本发明涉及生物物质的实时定量及定性分析方法，尤其涉及在同一个空间内合并进行实时聚合酶链反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)及DNA微阵列而能够进行生物物质的实时定量及定性分析的方法。
1.一种生物物质的实时定量及定性分析方法，包括如下步骤：
(a)准备生物物质检测用元件，该生物物质检测用元件包括上部形成有开口部的反应容器和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器的元件部，其中所述元件部包括结合于所述反应容器的开口部的盖和朝所述盖的下部延伸而形成的杆，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片；
(b)向所述反应容器内添加包含第一探针-第二探针复合体、正向引物、反向引物、碱磷酸去氧核苷酸、具有外切核酸酶活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液的反应溶液，其中，所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体，所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；
(c)进行包含所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应，其中，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，从所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体；
(d)被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长，其中，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体，随着所述第二探针在所述第三探针上延长，第二猝灭体从所述第二荧光体分开而产生发光；以及(e)检测由所述第一荧光体引起的第一荧光信号以及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。
2.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述反应溶液添加为使设置于杆的生物芯片浸渍于反应溶液中。
3.根据权利要求2所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述生物芯片设置于选自所述杆的外周面以及下部的至少一个区域，其中，设置所述生物芯片的至少一个区域以浸渍于所述反应溶液的状态存在。
4.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探针通过第三探针的5'末端或3'末端的高分子物质固定于所述生物芯片。
5.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中具有外切核酸酶活性的聚合酶以每反应为在0.1单位～1单位的范围内选择的量来使用。
6.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中第一探针-第二探针复合体以每反应为在0.5pmole～10pmole的范围内选择的量来使用。
7.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中所述正向引物及所述反向引物以对称或非对称浓度来使用。
8.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述步骤(c)是在所述反应溶液内进行。
9.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述反应溶液内不存在被分解而释放的第二探针。
10.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述第一荧光体被第一猝灭体而处于猝灭状态，所述第二荧光体被第二猝灭体而处于猝灭状态。
11.根据权利要求10所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，不发生由所述第一荧光体引起的第一荧光信号及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。
12.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，在引起所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性之后，所述第一探针-第二探针复合体中的第一探针和所述正向引物及所述反向引物被杂化到所述靶基因中互补的位置，所述第二探针结合于所述第一探针，但以没有杂化到所述靶基因的状态存在。
13.根据权利要求12所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性是在92℃～98℃的温度范围内进行。
14.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述步骤(c)的延长反应是在所述引物的延长温度下通过具有5'外切核酸酶活性的聚合酶而进行，在进行所述引物的延长反应的期间，通过所述聚合酶而从杂化于所述靶基因中互补位置的所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体。
15.根据权利要求14所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，由所述聚合酶引起的所述引物的延长在50℃～70℃的温度范围内进行。
16.根据权利要求15所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述聚合酶在50℃～65℃的温度范围内被活性化。
17.根据权利要求14所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，从所述复合体分解出的所述第一荧光体不会被所述第一猝灭体猝灭。
18.根据权利要求14所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因，或者在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因但在所述靶基因中互补的位置上没有杂化有所述复合体的情况下，所述复合体不会通过具有所述5'外切核酸酶活性的聚合酶而被分解。
19.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，包含于所述第三探针的所述第二荧光体和所述第二猝灭体布置在相邻的位置，从而以所述第二荧光体能够被所述第二猝灭体猝灭的二级结构的形态存在。
20.根据权利要求19所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在发生所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性的温度下，所述第三探针以二级结构被解开的状态存在。
21.根据权利要求20所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在发生所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性的温度下，所述第二荧光体不会被所述第二猝灭体猝灭。
22.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探针的二级结构意指所述第二荧光体和所述第二猝灭体布置在相邻位置的形态以便所述第二荧光体被所述第二猝灭体猝灭，在从所述步骤(c)释放的所述第二探针杂化到所述第三探针之前，所述第三探针以二级结构被解开的状态存在。
23.根据权利要求22所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，从所述步骤(c)释放的所述第二探针被杂化到以二级结构被解开的状态存在的所述第三探针之后，所述第二探针通过所述聚合酶而在所述第三探针上延长，从而维持为所述第三探针的二级结构解开的状态。
24.根据权利要求23所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述第三探针的二级结构被解开的状态下，所述第二荧光体不会被所述第二猝灭体猝灭。
25.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步骤(d)之后，还包括降低温度致使所述第三探针的二级结构恢复的步骤，在所述步骤中，所述第三探针中没有与所述第二探针杂化的第三探针的二级结构得到恢复，从而所述第二荧光体被所述第二猝灭体猝灭，所述第三探针的二级结构意指所述第二荧光体和所述第二猝灭体布置在相邻位置的形态以便所述第二荧光体被所述第二猝灭体猝灭。
26.根据权利要求25所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探针的二级结构能够得到恢复的温度为50℃以下。
27.根据权利要求26所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步骤(d)之后，所述第三探针通过在50℃以下的温度内5秒以上的稳定化而恢复二级结构。
28.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在同一个生物物质检测用元件内以多次反复循环的方式依次进行所述步骤(c)至步骤(e)。
29.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在同一个生物物质检测用元件内以多次反复循环的方式独立地进行所述步骤(c)至步骤(e)。
30.根据权利要求28或29所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，通过第一次循环中的步骤(c)而从所述复合体中分解并释放的第二探针在第二次循环中的步骤(c)的杂化反应温度下杂化到固定于所述生物芯片的所述第三探针。
31.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，通过荧光测量仪实时地进行所述步骤(e)。
32.根据权利要求30所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述元件部结合于所述反应容器的状态下通过所述荧光测量仪来实时地进行所述步骤(e)。
33.根据权利要求28或29所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，第一荧光信号及第二荧光信号的强度随着所述反复循环的次数的增加而增加。
34.根据权利要求31所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一荧光信号及第二荧光信号被同时检测。
35.根据权利要求34所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步骤(d)之后，在所述第三探针中没有与所述第二探针杂化的第三探针的二级结构恢复之后，同时检测所述第一荧光信号及第二荧光信号，所述第三探针的二级结构意指所述第二荧光体和所述第二猝灭体布置在相邻位置的形态以便所述第二荧光体被所述第二猝灭体猝灭。
36.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一荧光体及第二荧光体产生在互不相同的波长带下检测到的荧光信号。
37.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一荧光体及所述第二荧光体中的至少一个包含用于产生在互不相同的波长带下检测到的荧光信号的多个荧光物质。
38.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，通过沿所述盖的上部方向进行的直线型荧光信号检测方法而检测所述第一荧光信号及第二荧光信号。
39.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，通过沿针对所述生物芯片的表面具有一定的倾斜的方向进行的倾斜性荧光信号检测方法来检测所述第一荧光信号及第二荧光信号。
40.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，通过在所述生物芯片的侧面方向上利用二向色性物质来进行的侧面型荧光信号检测方法来检测所述第一荧光信号及第二荧光信号。
41.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述盖由透光率为50％以上的物质形成。
42.根据权利要求41所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述盖由选自玻璃、石英、煅制氧化硅、丙烯酸、聚碳酸酯、环烯烃共聚物和环烯烃聚合物中的至少一个物质来形成。
43.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述杆由具有9.0x 10-6/m·K以下的热膨胀系数的物质形成。
44.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述方法是在能够自动控制反应温度、反应时间以及反复循环次数的温度循环装置内进行。
45.根据权利要求44所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应温度、反应时间以及反复循环次数在所述元件部结合于所述反应容器的状态下能够被所述温度循环装置自动地控制。
46.根据权利要求44所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述温度循环装置还包括荧光测量仪。
生物物质的实时定量及定性分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物物质的实时定量及定性分析方法，尤其涉及在同一个空间内合并进行实时聚合酶链反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)及DNA微阵列而能够进行生物物质的实时定量及定性分析的方法。
背景技术
[0002] 当前在分子诊断中广泛施行的分析物质的靶基因检查方法大体上有定量方法(quantitative method)和定性方法(qualitative)。
[0003] 定量方法是相对地测量或者绝对地测量靶基因的表达程度和基因个数(copy number)的方法。另一方面，定性方法是分析靶基因的存在与否以及基因型(genotyping)的方法。
[0004] 作为定量检查的方法有利用实时PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)的方法。利用实时PCR的检查方法具有能够进行定量分析的优点，而且利用实时PCR的检查方法可在试剂混合之后不开封试管的情况下获得基因扩增信号，从而具有能够减少由空气引起的污染危险的优点，因此被广泛使用。然而，难以进行在一个试管内可同时确认的荧光数量为最多6个不同种类以上，因而在需要检查数十个基因变异和基因型的领域的情况下，存在需要分配多个试管来进行检查的难点。
[0005] 作为定性检查的对靶的方法有利用DNA微阵列的方法。对于利用DNA微阵列的检查方法而言，在表面固定多个靶探针，从而具有一次用一个种类的荧光能够检查多样的基因型的优点，然而却存在不能进行定量分析的局限性。
[0006] 最近，正在研究弥补这样的定性检查或定量检查的缺点的定量及定性检查方法。作为这种研究的环节开发出了如下种技术，即，在一个容器内以实时PCR进行定量分析，并将扩增的基因与固定于同一容器的固体底面的探针进行反应，由此使多重分析变为可能。
然而，对于所述技术而言，存在为了获取探针信号，在开封容器或清洗容器后，需要利用专门的扫描器读取信号的局限性。
[0007] 作为现有技术有韩国公开专利公报第10-2010-0102560号(2010.09.24.公开)，在上述文献中公开有实时核酸分析合并装置及利用该装置的靶核酸的检测方法。
发明内容
[0008] 技术问题
[0009] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可从固定有探针的生物芯片同时进行反应产物的定量及定性分析的方法，所述探针用于对在单一反应容器内利用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)而被扩增的反应产物进行定量和定性分析及鉴别靶基因。
[0010] 技术方案
[0011] 根据本发明的一方面可提供一种生物物质的实时定量及定性分析方法，包括如下步骤：(a)准备生物物质检测用元件，该生物物质检测用元件包括上部形成有开口部的反应容器和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器的元件部，其中所述元件部包括结合于所述反应容器的开口部的盖和朝所述盖的下部延伸而形成的杆，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片；(b)向所述反应容器内添加包含第一探针-第二探针复合体、正向引物、反向引物、碱磷酸去氧核苷酸(dNTP，deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液的反应溶液，其中，所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体，所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；(c)进行包含所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应，其中，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，从所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体；(d)被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长，其中，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体，随着所述第二探针在所述第三探针上延长，第二猝灭体从所述第二荧光体分开而产生发光；以及(e)检测由所述第一荧光体引起的第一荧光信号以及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。
[0012] 发明效果
[0013] 根据本发明的一个实施例的生物物质的实时定量及定性分析方法，可消除根据基因型而需要数个至数十个反应容器(管)的现有技术的不便性和非经济型。
[0014] 此外，本发明通过在单个反应容器内实时地合并进行实时PCR及DNA微阵列而能够同时进行定量及定性分析。这也可以消除难以应用于定量分析的DNA微阵列的缺点。
[0015] 尤其，根据本发明的生物物质的实时定量及定性分析方法具有如下效果：在反应容器内实时地获取DNA芯片信号，从而可在不开封容器或不清洗容器的情况下进行定量及定性分析，而且在包括感染性疾患检查、耐药性、体细胞突变、单一碱基变异等多种分子诊断领域中，可一次性地、经济地、可靠地、同时执行定量分析和基因型检查。
[0016] 因此，根据本发明的生物物质的实时定量定性分析方法不限于原来是定量分析的还是基因型检查的检查种类，可以在分子诊断的整个领域中容易使用的优点。
附图说明
[0017] 图1为概略地示出根据本发明的一个实施例的生物物质检查元件的反应容器的图。
[0018] 图2为概略地示出根据本发明的一个实施例的生物物质检测元件的元件部的图。
[0019] 图3为示出根据本发明的一个实施例的反应容器与元件部结合的生物物质检测元件的图。
[0020] 图4为概略地示出根据本发明的一个实施例的生物物质检测元件内的反应的图。
[0021] 图5为示出根据本发明的一个实施例中所使用的聚合酶的活性温度的图。
[0022] 图6为示出在本发明的一个实施例中所进行的实时PCR的延长温度条件的图。
[0023] 图7为与根据本发明的一个实施例的第三元件部相关而示出按照温度变化的第二荧光信号的变化的图。
[0024] 图8为与根据本发明的一个实施例的第三元件部相关而示出按照时间变化的第二荧光信号的变化的图。
[0025] 图9和图10为概略地示出根据本发明的一个实施例的生物物质的实时定量及定性分析过程的图。
[0026] 图11至图13为示出荧光信号检测方法的示例的图，其中图11为示出直线型(trans type)荧光信号检测方法的图，图12为示出倾斜型(oblique type)荧光信号检测方法的图，图13为示出侧面型(epi type)荧光信号检测方法的图。
具体实施方式
[0027] 为了更加容易理解本发明，为方便起见在本申请中定义特定术语。除非在本申请中另外进行定义，否则本发明所使用的科学术语以及技术术语具有本领域技术人员通常所理解的意思。此外，除非在上下文中特别指定，否则应当被理解为单数形态的术语也包含复数形态，复数形态的术语也包含单数形态。
[0028] 此外，对于构成本发明所公开的任意的方法的各个步骤而言，除非明确地说明为不同，否则并不表示必须要按照所记载的顺序准确地进行，而且为了实现本发明的目的，可在本发明的技术思想的范围内进行多样地修改和变更。
[0029] 以下，将详细说明根据本发明的一个实施例的生物物质的定量及定性分析方法。
[0030] 根据本发明的一个方面可提供生物物质的实时定量及定性分析方法，包括如下步骤：(a)准备生物物质检测用元件，该生物物质检测用元件包括上部形成有开口部的反应容器和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器的元件部，其中所述元件部包括结合于所述反应容器的开口部的盖和朝所述盖的下部延伸而形成的杆，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片；(b)向所述反应容器内添加包含第一探针-第二探针复合体、正向(forward)引物、反向(reverse)引物、碱磷酸去氧核苷酸(dNTP：deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液的反应溶液，其中所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体，所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；(c)进行包含所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，从所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体；(d)被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长，其中，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体，随着所述第二探针在所述第三探针上延长，第二猝灭体从所述第二荧光体分开而产生发光；以及(e)检测由所述第一荧光体引起的第一荧光信号以及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。
[0031] 首先，公开准备用于应用在根据本发明的一个实施例的生物物质的实时定量及定性分析方法的生物物质检测用元件的步骤(步骤(a))。
[0032] 参照图1至图3，所述生物物质检测用元件200包括上部形成有开口部的反应容器210和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器210的元件部220，其中所述元件部220包括结合于所述反应容器210的开口部的盖221和朝所述盖221的下部延伸而形成的杆222，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片223。
[0033] 此时，所述杆222朝下部延伸形成使其在以后的步骤(b)中向所述反应容器210内添加反应溶液240时具有使所述生物芯片223能够浸渍于所述反应溶液的长度。
[0034] 所述生物芯片223可设置于选自所述杆222的外周面和下部的至少一个区域，在此，设置所述生物芯片223的至少一个区域位于能够浸渍于所述反应溶液的位置。
[0035] 在一个实施例中，所述盖221可由透光率为50％以上的物质形成。此时，如直线型(trans type)荧光信号检测方法那样能够在不开放盖的状态下以所述盖221上部方向检测荧光信号。更具体地，所述盖221可由选自玻璃、石英、煅制氧化硅(Fumed Silica)、丙烯酸、聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)和环烯烃聚合物(COP)中的材料形成。
[0036] 在另一实施例中，如倾斜性(oblique type)荧光信号检测方法或侧面性(epi type)荧光信号检测方法那样不会从所述盖221的上部方向检测荧光信号的情况下，所述盖221的透光率没有必要是50％以上。
[0037] 并且，在一个实施例中，所述杆222可由具有9.0x 10-6/m·K以下的较低的热膨胀系数的物质形成。如果所述杆222的热膨胀系数超过9.0x 10-6/m·K，则整体上的元件部的耐久性降低，且有可能发生故障。优选地，所述杆222可由具有5.5x 10-7/m·K～9.0x 10-6/m·K以下的较低的热膨胀系数的物质形成。这是因为考虑到如下情形，即，如果杆的热膨胀系数过低，则由于随着温度变化而与其他元件的热膨胀系数之间的差异的存在，从而就精确检测荧光而言可能变得困难。具有这种热膨胀系数的材料的非限制性的示例有石英、煅制氧化硅、选自COC及COP中的至少一个高分子。
[0038] 在一个实施例中，所述杆222具备其表面固定有所述第三探针的生物芯片223。此时，所述第三探针可根据5'末端或3'末端的高分子物质而直接或间接地固定于所述生物芯片223。优选地，所述第三探针的5'末端或3'末端的高分子物质可以是聚-T尾部(poly-T tail)或聚-A尾部(poly-A tail)。并且，所述高分子物质的末端，即固定于所述生物芯片223的部分，可根据所述生物芯片223的特性而改性为特定官能团之后使用。
[0039] 例如，所述生物芯片223由醛(CHO)涂层基板、异硫氰酸酯(isothiocyanate)(NCS)涂层基板、环氧化物涂层基板、羧化基板或磷酸化基板构成的情况下，可将所述第三探针的聚-T尾部或聚-A尾部的末端，即，固定于所述生物芯片223的部分胺化而使其固定于所述基板。另一方面，所述生物芯片223由胺化基板构成的情况下，可将所述第三探针的聚-T尾部或聚-A尾部的末端，即，固定于所述生物芯片223的部分羧化或磷酸化而使其固定于所述基板。
[0040] 如上所述，在根据本发明的一个实施例的方法中，步骤(a)的目的在于提供一种通过在一个单个反应容器内实时地合并进行实时PCR及DNA微阵列而能够同时进行定量及定性分析的生物物质检测用元件200。
[0041] 在使用所述生物物质检测用元件200的情况下，可在所述元件部220结合于所述反应容器210的状态，即所述生物物质检测用元件200没有被开放的状态下合并进行实时PCR及DNA微阵列。而且，在以多次的反复循环进行实时PCR及DNA微阵列的期间，所述生物物质检测用元件200也以所述元件部220结合于所述反应容器210的状态，即，所述生物物质检测用元件200没有被开放的状态存在，因此可由外部的污染因子隔绝，从而可以去掉需要反复清洗所述生物物质检测用元件200的必要性。
[0042] 接着，公开向所述反应容器210内添加反应溶液的步骤(步骤(b))。此时，在所述步骤(b)中，将所述反应溶液添加至使设置于所述杆222的所述生物芯片223，更具体地，固定(附着)于所述生物芯片223的第三探针能够充分地浸渍于所述反应溶液中。
[0043] 此外，在选自所述杆222的外周面和下部中的至少一个区域中设有多个所述生物芯片223的情况下，将所述反应溶液添加至使设置所述生物芯片223的至少一个区域，更具体地使固定(附着)在设置于所述至少一个区域的所述多个生物芯片223的所有的第三探针能够充分地浸渍于所述反应溶液中。在此，在所述反应溶液(水溶性相)内进行实时PCR反应，而在固定于所述生物芯片223的第三探针(固体表面相)中进行DNA微阵列。
[0044] 所述反应溶液包含第一探针-第二探针复合体、正向(forward)引物、反向(reverse)引物、碱磷酸去氧核苷酸(dNTP：deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液。
[0045] 所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体。
[0046] 所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列。
[0047] 此时，对于所述第一探针及第二探针的长度而言，能够与各个靶基因及第三探针形成适宜的二聚体(dimer)的程度的长度即可，其长度不受特别限制。例如，所述探针的大小可在15mer～50mer之间适宜地选择，但不是必须受限于此。
[0048] 此外，所述第一探针及所述第二探针将相同或不同的靶基因设定为靶(target)，从而可构成为包含互不相同的寡核苷酸序列的探针。即，可使用由将所述靶基因的单个或多个靶区域作为目标或者将多个靶基因的单个或多个靶区域作为目标的所述第一探针及第二探针构成的相互不同的复合体。
[0049] 例如，第一探针(X)与第二探针(X)形成复合体，而第一探针(Y)与第二探针(Y)形成复合体。在此，所述第一探针(X)可以与所述靶基因的互补的靶区域(X)进行杂化，且所述第一探针(Y)可以与所述靶基因的互补的靶区域(Y)进行杂化。并且，包含于所述第一探针(X)的所述第一荧光体(X)和包含于所述第一探针(Y)的所述第一荧光体(Y)可包含产生在相互不同的波长带上被检测到的荧光信号的荧光物质。
[0050] 追加地，所述第三探针也可以使用为多个。即，第三探针(X)可以与所述第二探针(X)杂化，且第三探针(Y)可以与所述第二探针(Y)杂化。
[0051] 本申请所使用的术语“探针”表示包含可被杂化于特定核苷酸序列的脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)和核糖核苷酸(ribonucleotide)的自然或变形的单体或具有结合的线性的低聚物。优选地，为了在杂化中的最大效率，探针是单链。探针优选为脱氧核糖核苷酸。
[0052] 本申请所使用的术语“核苷酸”或“多核苷酸”是以单链或双链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，在没有特别提及的情况下，包含自然的核苷酸的类似物。
[0053] 在此，所述反应溶液内第一探针及第二探针以复合体状态存在。所述复合体可以是所述第一探针和所述第二探针直接结合的形态或者是所述第一探针和所述第二探针通过适宜的连接体(linker)连接的形态。
[0054] 所述正向引物及所述反向引物为是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物。
[0055] 本说明书所使用的“引物”表示寡核苷酸，其在诱导互补于核酸链(模板)的引物延长产物的合成的条件(即，诸如核苷酸和DNA聚合酶之类的聚合物的存在以及适宜的温度和PH的条件)下作为起始点而发挥作用。优选地，引物是脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucloetide)且是单链。
[0056] 所述正向引物及所述反向引物(引物对)应具有在聚合酶的存在下能够引发延长产物的合成的程度的长度。引物的适宜的长度根据多种因素，例如，温度、应用领域以及引物的源(source)而存在变数，然而通常可在15mer～50mer之间的范围内进行适宜地选择。
[0057] 所述引物对包含靶-特异性序列(靶-杂化寡核苷酸序列)，在此，靶-特异性序列是指互补于所述样本內靶基因的核酸序列的序列，在所述引物对内位于3'方向。
[0058] 本申请所使用的术语“互补(complementary)”表示具有在某种特定的杂化(hybridization)或退火(annealing)条件下能够选择性地杂化于前述的核苷酸序列的程度的互补性，且表示将实质上互补(substantially complementary)和完全互补(perfectly complementary)的情形均包含在内，然而优选为表示完全互补的情形。
[0059] 优选地，具有所述外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶可具有5'外切核酸酶活性，更优选地，是具有5'外切核酸酶活性的热稳定性聚合酶。在此，热稳定性是指在高温的聚合条件下所述聚合酶稳定，而没有变性，更具体地，在50℃～65℃的温度范围内可维持所述聚合酶的稳定性。因此，所述热稳定性聚合酶在50℃～65℃的温度范围内处于被活性化的状态(参照图5)。
[0060] 所述热稳定性聚合酶可从能够获得热稳定性(DNA)聚合酶的细菌(bacteria)分离并使用，所述细菌有Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis以及Pyrococcus furiosus(Pfu)等。进一步更优选地，具有所述外切核酸酶活性的聚合酶优选具有5'外切核酸酶活性的热稳定性Taq聚合酶。
[0061] 所述样本包括包含靶基因的溶液、体液、血液、细胞、组织以及器官等，但不是必须受限于此。
[0062] 所述反应溶液中具有外切核酸酶活性的聚合酶可以以每反应为在0.1单位(unit)～1单位(unit)的范围内选择的量来使用，所述反应溶液中第一探针-第二探针复合体可以以每反应为在0.5pmole～10pmole的范围内选择的量来使用。随着逐渐增加所述聚合酶及所述复合体各自的使用量，反应性表现为高斯(Gaussian)形态的曲线图，在前述范围内，实时PCR的反应性能够被最大限度地维持。
[0063] 此外，所述反应溶液中所述正向(forward)引物及所述反向(reverse)引物可以以对称或非对称浓度来使用。
[0064] 接着，公开用于扩增所述样本内靶基因的实时PCR步骤(步骤(c))。所述实时PCR步骤包括所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应。
[0065] 在此，将所述变性反应、杂化反应以及延长反应依次进行一次的情形称为1循环，所述实时PCR步骤中所述变性反应、杂化反应以及延长反应可依次进行多次(n)(n循环)。
[0066] 根据所述步骤(c)的实时PCR步骤是在所述生物物质检测用元件200内的反应溶液中进行。
[0067] 首先，所述样本内靶基因的变性反应为如下反应：将所述靶基因的双链(double strand)形态的模板DNA分离为单链(single strand)，以使各个单链形态的模板DNA作为针对所述正方向引物及所述反向引物的模板(template)而发挥作用。所述变性反应可在92℃～98℃的温度范围内进行。
[0068] 在所述双链形态的模板DNA变性为单链形态的模板DNA的情况下，接着，所述正向引物和所述反向引物与各个单链形态的模板DNA进行杂化(或者退火)，所述第一探针-第二探针也杂化到所述各个单链形态的模板DNA的一个区域。
[0069] 本申请所使用的术语“杂化(hybridization)”是指两个单链核酸通过互补的碱基序列的配对(pairing)而形成双链结构(duplex structure)的意思。杂化是在单链核酸序列之间的互补性完整的情况下(完美匹配(perfect match))发生，或者即使存在部分错配序列(mismatch)的碱基也可以引起杂化。杂化所需的互补性的程度可以根据杂化反应条件而变得不同，尤其可以通过温度来调节。
[0070] 此时，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，所述第二探针结合于所述第一探针，但没有杂化到所述靶基因的状态存在。
[0071] 接着，通过具有所述外切核酸酶活性的聚合酶而进行所述引物的延长反应。此时，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，如果所述聚合酶到达至与所述靶基因杂化的所述复合体，则所述聚合酶通过自身的活性来分解所述复合体的情况下，进行延长反应。此时，从所述复合体分解出所述第二探针及所述第一荧光体并将其释放到所述反应溶液内。
[0072] 分解之前所述复合体内的所述第一荧光体被所述第一猝灭体而处于猝灭的状态。只是，如果随着所述复合体通过所述聚合酶而被分解从而释放所述第一荧光体，则所述第一荧光体从猝灭状态脱离，并在相关的波长带下产生第一荧光信号。
[0073] 因此，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述反应溶液内不存在被分解而释放的第二探针及第一荧光体。此外，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述第一荧光体被第一猝灭体而处于猝灭状态，从而不会产生由所述第一荧光体引起的第一荧光信号。
[0074] 相反，在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，在引起所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性之后，所述第一探针-第二探针复合体中的第一探针和所述正向引物及所述反向引物被杂化到所述靶基因中互补的位置，而所述第二探针结合于所述第一探针，但以没有杂化到所述靶基因的状态存在。
[0075] 接着，在所述引物的延长温度下通过具有5'外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶而进行所述引物的延长反应，且在进行所述引物的延长反应的期间，通过所述聚合酶而从杂化于所述靶基因中互补位置的所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体。
[0076] 在此，由所述聚合酶引起的所述引物的延长可在50℃～70℃的温度范围内进行，优选为在55℃～68℃的温度范围内进行，更加优选为在60℃的温度范围内进行。所述引物的延长温度与所述引物的延长效率有直接的关联性(参照图6)。
[0077] 在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因，或者在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因但在所述靶基因中互补的位置上没有杂化有所述复合体的情况下，所述复合体不会通过具有所述5'外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶而被分解。因此，在所述反应溶液内不会存在被分解而释放的第二探针及第一荧光体。即，所述靶基因与所述复合体的杂化成为所述反应溶液内是否存在游离(free)状态的第二探针和第一荧光体的前提条件。
[0078] 因此，在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述靶基因将会随着通过所述步骤(c)的实时PCR的反复次数(循环)而逐渐扩增，且所述靶基因扩增的同时，所述反应溶液内游离状态的第二探针和第一荧光体的量也会增加。
[0079] 所述反应溶液内增加的第一荧光体的量将会增加第一荧光信号的强度。
[0080] 接着，公开由在所述实时PCR反应的结果下释放到所述反应溶液内的所述第二探针引起的在所述生物芯片223中的DNA微阵列步骤(步骤(d))。
[0081] 如前所述，所述生物芯片223的表面固定有所述第三探针。此时，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体。在此，包含于所述第三探针的所述第二荧光体和所述第二猝灭体布置在相邻的位置，从而可以由所述第二猝灭体所述第二荧光体被猝灭的二级结构(例如，环(loop)或发夹(hairpin))的形态存在(分子指示标(molecular beacon))。
[0082] 此时，如上所述，当使用将所述靶基因的多个靶区域作为目标的由所述第一探针及第二探针构成的互不相同的复合体时，在所述样本内存在具有与所述第一探针(X)及第一探针(Y)互补的序列的靶基因的情况下，通过所述步骤(c)的实时PCR结果，从所述多个复合体所述第二探针(X)及第二探针(Y)从所述复合体分解而被释放到所述反应溶液内，且所述第二探针(X)及第二探针(Y)可以与多个第三探针，即，第三探针(X)及第三探针(Y)杂化。
[0083] 所述步骤(d)为在所述步骤(c)中被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长的步骤，所述第二探针在所述第三探针上延长，从而所述第三探针的二级结构被解开，由此，所述第二荧光体从由于所述第二猝灭体而所处在的猝灭状态脱离出来。
[0084] 为了更详细说明所述步骤(d)而对所述步骤(c)和步骤(d)的关系进行说明，则通过所述步骤(c)的实时PCR和通过所述步骤(d)的DNA微阵列可在一个单一(同一个)生物物质检测用元件200内可以以多次反复循环的方式依次或独立地进行。即，所述步骤(c)和步骤(d)无需一定要依次进行。
[0085] 即，根据第一次循环下的步骤(c)而第二探针从所述复合体中分解出来并被释放到所述反应溶液内之后，所述第二探针在第二次循环下的步骤(c)的杂化反应温度下与固定于所述生物芯片223的所述第三探针杂化。
[0086] 在实时PCR的第一次循环结束而所述第二探针被释放到所述反应溶液内的状态下开始进行实时PCR的第二次循环，且在发生所述第二次循环的变性反应(靶基因的双链形态的模板DNA的变性)的温度条件下所述第三探针以自身的二级结构被解开的状态存在。即，在发生所述第二次循环的变性反应的温度条件下，包含于所述第三探针的所述第二荧光体以没有被所述第二猝灭体猝灭的状态存在。
[0087] 然后，在发生所述实时PCR的第二次循环的杂化反应的温度条件下，所述第二探针杂化到所述第三探针的互补的区域，且在发生由所述聚合酶引起的延长反应的温度条件下，所述第二探针在所述第三探针上延长，由此所述第三探针可维持为二级结构解开的状态。
[0088] 如上所述，在进行所述步骤(c)的温度条件下，所述第三探针是所述第二探针杂化到所述第三探针后延长从而与将所述第三探针的二级机构维持为解开状态与否无关，均以二结构被解开的状态存在，因此包含于所述第三探针的所述第二荧光体以没有被所述第二猝灭体猝灭的状态存在。
[0089] 因此，在所述步骤(d)之后，还可包括降低温度致使所述第三探针的二级结构恢复的步骤，在所述步骤中，所述第三探针中所述第二探针没有被杂化而延长的第三探针的二级结构得到恢复，从而所述第二荧光体可再次被所述第二猝灭体猝灭。即，所述追加的步骤为第二荧光体的猝灭步骤，从而可以排除以在所述第三探针上没有延长第二探针的状态产生的第二荧光体的非特异性第二荧光信号。
[0090] 此时，可恢复所述第三探针的二级结构的温度为50℃以下(参照图7)。即，优选地，被设计为在50℃以下的温度下能够恢复所述第三探针的二级结构。更具体的说明，则所述第三探针包括所述第二荧光体及第二猝灭体，且所述第二荧光体是以用于通过存在于相邻位置的所述第二猝灭体而被猝灭的状态存在的二级结构形态存在，所述第三探针可以是以在发生所述靶基因的双链形态的模板DNA的变性的温度条件下被解开的状态存在的二级结构形态存在。此外，以二级结构被解开的状态存在的所述第三探针在处于没有杂化而延长的所述第二探针的状态的情况下，在50℃以下的温度条件下使得能够再次恢复所述二级结构的方式存在。
[0091] 所述第三探针在没有杂化而延长的所述第二探针的状态下随着温度的减小可以恢复原来的二级结构，在56℃以下的温度下第二荧光信号开始减少，优选为在50℃以下的温度下达到完全猝灭状态，更加优选为在48℃以下的温度下达到完全猝灭状态。
[0092] 此外，可恢复所述第三探针的二级结构的时间条件为，在所述温度范围内可以是5秒以上(参照图8)。处于没有杂化并延长的所述第二探针的状态的第三探针将会随着50℃以下的温度维持时间而逐渐丧失第二荧光信号，此时的温度维持时间为3秒以上，优选为5秒以上。
[0093] 根据所述追加的第三探针的猝灭步骤，在所述反应溶液内不存在游离(free)第二探针的情况下，不会从所述第三探针产生由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。
[0094] 最后，公开用于检测从所述生物物质检测用元件产生的第一荧光信号及第二荧光信号的步骤(步骤(e))。所述第一荧光信号从所述第一荧光体产生，所述第二荧光信号从所述第二荧光体产生。此时，所述第一荧光体及所述第二荧光体全部应当以没有被各自的猝灭体猝灭的状态存在。
[0095] 所述步骤(e)是在所述元件部220结合于所述反应容器210的状态下通过所述荧光测量仪实时地进行的。此时，所述步骤(e)，优选地，在所述步骤(d)之后所述第三探针中没有与所述第二探针杂化的第三探针的二级结构得到恢复之后，同时检测所述第一荧光信号及第二荧光信号(参照图9)。
[0096] 在此，虽然所述第一荧光信号的检测优选与第二荧光信号的检测同时进行，但是为了提高检测效率，在专门的时期，相互独立地进行针对各自的荧光信号的检测。即，在一次性地检测根据所述步骤(c)的实时PCR而从所述复合体分解并释放的所述第一荧光体产生的所述第一荧光信号之后，经过所述步骤(d)和所述第三探针的追加的猝灭步骤而以所述第二探针杂化并延长于所述第三探针的状态存在的情况下，可以二次性的检测由包含于所述第三探针的所述第二荧光体产生的所述第二荧光信号(参照图10)。
[0097] 在所述样本内存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，第一荧光信号及第二荧光信号的强度随着反应的反复循环的次数的增加而增加。此外，在所述元件部220结合于所述反应容器210的状态下可通过所述荧光测量仪而同时检测所述第一荧光信号及第二荧光信号。此时，优选地，所述第一荧光体及第二荧光体产生在互不相同的波长带下检测到的荧光信号。
[0098] 此外，在其他实施例中，为了增加定量及定性分析灵敏度，所述第一荧光体及所述第二荧光体中的至少一个构成为包含用于产生在互不相同的波长带下检测到的荧光信号的多个荧光物质。
[0099] 例如，所述荧光信号是通过所述生物物质检测用元件200的上部由相机来获取图像来获得的，此时如上所述，通过多种探针的设计能够进行多重分析，且荧光信号与基因扩增成比例地变化，从而可进行定量定性分析。
[0100] 在一个实施例中，所述第一荧光信号及第二荧光信号可通过沿所述盖的上部方向进行的直线型(trans type)荧光信号检测方法来检测(参照图11)，在另一实施例中，所述第一荧光信号及第二荧光信号可通过沿针对所述生物芯片的表面具有一定的倾斜的方向进行的倾斜性(oblique type)荧光信号检测方法来检测(参照图12)，在又一实施例中，所述第一荧光信号及第二荧光信号可通过在所述生物芯片的侧面方向上利用二向色性物质(dichroic material)来进行的侧面型(epi type)荧光信号检测方法来检测(参照图13)。
[0101] 根据本发明的一个实施例的方法可在能够自动控制反应温度、反应时间以及反复循环次数的温度循环装置(thermal cycler)内进行。此时，所述反应温度、反应时间以及反复循环次数可在所述元件部220结合于所述反应容器210的状态下被所述温度循环装置自动地控制。此外，所述温度循环装置还包括荧光测量仪，从而可在一个装置内进行生物物质的实时定量及定性分析。
[0102] 以上，对本发明的一个实施例进行了说明，但是对于本领域中具有通常知识的技术人员而言，在不脱离权利要求书所记载的本发明的思想的范围内，可通过构成要素的增加、变更、删除或追加等来多样地修改及变更本发明，且这也包含于本发明的权利范围。
