通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法

摘要

本发明公开了一种通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，以干燥成熟的刺果甘草种子为材料，通过种子前处理、取得无菌苗、最佳诱导愈伤组织的培养基筛选、秋水仙素处理刺果甘草愈伤组织、继代培养。通过秋水仙素诱导刺果甘草种子使染色体加倍，得到了甘草的优质种源，缓解了甘草市场供不应求的局面。

权利要求

1.一种通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于它包括如下步骤：A、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子，用98%浓硫酸浸泡39-41min后消毒；

B、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗3-4次，接种到以MS培养基为基质的瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到6-10cm时备用；

C、培养的健壮愈伤组织：将步骤B中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理；

D、处理刺果甘草愈伤组织：取步骤C培养的健壮愈伤组织，用0.05—0.2%浓度的秋水仙素处理16—24h；

E、继代培养：将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养；

上述玉米素混合培养基的组成为MS培养基、浓度为0.5mg/L的生长素萘乙酸和浓度为

0.8mg/L6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤，在此基础上加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮0.5g/L，保持pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：上述步骤A种子前处理中，甘草种子浸泡后，用 1%氯化汞消毒10min。

3.根据权利要求1或2所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：步骤D中对刺果甘草愈伤组织用0.2%浓度的秋水仙素处理24h。

4.根据权利要求3所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：对步骤E继代培养的刺果甘草组织进行染色体倍性检测，具体步骤如下：取新生的愈伤组织于

0.02%秋水仙素和0.002mol/L 8-羟基喹啉混合液中预处理2.5 h，冲洗干净，后用比例为3∶

1的乙醇-冰醋酸固定液固定2 h；再用混合酶液在25℃恒温箱内处理3 h；用蒸馏水浸泡

30min，去除蒸馏水后，再加入固定液固定半小时后制备细胞悬液，制片检测。

说明书

通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法。

背景技术

[0002] 刺果甘草（Glycyrrhiza pallidiflora Max.），别名野甘草、胡苍耳等，为豆科蝶形花亚科甘草属多年生半灌木植物。刺果甘草以根及种子入药，具有催乳、杀虫、止泻、抗癌等功效，长期被作为替代甘草药材的重要植物资源之一。多年来人们对甘草进行了广泛而深入的研究，但多集中在栽培、有效成分和药理药效研究等方面。

[0003] 近年来，由于甘草在制药业、食品业和化妆品业等的用量急剧增加，而多年来甘草药材主要依靠野生资源，由于对甘草的无节制采挖，使我国甘草资源遭到了严重破坏。虽然人工栽培甘草在国内已得到广泛推广，但有效成分较低，用药效果较差。因此，为了保护野生甘草资源，探寻和发现甘草的优质种源和甘草的替代资源变得迫在眉睫。

[0004] 对于刺果甘草染色体加倍的研究鲜有报道，吴玉香等人虽然采用改良琼脂涂抹法和直接滴渗法处理刺果甘草幼苗顶芽进行多倍体的诱变，但方法较麻烦，花时间较长。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法。

[0006] 一种通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，包括如下步骤：

[0007] A、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子，用98%浓硫酸浸泡39-41min后消毒；

[0008] B、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗3-4次，接种到以MS培养基为基质的瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到6-10cm时备用；

[0009] C、培养的健壮愈伤组织：将步骤B中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理；

[0010] D、处理刺果甘草愈伤组织：取步骤C培养的健壮愈伤组织，用0.05—0.2%浓度的秋水仙素处理16—24h；

[0011] E、继代培养：将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养。

[0012] 优选的，所述玉米素混合培养基的组成包括MS培养基、浓度为0.5mg/L的生长素萘乙酸和浓度为0.8mg/L6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤，在此基础上加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮0.5g/L，保持pH值为5.8。

[0013] 优选的，上述步骤A种子前处理中，甘草种子浸泡后，用 1%氯化汞消毒10min。

[0014] 优选的，步骤D中对刺果甘草愈伤组织用0.2%浓度的秋水仙素处理24h。用0.2%秋水仙素处理24h的诱变率甚至高达100%。

[0015] 优选的，对步骤E继代培养的刺果甘草组织进行染色体倍性检测，具体步骤如下：取新生的愈伤组织于0.02%秋水仙素和0.002mol/L 8-羟基喹啉混合液中预处理2.5 h，冲洗干净，后用比例为3∶1的乙醇-冰醋酸固定液固定2 h；再用混合酶液在25℃恒温箱内处理
3 h；用蒸馏水浸泡30min，去除蒸馏水后，再加入固定液固定半小时后制备细胞悬液，制片检测。

[0016] 本发明采用秋水仙素处理诱导甘草属植物种子产生愈伤组织和四倍体的刺果甘草植株，得到了甘草的优质种源，缓解了甘草市场供不应求的局面。

附图说明

[0017] 图1是秋水仙素处理对刺果甘草染色体数的鉴定图。

具体实施方式

[0018] 下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0019] 实施例中玉米素混合培养基的组成包括MS培养基、浓度为0.5mg/L的生长素萘乙酸（NAA）和浓度为0.8mg/L6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤，在此基础上加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮（PVP）0.5g/L，保持pH值为5.8。

[0020] 实施例1

[0021] 1、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子经沙磨处理后用98%浓硫酸浸泡40min，用 1%升汞消毒10min。

[0022] 2、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗4次，接种到以MS培养基为基质的锥形瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到8cm时备用。

[0023] 3、将步骤2中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，置于人工气候箱内，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理。其出愈率最高可达90.45%，且质地疏松，生长状况良好。

[0024] 4、取上步骤培养的健壮愈伤组织，用0.2%浓度的秋水仙素分别处理24h。

[0025] 5、将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养，待生长出新的愈伤组织进行染色体倍性研究。

[0026] 6、对继代培养的刺果甘草组织进行染色体倍性检测：取新生的愈伤组织于0.02%秋水仙素和0.002mol/L 8-羟基喹啉混合液中预处理2.5 h，用蒸馏水冲洗干净，后用乙醇-冰醋酸（3∶1）固定液固定2h；再用混合酶液在25℃恒温箱内处理3 h；用蒸馏水浸泡30min，去除蒸馏水后，再加入固定液固定半小时，后制备细胞悬液。用悬滴法制片，干燥后用改良苯酚品红染色3min，常规压片，冰冻后揭去盖玻片，自然干燥，中性树胶封片，用Olympum Bx61观察并采集图像，实施例1处理下的诱变率高达100%。

[0027] 实施例2

[0028] 1、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子经沙磨处理后用98%浓硫酸浸泡41min，用 1%升汞消毒10min。

[0029] 2、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗3次，接种到以MS培养基为基质的锥形瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到10cm时备用。

[0030] 3、将步骤2中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，置于人工气候箱内，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理。其出愈率最高可达90.45%，且质地疏松，生长状况良好。

[0031] 4、取在玉米素混合培养基上培养的健壮愈伤组织，用0.05%浓度的秋水仙素分别处理16h。

[0032] 5、将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养，待生长出新的愈伤组织进行染色体倍性研究。

[0033] 6、待诱导出绿色颗粒状愈伤组织后，取新生的愈伤组织于0.02%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合液中预处理2.5 h左右，用蒸馏水冲洗干净，后用乙醇—冰醋酸（3∶1）固定液固定2 h；再用混合酶液在25℃恒温箱内处理3 h；倒去酶液，用蒸馏水浸泡30 min，去除蒸馏水后，再加入固定液固定半小时，后制备细胞悬液。用悬滴法制片，干燥后用改良苯酚品红溶液染色2min，常规压片，冰冻后迅速揭去盖玻片，自然干燥，中性树胶封片，用Olympum Bx61观察并采集图像，统计染色体的变异数，实施例2处理下的诱变率为76%。

[0034] 实施例3

[0035] 1、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子经沙磨处理后用98%浓硫酸浸泡39min，用 1%升汞消毒10min。

[0036] 2、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗4次，接种到以MS培养基为基质的锥形瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到6cm时备用。

[0037] 3、将步骤2中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，置于人工气候箱内，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理。其出愈率最高可达90.45%，且质地疏松，生长状况良好。

[0038] 4、取在玉米素混合培养基上培养的健壮愈伤组织，用0.1%浓度的秋水仙素分别处理20h。

[0039] 5、将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养，待生长出新的愈伤组织进行染色体倍性研究。处理后的诱变率可达86.7%。

[0040] 试验例1

[0041] 用实施例1方法处理刺果甘草种子，与实施例1不同之处在于取在玉米素混合培养基上培养的健壮愈伤组织，不用秋水仙素处理24h以上。将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养，待生长出新的愈伤组织进行染色体倍性研究。处理后的诱变率为0%。

[0042] 表1示出了秋水仙素对刺果甘草愈伤组织染色体倍性的影响，说明用浓度为0.2%的秋水仙素处理24h，诱变率可高达100%。

[0043] 表2示出了秋水仙素处理下刺果甘草种子染色体变异率，以0.05%浓度处理16h时诱变率最低，为7.5%；0.2%浓度处理24h的诱变率最高，为88.64%。

[0044] 图1示出了不同浓度、不同时间秋水仙素处理对刺果甘草染色体数的鉴定，说明用浓度为0.2%的秋水仙素处理24h，染色体数目最多。

[0045] 除了上述实施例中用秋水仙素处理刺果甘草无菌苗外，用秋水仙素直接处理刺果甘草种子的分析如下：取种子萌发后产生幼苗的下胚轴诱导愈伤组织，当秋水仙素浓度达0.2%处理24h时的诱导率最低，诱导率为10%，而且使用秋水仙素处理后刺果甘草种子染色体愈伤组织诱导率均有下降，说明秋水仙素对刺果甘草染色体愈伤组织诱导率有抑制作用。

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