1:4:15。在该原料配比下，获得的支架骨架孔隙率最高。

[0018] 作为优选，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

[0019] 所述透明质酸的分子量不低于1×106Da。低于该分子量时，所制备的凝胶支架难以得到理想的三维网状结构，不利于骨髓间充质干细胞的粘附和生长。

[0020] 作为优选，所述交联反应在pH 4.5～4.75下进行。将HA、ADH、EDC混合均匀后，调节反应液的pH至4.5～4.75后浇注入模具中待其形成凝胶；然后调节pH至7终止反应。

[0021] 反应完成后，透析洗去未反应的物质，并将所得凝胶于-80℃预冻3小时以上，冷冻干燥，形成具有良好空隙结构的支架骨架。

[0022] (2)对所述支架骨架进行脱水、活化、溶胀，利用RGD多肽对溶胀的支架骨架进行修饰，经冷冻干燥后获得所述凝胶支架。

[0023] RGD多肽的修饰反应须在无水条件下进行，因此先将所得支架骨架直接进行丙酮梯度脱水或经溶胀后再进行丙酮梯度脱水。丙酮沸点低容易除去，除丙酮外，还可选用其他能与水混溶的有机溶剂进行脱水操作。

[0024] 作为优选，采用1,1'-羰基二咪唑(CDI)对脱水后的支架骨架进行活化，活化的时间为15～20min。

[0025] 采用100mM的碳酸氢钠溶液(pH＝8.4)置换支架骨架中的丙酮，并充分溶胀支架骨架之后，将溶胀后的支架骨架置于含231mM RGD多肽的碳酸氢钠溶液中，反应48h。

[0026] 修饰完成后，冷冻干燥获得所述凝胶支架。

[0027] 对所述凝胶支架进行浸泡灭菌、溶胀后，将骨髓间充质干细胞悬液注入凝胶支架中，置于培养液中培养，即获得所述凝胶支架移植系统。

[0028] 可选用75％酒精进行浸泡灭菌，灭菌完成后用PBS缓冲液置换凝胶支架中的酒精，将骨髓间充质干细胞悬液从上方注入凝胶支架中，置于培养液中培养24h后更换培养液，获得所述凝胶支架移植系统。

[0029] 与未经RGD多肽修饰的支架骨架相比，在本发明RGD多肽修饰的凝胶支架上，骨髓间充质干细胞伸出更多伪足，对支架的黏附作用明显增强。

[0030] 本发明还提供了所述复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统在制备神经组织修复药物中的应用。

[0031] 将本发明的凝胶支架移植系统植入体内损伤的中枢神经系统部位，用于修复损伤的神经组织，该移植系统柔软有韧性，与中枢神经系统的硬度相近，因此在中枢神经系统组织的修复过程中，可替代损伤处缺失的细胞外基质，促进BMSC向神经的分化以及支持内源性神经元的生长。

[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0033] (1)本发明利用天然的细胞外基质成分—透明质酸为原料交联构建三维水凝胶支架，以支持外源性BMSC和内源性神经元的生长以及促进BMSC的神经分化；并且该凝胶支架上还修饰有EGD多肽，EGD多肽的修饰大大改善了细胞的粘附生长；整个制备过程简单可控，重现性好；

[0034] (2)本发明的移植系统中粘附生长有骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞无免疫原性，与胚胎干细胞和神经干细胞相比来源广泛，提取方便；将本发明的移植系统用于神经组织修复中，骨髓间充质干细胞不仅可通过自身分化以补充损伤处的神经元，还可分泌各种细胞因子为神经组织提供营养和保护作用，也可通过基因修饰携载特定功能蛋白增强修复作用。

附图说明

[0035] 图1为实施例1所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0036] 图2为实施例2所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0037] 图3为实施例3所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0038] 图4为对比例1所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0039] 图5为对比例2所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0040] 图6为对比例3所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0041] 图7为对比例4所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0042] 图8为对比例5所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0043] 图9为对比例6所制备的支架骨架内部三维结构的扫描电镜图；

[0044] 图10A为实施例3制备的凝胶支架移植系统中黏着斑蛋白以及骨髓间充质干细胞的细胞骨架及细胞核染色的共聚焦显微镜图片；

[0045] 图10B为利用实施例3未修饰RGD肽的支架骨架制备的移植系统中黏着斑蛋白以及骨髓间充质干细胞的细胞骨架及细胞核染色的共聚焦显微镜图片；

[0046] 图11A为实施例3制备的凝胶支架移植系统中骨髓间充质干细胞的粘附和形态的扫描电镜图；

[0047] 图11B为利用实施例3未修饰RGD肽的支架骨架制备的移植系统中骨髓间充质干细胞的粘附和形态的扫描电镜图。

具体实施方式

[0048] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作为进一步详细说明。本发明的实施例中，百分数均是指质量百分数，比例均指反应官能团的摩尔比，具体指明的除外。

[0049] 实施例1制备支架骨架

[0050] 本实施例的支架骨架通过以下步骤制备获得：

[0051] (1)向7mL去离子水中加入0.5g透明质酸钠(分子量为1.5×106Da)，充分搅拌，配制透明质酸水溶液，观察溶解均匀后调节pH为4.5；

[0052] (2)按照反应官能团(透明质酸中的羧基，己二酸二酰肼中的伯胺基)摩尔比HA:ADH＝1:4向透明质酸水溶液中加入ADH，充分搅拌使混合均匀，调节pH为4.5；

[0053] (3)按照HA:EDC＝1:10向步骤(2)所得溶液中加入EDC，搅拌使快速混合均匀，调节PH为4.5，快速搅拌，立即注入模具中待其形成凝胶，调节pH＝7终止反应；

[0054] (4)采用PH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)对所得凝胶进行透析，48h后于-80℃冷冻过夜，冷冻干燥，获得支架骨架。

[0055] 实施例2

[0056] 与实施例1相同，但将HA与ADH的比例改为HA:ADH＝1:2，将HA与EDC的比例改为HA:EDC＝1:15。

[0057] 实施例3

[0058] (1)-(4)与实施例1相同，但将HA与EDC的比例改为HA:EDC＝1:15。

[0059] (5)将所得的支架骨架溶胀于100mM的NaHCO3溶液(pH8.4)中，待溶胀充分后利用丙酮梯度脱水，各浓度梯度的丙酮/水的体积比分别为：20/80，40/60，60/40，80/20，90/10，95/5和纯丙酮；

[0060] (6)将脱水后的支架骨架置于100mg/mL的CDI溶液中活化15min，用NaHCO3溶液洗去丙酮并重新溶胀该支架骨架；

[0061] (7)将溶胀后的支架骨架置于含200mM的RGD肽的NaHCO3溶液(100mM，pH8.4)中进行肽修饰反应，反应48h后取出支架骨架，透析48h，-80℃冷冻过夜，冷冻干燥，获得凝胶支架；

[0062] (8)将凝胶支架溶胀于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，溶胀后用体积分数为75％的酒精浸泡2h，用PBS洗去酒精，将骨髓间充质干细胞悬液(来源于大鼠)从凝胶支架上方注入，置于DMEM低糖培养液中培养，24h后更换新鲜培养液，获得复合骨髓间充质干细胞的凝胶支架移植系统。

[0063] 对比例1

[0064] 与实施例1相同，但将HA与EDC的比例改为HA:EDC＝1:5。

[0065] 对比例2

[0066] 与实施例1相同，但将HA与ADH的比例改为HA:ADH＝1:2。

[0067] 对比例3

[0068] 以分子量为0.5×106Da的透明质酸钠为原料，按照HA、ADH、EDC的比例为HA:ADH:EDC＝1:8:5，按照与实施例1相同的方法，制备支架骨架。

[0069] 对比例4

[0070] 以分子量为0.5×106Da的透明质酸钠为原料，按照HA、ADH、EDC的比例为HA:ADH:EDC＝1:20:10，按照与实施例1相同的方法，制备支架骨架。

[0071] 对比例5

[0072] 以分子量为0.5×106Da的透明质酸钠为原料，按照HA、ADH、EDC的比例为HA:ADH:EDC＝1:17:21，按照与实施例1相同的方法，制备支架骨架。

[0073] 对比例6

[0074] 以分子量为0.5×106Da的透明质酸钠为原料，按照HA、ADH、EDC的比例为HA:ADH:EDC＝1:29:31，按照与实施例1相同的方法，制备支架骨架。

[0075] 检测例1

[0076] 将实施例1～3、对比例1～2、对比例3～6制备的支架骨架分别用镊子掰开，制造自然断口，将断面朝上粘于载物台上，喷金、干燥后进行扫描电镜检测，观察支架骨架的内部结构，观察结果依次为图1～9。

[0077] 由图1～3可见，实施例1～3所制备的支架骨架具有较高的孔隙率，呈现较规则的三维网状结构。孔隙直径都在80～100μm左右，可支持骨髓间充质干细胞(20～30μm左右)的生长和聚集。

[0078] 由图4可见，对比例1所制备的支架骨架几乎无孔隙；由图5可见，对比例2所制备的支架骨架，其孔隙壁厚且极不规则；两者均难以用于骨髓间充质干细胞的生长和聚集。

[0079] 由图6～9可见，对比例3～6所制备的支架骨架均无明显的孔隙结构。

[0080] 以上结果表明，选择适宜分子量的透明质酸钠、选择适宜的HA:ADH:EDC比例，是获得具有理想孔隙结构的支架骨架的重要因素。

[0081] 检测例2

[0082] 对实施例3中制备的凝胶支架移植系统进行黏着斑蛋白和细胞形态染色检测，考察凝胶支架中骨髓间充质干细胞的黏附和形态。

[0083] 包括以下步骤：凝胶支架移植系统在培养液培养3天后取出，用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min。0.1％Triton X-100透化3-5min，PBS洗两遍以上，用1％BSA处理细胞20min。将黏着斑蛋白(vinculin)一抗(武汉博士德生物工程有限公司)按照比例稀释，于37℃下与移植系统孵育1h，PBS洗3次，加入Dylight 488标记的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，于37℃下孵育1h，PBS洗3次。按照染色液5μl和PBS 200μl的比例配置鬼笔环肽染色液(invitrogene)，对样品染色，室温孵育30min。PBS洗两遍以上。DAPI(南京凯基生物科技发展有限公司)用甲醇稀释10倍，与样品孵育30min。PBS洗两遍，加PBS，4℃保存。

[0084] 用未经肽修饰的支架骨架作为对照，细胞接种方法与实施例3相同，细胞染色操作与上述凝胶支架移植系统平行进行。将染色后的样品置于共聚焦显微镜上观察，对支架进行z-stack三维扫描。观察结果见图10A和图10B。

[0085] 由图10A可见，实施例3的凝胶支架移植系统中含有有黏着斑蛋白，表明骨髓间充质干细胞可以在凝胶支架上黏附、伸展和生长。而根据图10B显示，未经肽修饰的透明质酸凝胶支架中，骨髓间充质干细胞呈现近圆形，几乎不能伸展，也较少分泌黏着斑蛋白。

[0086] 检测例3

[0087] 以未经肽修饰的支架骨架作为对照(同样接种有骨髓间充质干细胞，细胞接种方法与实施例3相同)，对实施例3中制备的凝胶支架移植系统进行细胞染色，考察凝胶支架中骨髓间充质干细胞的黏附和形态。

[0088] 包括：凝胶支架移植系统在培养液培养3天后取出，用PBS洗3次，用戊二醛固定1h，PBS洗3次，锇酸固定1h。PBS洗3次，用体积分数分别为30％，50％，70％，80％，90％，
95％的乙醇梯度脱水，各10min；纯乙醇脱水2次，每次10min；乙酸异戊酯脱水1次，10min。
干燥，喷金，扫描电镜观察。观察结果见图11A和11B。

[0089] 由图11A和11B可见，相对于未经RGD多肽修饰的支架骨架，实施例3的凝胶支架移植系统中，骨髓间充质干细胞伸出更多伪足，对支架的黏附作用明显增强。