硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法

摘要

本发明硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，涉及化学化合物的抗植物病毒剂，该方法步骤如下：A.所述的硫脲化合物为具有如下通式(Ⅰ)所示结构的化合物：B.上述硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，步骤是：烟草花叶病毒提纯及浓度测定；选定硫脲化合物药剂溶液的配制；离体作用；活体保护作用；活体治疗作用；活体钝化作用。该类化合物用于防治烟草花叶病毒造成的病害的活性好于现有技术的化合物和药物，而且该类化合物生产成本低，可以在农业上得到广泛应用。

权利要求

1.硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，其特征在于步骤如下：A.所述的硫脲化合物为具有如下所示结构的化合物：

B.上述硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，步骤如下：

第一步，烟草花叶病毒提纯及浓度测定：

烟草花叶病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒SOP规范执行，病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，于4℃冷藏备用；

第二步，选定硫脲化合物药剂溶液的配制：

称量上述Ia-8、Ib-1、Ic-1、Ic-4和Ic-5硫脲化合物中的一个40mg作为原药，然后在该原药加入0.4mL DMF进行溶解，制得1×105μg/mL母液，再用质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液稀释至测试浓度500μg/mL或100μg/mL，由此配制得硫脲化合物药剂溶液；

第三步，离体作用：

摩擦接种3–5叶期珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/mL，收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于质量百分比浓度为1‰的吐温80水溶液及第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次，3天后记录病斑数，计算防效；

第四步，活体保护作用：

选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，24h后，叶面撒布500目的金刚砂，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/mL，接种后用流水冲洗，3天后记录病斑数，计算防效；

第五步，活体治疗作用：

选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/mL，接种后用流水冲洗，叶面收干后，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后记录病斑数，计算防效；

第六步，活体钝化作用：

选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，将第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/mL，接种后即用流水冲洗，重复3次，设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后数病斑数，计算结果。

说明书

硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法

技术领域

[0001] 本发明的技术方案涉及化学化合物的抗植物病毒剂，具体地说是硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法。

背景技术

[0002] 植物病毒广泛分布于自然界中，它们对农作物的生长造成严重的危害，进而对现代农业生产造成重大损失，烟草花叶病毒(TMV)作为一种病原体能对多种作物造成危害。据统计，它能侵染22种单子叶植物的约198种个体，能够造成大约5％到90％不等的损失(Hari,V.；Das,P.Ultra microscopic detection of plant viruses and their gene products.In plant disease virus control.Hadidi,A.；Khetarpal,R.K.；Koganezawa,H.,Eds.；APS Press:St.Paul,MN,1998:417-427.)到目前为止，还没有一种化学农药能够彻底保护作物免受TMV的侵害。同样，也没有一种药物能够完全治愈被TMV侵害的作物。

[0003] 现有技术中，病毒唑(Ribavirin)，作为一种比较成功的植物病毒抑制剂，被广泛的用于防治烟草花叶病毒造成的病害，但是，该药物在500μg/mL浓度下的对烟草花叶病毒的离体活性、活体钝化、活体治疗和活体保护中的抑制率还不到50％；从微生物发酵产生的宁南霉素用药量为500μg/mL时对烟草花叶病毒的治疗效果只有54％左右；文献【Mei-hang Chen,Zhuo Chen,Bao-an Song,*Pinaki S.Bhadury,Song Yang,Xun-jian Cai,De-yu Hu,Wei Xue,Song Zeng.Synthesis and antiviral activities of chiral thiourea derivatives containing anα-aminophosphonate moiety.J.Agric.Food Chem.,2009,57(4),1383-1388】报道了含α-膦酸酯的手性硫脲衍生物及其制备方法和用途，其中部分化合物在浓度为500μg/mL时对烟草花叶病毒的治疗效果(抑制率为54.8％)，相同测试条件下，还低于对照药宁南霉素(抑制率为56.2％)；CN 200910102561.1公开了含膦酸酯的手性双硫脲衍生物及其制备方法和用途，相同测试条件下，其中部分化合物在浓度为500μg/mL时对烟草花叶病毒的治疗效果(抑制率为50.8％)还低于对照药宁南霉素(抑制率为55.3％)；文献【闫志坤,蔡学建,杨璇,宋宝安,陈卓,Pinaki S.Bhadury,胡徳禹,金林红,薛伟,卢平.Synthesis and antiviral activities of chiral thiourea,Chinese Journal of Chemistry,2009,27,593-601.)】报道了含茚基手性硫脲化合物用药量为500mg/L时，活体保护、活体钝化和活体治疗的抑制率分别为57.0％，96.4％及55.0％，在相同的测试条件下，商品化品种宁南霉素为55.9％，96.5％，53.9％，虽然保护和治疗作用均稍高于对照药剂宁南霉素，钝化作用与宁南霉素相当，但是该手性硫脲化合物(S)-1-(1-茚基)-3-苯基硫脲的的合成需要原料为(S)-1-氨基茚烷(售价为580元左右/克)及苯基异硫氰酸酯，价格昂贵；总之本技术领域中所用的手性硫脲化合物试剂一般价格都比较高；CN201410344605.2公开了3-芳基-5-甲基丁内酯化合物用作抗植物病毒剂的方法，其存在的缺陷也是对烟草花叶病毒的离体活性、活体钝化、活体治疗和活体保护中的抑制率仍然较低(CN201410344605.2中公开的化合物，治疗效果和保护效果最好的化合物3-(4-氟苯基)-5-甲基-γ-丁内酯的活体治疗和活体保护抑制率分别为57.1％和60.0％，在相同测试条件下商品化品种宁南霉素的活体治疗和活体保护抑制率分别为54％和64％)。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是：提供硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，由此证明该类化合物用于防治烟草花叶病毒造成的病害的活性好于现有技术的化合物和药物，而且该类化合物生产成本低，可以在农业上得到广泛应用。

[0005] 本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，步骤如下：

[0006] A.所述的硫脲化合物为具有如下通式(Ⅰ)所示结构的化合物：

[0007]

[0008] 通式(I)所示结构的化合物有包括Ia,Ib和Ic三类，具体个别化合物如表1所示：

[0009] 表1.具体的硫脲化合物

[0010]

[0011]

[0012]

[0013]

[0014] B.上述硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，步骤如下：

[0015] 第一步，烟草花叶病毒提纯及浓度测定：

[0016] 烟草花叶病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒SOP规范执行，病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，于4℃冷藏备用；

[0017] 第二步，选定硫脲化合物药剂溶液的配制：

[0018] 称量选定上述表1中所列硫脲化合物中的一个40mg作为原药，然后在该原药加入0.4mL DMF进行溶解，制得1×105μg/mL母液，再用质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液稀释至测试浓度500μg/mL或100μg/mL，由此配制得所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物药剂溶液；

[0019] 第三步，离体作用：

[0020] 摩擦接种3–5叶期珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/mL，收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于质量百分比浓度为1‰的吐温80水溶液及第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次，3天后记录病斑数，计算防效；

[0021] 第四步，活体保护作用：

[0022] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，24h后，叶面撒布500目的金刚砂，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/mL，接种后用流水冲洗，3天后记录病斑数，计算防效；

[0023] 第五步，活体治疗作用：

[0024] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/mL，接种后用流水冲洗，叶面收干后，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后记录病斑数，计算防效；

[0025] 第六步，活体钝化作用：

[0026] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，将第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物药剂溶液与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/mL，接种后即用流水冲洗，重复3次，设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后数病斑数，计算结果。

[0027] 上述硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的方法，所述的通式(I)所示结构的化合物中包括的Ia,Ib和Ic三类中的具体个体化合物均是公知化合物，通过商购等公知途径获得，所涉及的其他试剂也通过商购等公知途径获得。

[0028] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的突出的实质性特点和显著进步如下：

[0029] (1)硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的效果明显优于现有技术的药剂病毒唑和宁南霉素。原因在于：大量实验证明，硫脲结构单元与其它基团相结合合成的化合物具有很好的杀菌活性、除草活性、抗HIV活性和抗植物病毒活性。

[0030] (2)与现有用于抗烟草花叶病毒活性的药剂或化合物相比，本发明的显著进步如下：

[0031] ①与病毒唑(Ribavirin)相比：病毒唑作为一种比较成功的植物病毒抑制剂，被广泛的用于防治TMV造成的病害。用药量为500μg/mL时，病毒唑对烟草花叶病毒的离体活性、活体钝化、活体治疗和活体保护中的抑制率分别为41％、31％、39％和49％；相同测试条件下本发明硫脲化合物Ic-5的抑制率分别为73％、69％、70％、68％，远远高于病毒唑。对比数据可参见下面表2。

[0032] ②与宁南霉素相比：宁南霉素是目前防效最好的抗植物病毒病药剂，宁南霉素具有良好预防效果，但其治疗效果差。在相同测试条件下，用药量为500μg/mL时对烟草花叶病毒的离体活性、活体钝化、活体治疗和活体保护中商品化品种宁南霉素的抑制率分别为61％、63％、54％和64％，虽然最好的防治效果能达到64％，而治疗效果只有54％；对比本发明硫脲化合物Ic-5的离体活性、活体钝化、活体治疗和活体保护中的抑制率分别为73％、
69％、70％和68％，不仅防治效果能达到68％，治疗效果也高达70％，均超过商品化品种宁南霉素。对比数据可参见下面表2。

[0033] ③与现有用于抗烟草花叶病毒活性的硫脲化合物相比：含茚基手性硫脲化合物用药量为500mg/L时，活体保护和活体治疗的抑制率分别为57.0％和55.0％，在相同的测试条件下，商品化品种宁南霉素活体保护和活体治疗的抑制率分别为55.9％和53.9％，对比本发明硫脲化合物Ic-5的活体保护和活体治疗的抑制率分别为68％和70％，均超过含茚基手性硫脲化合物；特别是，该手性硫脲化合物(S)-1-(1-茚基)-3-苯基硫脲的的合成需要原料为(S)-1-氨基茚烷(580元左右/克，百灵威报价)及苯基异硫氰酸酯，价格昂贵。本发明所用硫脲化合物容易制备，仅通过一步工艺即能以较高的收率(见下面的表1)得到，生产成本大大降低，具有突出的经济效益。

[0034] ④与CN201410344605.2公开了3-芳基-5-甲基丁内酯化合物相比，CN201410344605.2中报道的治疗效果和保护效果最好的化合物3-(4-氟苯基)-5-甲基-γ-丁内酯的活体治疗和活体保护抑制率分别为57.1％和60.0％，而本发明硫脲化合物Ic-5的活体治疗和活体保护抑制率分别为70％和68％，有明显的提高。

[0035] (3)本发明所用的硫脲化合物，除特别适用用于抗烟草花叶病毒活性之外，还能够用来很好地抑制烟草花叶病毒、辣椒病毒、番茄病毒、甘薯病毒、马铃薯病毒和瓜类病毒，能够有效防治烟草、辣椒、番茄、瓜菜、粮食和豆类作物的病毒病。

具体实施方式

[0036] 下列实施例中所用到的硫脲化合物为具有如下通式(Ⅰ)所示结构的化合物中的一种：

[0037]

[0038] 通式(I)所示结构的化合物有包括Ia,Ib和Ic三类，下述实施例中所用的具体个别化合物如表1所示：

[0039] 表1.具体的硫脲化合物

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044] 实施例1

[0045] 表1中所示硫脲化合物Ia-1用于抗烟草花叶病毒活性的方法步骤如下：

[0046] 第一步，烟草花叶病毒提纯及浓度测定：

[0047] 烟草花叶病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒SOP规范执行，病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用；

[0048] 第二步，选定硫脲化合物Ia-1药剂溶液的配制：

[0049] 称量上述表1中的硫脲化合物Ia-140mg作为原药，然后在该原药加入0.4mL DMF进行溶解，制得1×105μg/mL母液，再用质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液稀释至测试浓度500μg/mL，由此配制得上述硫脲化合物Ia-1的药剂溶液。

[0050] 第三步，离体作用：

[0051] 摩擦接种3–5叶期珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/mL，收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于质量百分比浓度为1‰的吐温80水溶液及第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物Ia-1药剂溶液中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次，3天后记录病斑数，计算防效；

[0052] 第四步，活体保护作用：

[0053] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物Ia-1药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/mL，接种后用流水冲洗，3天后记录病斑数，计算防效；

[0054] 第五步，活体治疗作用：

[0055] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/mL，接种后用流水冲洗，叶面收干后，全株喷雾施第二步配制得的上述硫脲化合物的个别化合物Ia-1药剂溶液，每处理3次重复，并设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后记录病斑数，计算防效；

[0056] 第六步，活体钝化作用：

[0057] 选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，将第二步配制得的上述硫脲化合物Ia-1药剂溶液与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/mL，接种后即用流水冲洗，重复3次，设置质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液对照，3天后数病斑数，计算结果。

[0058] 实施例2

[0059] 除第二步上述硫脲化合物Ia-1药剂溶液的配制中，称量所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-140mg作为原药，然后在该原药加入0.4mL DMF进行溶解，制得1×105μg/mL母液，再用质量百分比浓度为1‰吐温80水溶液稀释至测试浓度100μg/mL之外，其他同实施例1。

[0060] 实施例3

[0061] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-2之外，其他同实施例1。

[0062] 实施例4

[0063] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-2之外，其他同实施例2。

[0064] 实施例5

[0065] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-3之外，其他同实施例1。

[0066] 实施例6

[0067] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-3之外，其他同实施例2。

[0068] 实施例7

[0069] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-4之外，其他同实施例1。

[0070] 实施例8

[0071] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-4之外，其他同实施例2。

[0072] 实施例9

[0073] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-5之外，其他同实施例1。

[0074] 实施例10

[0075] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-5之外，其他同实施例2。

[0076] 实施例11

[0077] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-6之外，其他同实施例1。

[0078] 实施例12

[0079] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-6之外，其他同实施例2。

[0080] 实施例13

[0081] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-7之外，其他同实施例1。

[0082] 实施例14

[0083] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-7之外，其他同实施例2。

[0084] 实施例15

[0085] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-8之外，其他同实施例1。

[0086] 实施例16

[0087] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-8之外，其他同实施例2。

[0088] 实施例17

[0089] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-9之外，其他同实施例1。

[0090] 实施例18

[0091] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-9之外，其他同实施例2。

[0092] 实施例19

[0093] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-10之外，其他同实施例1。

[0094] 实施例20

[0095] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-10之外，其他同实施例2。

[0096] 实施例21

[0097] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-11之外，其他同实施例1。

[0098] 实施例22

[0099] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-11之外，其他同实施例2。

[0100] 实施例23

[0101] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-12之外，其他同实施例1。

[0102] 实施例24

[0103] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ia-12之外，其他同实施例2。

[0104] 实施例25

[0105] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-1之外，其他同实施例1。

[0106] 实施例26

[0107] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-1之外，其他同实施例2。

[0108] 实施例27

[0109] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-2之外，其他同实施例1。

[0110] 实施例28

[0111] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-2之外，其他同实施例2。

[0112] 实施例29

[0113] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-3之外，其他同实施例1。

[0114] 实施例30

[0115] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-3之外，其他同实施例2。

[0116] 实施例31

[0117] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-4之外，其他同实施例1。

[0118] 实施例32

[0119] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-4之外，其他同实施例2。

[0120] 实施例33

[0121] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-5之外，其他同实施例1。

[0122] 实施例34

[0123] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-5之外，其他同实施例2。

[0124] 实施例35

[0125] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-6之外，其他同实施例1。

[0126] 实施例36

[0127] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-6之外，其他同实施例2。

[0128] 实施例37

[0129] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-7之外，其他同实施例1。

[0130] 实施例38

[0131] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ib-7之外，其他同实施例2。

[0132] 实施例39

[0133] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-1之外，其他同实施例1。

[0134] 实施例40

[0135] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-1之外，其他同实施例2。

[0136] 实施例41

[0137] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-2之外，其他同实施例1。

[0138] 实施例42

[0139] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-2之外，其他同实施例2。

[0140] 实施例43

[0141] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-3之外，其他同实施例1。

[0142] 实施例44

[0143] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-3之外，其他同实施例2。

[0144] 实施例45

[0145] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-4之外，其他同实施例1。

[0146] 实施例46

[0147] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-4之外，其他同实施例2。

[0148] 实施例47

[0149] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-5之外，其他同实施例1。

[0150] 实施例48

[0151] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-5之外，其他同实施例2。

[0152] 实施例49

[0153] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-6之外，其他同实施例1。

[0154] 实施例50

[0155] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-6之外，其他同实施例2。

[0156] 实施例51

[0157] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-7之外，其他同实施例1。

[0158] 实施例52

[0159] 除所用硫脲化合物为表1中所列的硫脲化合物Ic-7之外，其他同实施例2。

[0160] 表2.上述实施例中所用硫脲化合物用于抗烟草花叶病毒活性的测试结果：

[0161]