GAOH衍生物及其医药用途

摘要

本发明提供一种全新结构的GAOH衍生物，该类化合物对炎症性肠病、肝炎病毒、足肿胀、耳肿胀、关节炎、肺炎、肾炎、鼻炎、脑卒中、心肌缺血、动脉粥样硬化、心律失常、自身免疫性疾病、老年痴呆、抑郁症、精神分裂症、恶性肿瘤及肿瘤辅助治疗、病毒感染性疾病、消化性溃疡、镇痛、抗过敏、抗内毒素、抗休克、糖尿病或糖尿病并发症具有很好的疗效。

权利要求

1.式一所示的GAOH衍生物，

其中，

R1为羟基或甘露糖苷基；

R2为F；

R3为羟基或氧代；

表示单键或者双键。

2.如权利要求1所述的衍生物，其特征在于，R1为羟基，R3为羟基。

3.如权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述衍生物选自由下列化合物所组成的组中：(2)(2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10,13- 二 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,13,14b-十八氢苉-2-酸；

(3)(2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10,13- 二 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,

13,14b-二十氢苉-2-酸；

(4)(2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10- 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,

13,14b-十八氢苉-2-酸；

(5)(2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-10-甘 露 糖 苷-12b- 氟-13- 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,13,14b-十八氢苉-2-酸。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一所述的衍生物和药用载体。

5.如权利要求1-3任一所述的衍生物在制备治疗炎症性肠病、足肿胀、耳肿胀、关节炎、肺炎、肾炎、鼻炎、脑卒中、心肌缺血、动脉粥样硬化、心律失常、自身免疫性疾病、老年痴呆、抑郁症、精神分裂症、恶性肿瘤及肿瘤辅助治疗、病毒感染性疾病、消化性溃疡、镇痛、抗过敏、抗内毒素、抗休克、糖尿病或糖尿病并发症的药物中的应用。

说明书

GAOH衍生物及其医药用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体来说涉及一种GAOH衍生物及其在制备治疗炎症性疾病和心脑血管病药物中的应用。

背景技术

[0002] 炎症是十分常见而又重要的基本病理过程，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如炎症性肠病、肺炎、肝炎、肾炎等)都属于炎症性疾病，是困扰人们正常生活的常见疾病。一般认为急性炎症主要变现为淋巴细胞浸润和激活，具有免疫和防御功能，可以防控病原体的侵入和损害。但是如果致炎因子持续作用可引起慢性炎症，产生细胞和组织的损伤，进而产生各种疾病，例如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病等。

[0003] 心脑血管疾病，例如脑卒中、高血压等疾病，是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50％以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理！全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手，占每年总死亡人数的51％。而幸存下来的患者75％不同程度丧失劳动能力，40％重残。

[0004] 甘草次酸是甘草提取物的深加工产品之一。我国近年来的药理研究发现，甘草次酸衍生物具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗病毒、降血脂等作用，还可用于防治病毒性肝炎和癌症等疾病。科研人员以甘草次酸为母体化合物，对其结构修饰，得到了一系列甘草次酸衍生物，其中包括如下所示的化合物：

[0005]

[0006] 对甘草次酸进行结构修饰得到的化合物1和化合物2对防治病毒性肝炎和癌症等疾病具有一定的效果的，但是效果不显著。

[0007] 我国是甘草的主要出口国，对甘草的提取物进行深加工和综合利用，研发出一种效果更好的同时防止炎症性疾病、心脑血管疾病、抗肿瘤等疾病的药物具有重大意义。

发明内容

[0008] 为了克服现有技术的不足，本发明通过大量的实验，得出了一种新结构GAOH衍生物及其在制备治疗炎症性肠病、肝炎病毒、足肿胀、耳肿胀、关节炎、肺炎、肾炎、鼻炎、脑卒中、心肌缺血、动脉粥样硬化、心律失常、自身免疫性疾病、老年痴呆、抑郁症、精神分裂症、恶性肿瘤及肿瘤辅助治疗、病毒感染性疾病、消化性溃疡、镇痛、抗过敏、抗内毒素、抗休克、糖尿病或糖尿病并发症的药物中的应用。

[0009] 本发明具体技术方案如下：

[0010] 本发明一方面提供了式一所示的GAOH衍生物，

[0011]

[0012] 其中，

[0013] R1、R2和R3分别为氢、卤素、C1-C10烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、C3-C6环烷基、C1-C10烷氧基、C3-C6环烷氧基、C1-C10烷氨基、C3-C6环烷氨基、C1-C10烷酰基、C1-C10烷氧酰基、C1-C10烷酰氧基、巯基、羟基、氨基、羧基、氧代、芳香基、取代芳香基、杂环、取代杂环基、芳香氧基、杂环氧基、芳香氨基、杂环氨基或糖苷基；

[0014] 表示单键或者双键。

[0015] 进一步的改进，所述杂环基为C3-C8芳杂环基或取代的C3-C8芳杂环基，杂原子选自N、S或O中的一种或多种；

[0016] 所述杂环氧基为C3-C8芳杂环氧基或取代的C3-C8芳杂环氧基，杂原子选自N、S或O中的一种或多种；

[0017] 所述杂环氨基为C3-C8芳杂环氨基或取代的C3-C8芳杂环氨基，杂原子选自N、S或O中的一种或多种。

[0018] 优选地，所述杂环基为吡啶基、吡咯基、呋喃基、咪唑基等。

[0019] 进一步改进的方案中，R1为羟基、C1-C4烷酰氧基或糖苷基；优选地，所述糖苷基为甘露糖苷基。

[0020] 进一步优选地，R1为羟基或甘露糖苷基。

[0021] 更进一步优选地，R1为羟基。

[0022] 进一步改进的方案中，R2为卤素；优选地，R2为F。

[0023] 另一改进方案中，当R2为氢， 表示双键。

[0024] 进一步改进的方案中，R3为羟基、C1-C4烷酰氧基或氧代。

[0025] 优选地，R3为羟基或氧代。

[0026] 进一步优选地，R3为羟基。

[0027] 更进一步优选地，R2为氢，R1为羟基，R3为羟基， 表示双键；或R2为F，R1为羟基，R3为羟基；或R2为F，R1为羟基，R3为氧代， 表示双键；或R2为F，R1为甘露糖苷基，R3为羟基， 表示双键。

[0028] 本发明所述的GAOH衍生物优选下列化合物：

[0029]

[0030]

[0031] 本发明另一方面提供了由GAOH衍生物和药用载体组成的药物组合物。该药物组合物可制成制剂，所述制剂包括片剂、胶囊、颗粒剂、注射液等。药用载体包括填充剂，崩解剂、润滑剂、粘合剂、注射溶剂、抗氧剂、防腐剂、增溶剂或pH调节剂等，常用的填充剂选自乳糖、淀粉、糊精、甘露醇等；崩解剂选自微晶纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠或低取代羟丙基纤维素等；粘合剂选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素或聚维酮K30等；润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉或微粉硅胶等；注射溶剂选自注射用水、乙醇、丙二醇或甘油等；抗氧剂选自乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、亚硫酸钠或抗坏血酸等；防腐剂选自山梨酸钾、对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等；增溶剂选自丙二醇、吐温80或卵磷脂等；pH调节剂选自碳酸氢钠、乳酸或氢氧化钠等。

[0032] 本发明另一方面提供了GAOH衍生物在制备治疗炎症性肠病、肝炎病毒、足肿胀、耳肿胀、关节炎、肺炎、肾炎、鼻炎、脑卒中、心肌缺血、动脉粥样硬化、心律失常、自身免疫性疾病、老年痴呆、抑郁症、精神分裂症、恶性肿瘤及肿瘤辅助治疗、病毒感染性疾病、消化性溃疡、镇痛、抗过敏、抗内毒素、抗休克、糖尿病或糖尿病并发症的药物中的应用。

[0033] 优选地，本发明提供的GAOH衍生物在制备治疗炎症性肠病、肝炎病毒、足肿胀、耳肿胀、脑卒中、心肌缺血或老年痴呆的药物中的应用。

[0034] 本发明提供了一种全新结构的GAOH衍生物，该类化合物对炎症性肠病、肝炎病毒、足肿胀、耳肿胀、关节炎、肺炎、肾炎、鼻炎、脑卒中、心肌缺血、动脉粥样硬化、心律失常、自身免疫性疾病、老年痴呆、抑郁症、精神分裂症、恶性肿瘤及肿瘤辅助治疗、病毒感染性疾病、消化性溃疡、镇痛、抗过敏、抗内毒素、抗休克、糖尿病或糖尿病并发症具有很好的疗效。

具体实施方式

[0035] 实施例1

[0036] (2S,4aS,6aS,6bR,8aR,10S,12aS,12bR,14bR)-10,13- 二 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,13,14b-十八氢苉-2-酸(简称GAOH)的制备

[0037]

[0038] 式n化合物的制备

[0039] 将4.7g式m化合物溶于100mL体积比为1:1.2的丙酮和水的混合液中，搅拌15min，控制温度为5℃，滴加Jones试剂10mL，滴加完毕后，转入室温下继续搅拌，TLC检测反应完全，过滤，收集滤液，回收丙酮，残余物用饱和无水碳酸氢钠中和至中性，过滤，用
300mL二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷层，浓缩，干燥，制得式n化合物；

[0040] 式p化合物的制备

[0041] 取0.468g式n化合物、0.22g SeO2于50mL烧瓶中，加入20mL乙酸酐，在氮气保护下回流，TLC检测反应完全，用2N氢氧化钠水溶液终止反应，加入300mL乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层，用饱和碳酸氢钠水溶液洗，再用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物乙酸乙酯和石油醚为流动相进行硅胶柱层析，制得式p化合物；

[0042] GAOH的制备

[0043] 氮气保护下，将4.66g式p化合物和4.09g CeCl3·7H2O溶于150mL甲醇中，降温至-20℃，迅速加入0.41g NaBH4，TLC检测反应完全；旋转蒸除溶剂，加入150mL乙酸乙酯溶解，先后用10％盐酸水溶液洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸除乙酸乙酯，纯化，制得GAOH。

[0044] 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ6.04(dd，J ＝ 10.4，1.9,1H)，δ5.27-5.23(m，1H)，δ5.21(dd，J＝9.0，3.7，1H)，δ4.36(d，J＝1.7，1H)，δ4.26(d，J＝4.0，1H)，δ3.69(s，1H)，δ1.95(m，2H)，δ1.78(m，2H)，δ1.73-1.65(m，2H)，δ1.55(m，2H)，δ1.50(m，2H)，δ1.43(s，3H)，δ1.31(s，1H)，δ1.26(m，4H)，δ1.16(s，3H)，δ1.12(s，1H)，δ1.06(s，
3H)，1.02(s，3H)，δ0.99(s，1H)，δ0.95(s，1H)，δ0.90(s，3H)，δ0.77(s，3H)，δ0.72(s，
3H)。

[0045] 实施例2

[0046] (2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10,13- 二 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,13,14b-十八氢苉-2-酸(简称GAOHF)的制备：

[0047]

[0048] 氮气保护下，将4.86g式a化合物和4.09gCeCl3·7H2O溶于150mL甲醇中，降温至-20℃，迅速加入0.41g NaBH4，TLC检测反应完全；旋转蒸除溶剂，加入150mL乙酸乙酯溶解，先后用10％盐酸水溶液洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸除乙酸乙酯，制得GAOHF。

[0049] 实施例3

[0050] (2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10,13- 二 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十氢苉-2-酸(简称GAOHF-1)的制备

[0051]

[0052] 式c化合物的制备

[0053] 氮气保护下，将4.7g式b化合物溶于150mL甲醇中，降温至-20℃，迅速加入0.41g NaBH4，TLC检测反应完全；旋转蒸除溶剂，加入150mL乙酸乙酯溶解，先后用10％盐酸水溶液洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸除乙酸乙酯，制得式c化合物。

[0054] 式d化合物的制备

[0055] 将4.72g式c化合物加入250mL的圆底烧瓶中，加入100mL DMF和2.4mL Py，搅拌，于0℃下，缓慢滴入3mL CH3SO2Cl，滴加完毕后，升温至室温，搅拌，TLC检测反应完全，减压回收DMF，残余物加入水，用二氯甲烷萃取三次，每次100mL，合并二氯甲烷层，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，回收二氯甲烷，制得式d化合物。

[0056] 式e化合物的制备

[0057] 将4.54g式d化合物溶于200mL甲醇中，加入5.7g KC2H3O3，在氮气保护下回流，TLC检测反应完全，回收甲醇，残余物加入水，用乙酸乙酯萃取3次，每次100mL，合并乙酸乙酯层，用饱和碳酸氢钠水溶液洗，再用饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，减压回收乙酸乙酯，以石油醚和乙酸乙酯为流动相，进行柱层析，制得式e化合物。

[0058] GAOHF-1的制备

[0059] 将4.7g式e化合物溶于100mL二氯甲烷中，搅拌下，向二氯甲烷溶液中通入HF气体，TLC检测反应完全，回收二氯甲烷，纯化，制得GAOHF-1。

[0060] 实施例4

[0061] (2S,4aS,6aR,6bS,8aS,10S,12aS,12bS,14bR)-12b- 氟 -10- 羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,12b,
13,14b-十八氢苉-2-酸(简称GAOHF-2)的制备

[0062]

[0063] 式g化合物的制备

[0064] 将4.9g式f化合物溶于100mL体积比为1:1.2的丙酮和水的混合液中，搅拌15min，控制温度为5℃，滴加Jones试剂10mL，滴加完毕后，转入室温下继续搅拌，TLC检测反应完全，过滤，收集滤液，回收丙酮，残余物用饱和无水碳酸氢钠中和至中性，过滤，用
300mL二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷层，浓缩，干燥，制得式g化合物；

[0065] 式h化合物的制备

[0066] 取0.486g式g化合物、0.22g SeO2于50mL烧瓶中，加入20mL乙酸酐，在氮气保护下回流，TLC检测反应完全，用2N氢氧化钠水溶液终止反应，加入300mL乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层，用饱和碳酸氢钠水溶液洗，再用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物乙酸乙酯和石油醚为流动相进行硅胶柱层析，制得式h化合物；

[0067] GAOHF-2的制备

[0068] 氮气保护下，将4.84g式h化合物和4.09g CeCl3·7H2O溶于150mL甲醇中，降温至-20℃，迅速加入0.41g NaBH4，TLC检测反应完全；旋转蒸除溶剂，加入150mL乙酸乙酯溶解，先后用10％盐酸水溶液洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸除乙酸乙酯，纯化，制得GAOHF-2。

[0069] 实施例5注射液

[0070]

[0071] 制备方法：

[0072] 取注射用水，加入EDTA-2Na和GAOH溶解，分次加入碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，调节pH在5.8-6.2；灭菌分装，每支含GAOH 200mg。

[0073] 实施例6注射液

[0074]

[0075]

[0076] 制备方法：

[0077] 取注射用水，加入EDTA-2Na和GAOHF溶解，分次加入碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，调节pH在5.8-6.2；灭菌分装，每支含GAOHF 200mg。

[0078] 实施例7片剂

[0079] GAOHF-2 100g

[0080] 甲基纤维素 500g

[0081] 制备方法：

[0082] 将GAOHF-2与甲基纤维素混合制粒，压片；每片GAOHF-2100mg。

[0083] 实施例8胶囊剂

[0084] GAOHF-1 100g

[0085] 乙基纤维素 500g

[0086] 制备方法：

[0087] 将GAOHF-1与乙基纤维素混合制粒，装入胶囊；每粒含GAOHF-1100mg。

[0088] 实施例9本发明提供的GAOH衍生物用于治疗足肿胀和耳肿胀的试验

[0089] 1.材料与方法

[0090] 试剂：蒸馏水，自制；蛋清，自制，用蒸馏水配制成10％的蛋清溶液，现配现用；二甲苯，由宏源化工有限公司提供，批号：20130302；复方醋酸地塞米松乳膏，由华润三九医药股份有限公司生产，批号：1306066H。

[0091] 实验动物：昆明小鼠220只，SPF级，体重18-22g，雌雄各半，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0003，在武汉大学动物实验中心饲养，开展实验，温度25±2℃，湿度60±10％，12h光照。

[0092] 实验仪器：足趾容积测定仪，PV-200型，成都泰盟科技有限公司生产；

[0093] 实验方法：足肿胀试验：取小鼠80只，随机分为8组，分别为模型组，GAOH组(1mg/kg)，GAOHF组(1mg/kg)，GAOHF-1组(1mg/kg)，GAOHF-2组(1mg/kg)，GAOHF-3组(1mg/kg)，化合物1组(1mg/kg)，甘草次酸组(1mg/kg)，地塞米松组(0.04mg/kg)，分别灌胃给药；模型组给予蒸馏水，于实验当日，先测定给药的右后足体积，作为给药前体积，再次涂抹相应药液于右后足，30min后，分别于小鼠给药部位的右后足跖皮下注射10％新鲜鸡蛋清溶液0.1mL；分别测定致炎后30min、60min的足体积，计算足肿胀率％；足肿胀率％＝(致炎后足体积-正常足体积)/正常足体积×100％。

[0094] 耳肿胀实验：取小鼠80只，随机分为8组，分别为模型组，GAOH组(1mg/kg)，GAOHF组(1mg/kg)，GAOHF-1组(1mg/kg)，GAOHF-2组(1mg/kg)，GAOHF-3组(1mg/kg)，化合物1组(1mg/kg)，甘草次酸组(1mg/kg)，地塞米松组(0.04mg/kg)，分别灌胃给药，模型组给予蒸馏水，于实验当日，将二甲苯0.03mL/只均匀涂布于小鼠右耳前后两面，左耳对照；于致炎后60min，小鼠颈椎脱臼致死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，称重，计算耳肿胀率；耳肿胀率％＝(右耳重-左耳重)/左耳重×100％。

[0095] 2.GAOH衍生物LD50测定

[0096] 采用Bliss法，尾静脉注射；以Bliss法进行计算，GAOH组，GAOHF组，GAOHF-1组，GAOHF-2组，GAOHF-3组，小鼠静脉注射的LD50均>500mg/kg；根据GAOH衍生物抗炎有效剂量为2mg/kg；表明毒性剂量>有效剂量60倍，毒性小，具有临床实际应用价值。

[0097] 3.实验结果

[0098] GAOH衍生物对小鼠足肿胀的影响见表1；GAOH衍生物对小鼠耳肿胀的影响见表2。

[0099] 表1GAOH衍生物对小鼠足肿胀的影响

[0100]

[0101] 与模型组相比P*<0.05，P**<0.01；与化合物1组相比，P#<0.05。

[0102] 从表中可以看出，与模型组相比，在致炎30min，60min，GAOH衍生物组、甘草次酸组、地塞米松组及化合物1组能够不同程度地降低足肿胀率；并且本发明提供的GAOH衍生物的疗效好于化合物1，与地塞米松和甘草次酸的疗效相当。

[0103] 表2GAOH衍生物对小鼠耳肿胀的影响

[0104]

[0105]#

[0106] 与模型组相比P*<0.05，P**<0.01；与化合物1组相比，P<0.05。

[0107] 从表中可看出，与模型组相比，GAOH衍生物组、甘草次酸组、地塞米松组及化合物1组能够不同程度地降低耳肿胀率；并且本发明提供的GAOH衍生物的疗效好于甘草次酸和化合物1，与地塞米松的疗效相当。

[0108] 4.实验结论

[0109] GAOH衍生物可治疗足肿胀和耳肿胀，且作用与现有临床使用药物相当；GAOH衍生物的毒性低，LD50(半数致死量)为>500mg/kg。

[0110] 实施例10本发明提供的GAOH衍生物抗肿瘤试验

[0111] 1.细胞株

[0112] HepG2(人肝癌细胞)；HT29(结肠癌细胞)；769-P(神经癌细胞)；

[0113] 2.主要仪器和试剂

[0114] 仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、台式离心机、倒置相差显微镜、-80℃超低温冰箱、恒温水浴锅、96孔板等；

[0115] 试剂：1640培养液，胎牛血清，台盼蓝，二甲基亚砜，cck-8试剂盒等均由武汉洁洋盛科技有限公司提供；

[0116] 受试药：J1-001，由武汉生物技术研究院提供；紫杉醇、5-FU均购于武汉大学中南医院；

[0117] 3.实验方法

[0118] 3.1细胞培养和传代

[0119] 37℃迅速解冻冻存的HepG2、HT29、769-P一支，加1640培养液5mL，1000r·min-1离心洗涤2次，加入含10％胎牛血清的1640培养液，37℃、5％C02的培养箱中培养，间日更换细胞培养液，细胞长至70％-80％满度时传代，培养l周后，收集细胞悬液，1000r·min-1离心5min，用1640培养液调节细胞为每1mL含50000个，备用。

[0120] 3.2CCK-8比色法检测HepG2、HT29、769-P细胞存活率

[0121] 将HepG2、HT29、769-P细胞悬液接种于96孔板内，每孔100μL，于37℃、5％C02的培养箱中培养；

[0122] 24h后，每孔加入相应受试药物，于37℃、5％C02的培养箱中培养；24h后，每孔加入含CCk-8试剂10μL培养液，于450nm测定吸光度。按以下公式计算抑制率：

[0123]

[0124] 其中：A1---受试药吸光度

[0125] A2---模型组吸光度

[0126] A3---空白组吸光度

[0127] 4.实验结果

[0128] GAOH衍生物、紫杉醇及化合物1对HepG2、HT29、769-P细胞的IC50结果见表3；

[0129] 表3GAOH衍生物、紫杉醇及化合物1对HepG2、HT29、769-P的IC50(μg/L)[0130]

[0131]

[0132] 与化合物1相比，P*<0.05；与紫杉醇相比，P#﹥0.05。

[0133] 从表中可以看出，本发明提供的GAOH衍生物对HepG2、HT29、769-P细胞均表现为较低的IC50，疗效与紫杉醇相当，好于化合物1。

[0134] 实施例11本发明提供的GAOH衍生物抗脑卒中试验

[0135] 1.材料与方法

[0136] 药品及试剂：受试药物(GAOH，GAOHF，GAOHF-1，GAOHF-2，GAOHF-3，化合物1)自制；水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，T20090926，99.5％；TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)，Sigma公司提供，T8877-25G，95％；乙醚等试剂均为市售分析纯试剂；依达拉奉，吉林省博大制药有限责任公司，YBH28302005，注射液：20mL：30mg*1/支/支。

[0137] 动物SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g；武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO.42000500001305，生产许可证号：SCXK(鄂)2008-004，鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。

[0138] 2.实验方法

[0139] 注射液制备：取注射用水，煮沸，放置至室温。取上述注射用水，加入EDTA-2Na、焦亚硫酸钠，加入受试药物溶解，分次加入碳酸氢钠粉末，不断搅拌至完全溶解，调节pH在5.8-6.2。加针用炭，室温搅拌10min，用滤纸过滤除碳。加新沸的注射用水至全量，用0.22μm微孔滤膜精滤；100℃煮沸15min。

[0140] 动物分组与处理：大鼠随机分组：假手术组，模型组，给药组(模型+GAOH组，模型+GAOHF组，模型+GAOHF-1组，模型+GAOHF-2组，模型+GAOHF-3组，模型+依达拉奉组，模型+化合物1组)；给药组分别经腹腔注射给予GAOH 2mg/Kg、GAOHF 2mg/Kg、GAOHF-1 2mg/Kg、GAOHF-2 2mg/Kg、GAOHF-3 2mg/Kg、依达拉奉6mg/kg，化合物1 2mg/Kg、假手术组与模型组分别给予等容积的生理盐水；于栓塞后2h，一次性给予。

[0141] 动物造模：依据改良线栓MCAo模型建立脑缺血模型，大鼠用10％水合氯醛(3.5mL/kg)静脉注射麻醉；仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用；用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA；然后在距CCA分叉部约4mm处剪一小口，将拴线插入CCA后进入ICA，直至颅底，越过MCA的起始部，到达大脑前动脉(ACA)的近端这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。缝合伤口，单笼饲养观察。2h后拔线拴实现再灌注。

[0142] 假手术组大鼠用10％水合氯醛(3.5mL/kg)静脉注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)后缝合上后即可。

[0143] 检测指标

[0144] (1)神经行为学评分：

[0145] 麻醉苏醒后，由一不了解分组情况的观察者进行神经行为学评分。将动物放回鼠笼，自由饮食；脑缺血再灌注24h后，由不了解分组情况的第二位观察者评估记录神经行为学评分，按Zea-Longa等的6级评分法：0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡。

[0146] (2)TTC染色：动物于栓塞后24h，麻醉，取脑；-20℃冰箱中速冻30分钟左右，切片：切成8-10片，每隔1.5mm切一片。切片置于2％TTC染色剂(2g溶于100mLPBS缓冲液)中，用锡箔纸盖住后，放入370℃温箱30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。染色后扫描仪扫描切片，用image proplus图像处理软件计算梗死体积(梗死体积＝[(VC-VL)/VC]，VC是对照半球体积，VL是损伤半球非梗死体积)。

[0147] 3.实验结果

[0148] GAOH衍生物对缺血大鼠的保护作用见表4。

[0149] 表4GAOH衍生物对缺血大鼠的保护作用

[0150]## * **

[0151] 与假手术组相比P <0.01；与模型组相比P<0.05，P <0.01；与依达拉奉组相比# #P<0.05，与化合物1组相比，P<0.05。

[0152] 结果可见，未给药的脑缺血大鼠，梗死体积0.5148±0.085，行为学评分为：4.53±0.11；给予2mg/kg GAOH，梗死体积0.1098±0.097，行为学评分为1.843±0.109；
给予2mg/kg GAOHF，梗死体积0.0768±0.012，行为学评分为1.214±0.118；给予
2mg/kgGAOHF-1，梗死体积0.0821±0.009，行为学评分为1.317±0.121；给予2mg/kg GAOHF-2，梗死体积0.0884±0.017，行为学评分为1.302±0.098；给予2mg/kg GAOHF-3，梗死体积0.0799±0.023，行为学评分为1.256±0.103；给予6mg/kg依达拉奉，梗死体积0.1808±0.055，行为学评分为2.544±0.127；给予2mg/kg化合物1，梗死体积
0.2108±0.037，行为学评分为2.985±0.154；表明GAOH衍生物可改善脑卒中，且作用明显优于化合物1和现有临床使用药物依达拉奉。

[0153] 4.实验结论

[0154] GAOH衍生物可改善脑卒中，且作用优于现有临床使用药物。

[0155] 实施例12本发明提供的GAOH衍生物抗老年痴呆的试验

[0156] 1.材料与方法

[0157] 药品及试剂：受试药物(GAOH，GAOHF，GAOHF-1，GAOHF-2，GAOHF-3，化合物1)自制；氢溴酸东莨菪碱注射液，上海禾丰制药有限公司生产，批号：96092；加兰他敏片，上海复旦复华药业有限公司，批号：H10960133；乙醚等试剂均为市售分析纯试剂。

[0158] 动物SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g；武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO.4200593301，生产许可证号：SCXK(鄂)2008-004；鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。

[0159] 2.实验方法

[0160] 动物分组与处理：大鼠随机分为正常组，模型组，给药组(模型+GAOH组，模型+GAOHF组，模型+GAOHF-1组，模型+GAOHF-2组，模型+GAOHF-3组，模型+加兰他敏组，模型+化合物1组)；给药组分别经口给予GAOH50mg/kg、GAOHF 50mg/kg、GAOHF-1 50mg/kg、GAOHF-2 50mg/kg、GAOHF-3 50mg/kg、依达拉奉1mg/kg，化合物1 50mg/kg；正常组与模型组分别给予等容积的生理盐水；连续给予7天。

[0161] 动物造模：除正常组外，其余各组采用东莨菪碱(2mg/kg)腹腔注射造成小鼠记忆障碍模型。注射后15分钟，开始进行水迷宫训练与测试，连续3天。

[0162] 检测指标：

[0163] 水迷宫测试：Morris水迷宫由圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成。圆形水池(直径80cm，高30cm)加水后用黑墨水滴成黑色使水不透明，且将迷宫均分为4个象限，水温保持在25℃左右。另有一个黑色圆形平台(直径10cm，高28cm)，置于某一个象限中央，位于水面下缘2cm左右。测试时，选择象限作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，根据水迷宫跟踪系统记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，120s未找到平台则将动物引至平台，逃避潜伏期记为120s。实验进行3天，每只小鼠每天训练4次(包括4个象限入水点)，且将小鼠引至平台后在平台上停留10s。

[0164] 3.实验结果

[0165] GAOH衍生物对小鼠的记忆缺失障碍的改善作用见表5。

[0166] 表5GAOHF对小鼠的记忆缺失障碍的改善作用

[0167]

[0168] 与正常组相比，P#<0.01；与模型组相比，P*<0.05，P**<0.01；与加兰他敏组相比，Paa﹥0.05；与化合物1组相比，P<0.05。

[0169] 水迷宫实验结果可见，与正常组相比，模型组给予东莨菪碱后，小鼠的潜伏期明显延长(109.85±22.83vs 87.9±20.41)，东莨菪碱成功复制小鼠学习记忆障碍；经药物治疗后，GAOH组(109.85±22.83vs 68.55±20.43)、GAOHF组(109.85±22.83vs74.56±21.24)、GAOHF-1 组 (109.85±22.83vs 73.91±20.12)、GAOHF-2 组
(109.85±22.83vs 74.91±20.76)、GAOHF-3组(109.85±22.83vs 74.25±20.63)和加兰他敏组(109.85±22.83vs 87.24±25.45)均明显缩短小鼠的逃避潜伏期，且与正常组比较差异无显著性；GAOH组、GAOHF组、GAOHF-1组、GAOHF-2组和GAOHF-3组与加兰他敏组比较，小鼠的逃避潜伏期差异无显著性，与化合物1组比较，小鼠的逃避潜伏期缩短。

[0170] 4.实验结论

[0171] GAOH衍生物可治疗老年痴呆，且作用与现有临床使用药物相比无显著性差异，但优于化合物1。

[0172] 实施例13本发明提供的GAOH衍生物抗心肌缺血的实验

[0173] 1.材料与方法

[0174] 药品及试剂受试药物(GAOH，GAOHF，GAOHF-1，GAOHF-2，GAOHF-3，化合物1)自制；水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，T20090926，99.5％；垂体后叶素(Pit)，上海第一生化药业有限公司(040403)；普萘洛尔，江苏林海药业有限公司生(030610)；乙醚等试剂均为市售分析纯试剂。

[0175] 动物：SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g；武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO.00018995，生产许可证号：SCXK(鄂)2008-004；鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。

[0176] 动物分组与处理：大鼠随机分为：假手术组，模型组，给药组(GAOH组，GAOHF组，GAOHF-1组，GAOHF-2组，GAOHF-3组，普萘洛尔组，化合物1组)；给药组分别腹腔注射给予GAOH 50mg/kg、GAOHF 50mg/kg、GAOHF-1 50mg/kg、GAOHF-2 50mg/kg、GAOHF-3 50mg/kg、普萘洛尔40mg/kg，化合物1 50mg/kg；假手术组与模型组分别给予等容积的生理盐水。

[0177] 动物造模：连接成都泰盟仪器的BL420生物信号采集系统，描记Ⅱ导联心电图；除假手术组外，其余各组采用垂体后叶素(0.35u/kg)静脉注射造成大鼠心肌缺血模型。

[0178] 检测指标：分别描记每只大鼠缺血前Ⅱ导联心电图并连续描记，计算缺血后15S，30S，1，2，3，4，5min T波变化百分率；T波变化率＝(缺血后T波峰值一缺血前T波峰值)/缺血后T波峰值×100％。

[0179] 3.实验结果

[0180] GAOH衍生物对心肌缺血大鼠的保护作用见表6。

[0181] 表6GAOH衍生物对心肌缺血大鼠的T波变化率的影响(n＝6)

[0182]## * **

[0183] 与正常组相比，P <0.01；与模型组相比，P<0.05，P <0.01；与化合物1组相比，**P <0.05。

[0184] 从表中可见，模型组大鼠注射垂体后叶素后T波即刻明显抬高，30s时达到高峰，即出现第1期心电图变化，于注射垂体后叶素30s出现T波低平、双相、倒置，心率减慢，P-R及Q-T间期延长等第2期心电图变化。GAOH组、GAOHF组、GAOHF-1组、GAOHF-2组、GAOHF-3组、普萘洛尔组和化合物1组均能对抗垂体后叶素引起的大鼠第l期和第2期的心电图变**化，与模型组比较有非常显著性意义(P <0.01)。表明GAOH衍生物可改善大鼠心肌缺血程度；并且疗效与普萘洛尔相当，优于化合物1。

[0185] 4.实验结论

[0186] GAOH衍生物可治疗心肌缺血，且作用与现有临床使用药物相比无显著性差异。

[0187] 实施例14本发明提供的GAOH衍生物抗肝炎病毒的作用。

[0188] 1.材料与方法

[0189] 药品及试剂：受试药物(GAOH，GAOHF，GAOHF-1，GAOHF-2，GAOHF-3，化合物1)自制；甘草次酸，乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg试剂盒；酶联免疫检测仪等。

[0190] 2.实验方法

[0191] 加样：将预包被板条固定于板架上；设空白对照1孔，不加样品，其余孔加入待测样品50uL；

[0192] 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物50uL(1滴)；

[0193] 温育：振荡混匀，置37℃温育30分钟；

[0194] 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置60秒，弃去孔内；洗液，扣干，重复洗6次；

[0195] 显色：每孔加入底物缓冲液50uL(1滴)，再加入底物液50Ul(1滴)，振荡混匀，置37℃温育15分钟；

[0196] 终止：每孔加入终止液50uL(1滴)，轻拍混匀；在单波长450r im下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。

[0197] 抑制百分率

[0198] 抑制％＝(空白对照组OD-试验组OD)/空白对照组OD×100％

[0199] 3.实验结果

[0200] GAOH衍生物抗肝炎病毒作用见表7。

[0201] 表7GAOH衍生物对HepG2215分泌的HBsAg的抑制率％(n＝5)

[0202]

[0203] 与甘草次酸相比，P#<0.05，P*﹥0.05；与化合物1相比，P#<0.05。

[0204] 从表中可见，化合物GAOH、GAOHF、GAOHF-1、GAOHF-2及GAOHF-3与甘草次酸、化合物1不同浓度下均对HepG2215分泌的HBsAg有抑制效果；且相同浓度下，对HepG2215分泌的HBsAg的抑制率明显高于甘草次酸和化合物1；表明GAOH衍生物有明显的抗肝炎病毒作用，且效果远远优于甘草次酸和化合物1。

[0205] 实施例15本发明提供的GAOH衍生物抗炎症性肠病的试验

[0206] 1.材料与方法

[0207] 药品及试剂：受试药物(GAOH，GAOHF，GAOHF-1，GAOHF-2，GAOHF-3，化合物1)自制；TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)；乙醇等试剂均为市售分析纯试剂。

[0208] 动物：SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g；武汉大学动物实验中心提供，合格证号：No.42000500001305，生产许可证号：SCXK(鄂)2008-004；鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。

[0209] 动物分组与造模：

[0210] SD大鼠80只，按照随机原则分配成8组，分别为正常组(生理盐水造模+腹腔注射生理盐水)、TNBS模型组(TNBS造模+腹腔注射生理盐水)、GAOH组(TNBS造模+腹腔注-1 -1射GAOH 2mg·kg )、GAOHF组(TNBS造模+腹腔注射GAOHF 2mg·kg )，GAOHF-1组(TNBS-1 -1
造模+腹腔注射GAOHF-12mg·kg )、GAOHF-2组(TNBS造模+腹腔注射GAOHF-22mg·kg )、-1
GAOHF-3组(TNBS造模+腹腔注射GAOHF-32mg·kg )、化合物1组(TNBS造模+腹腔注射-1
化合物12mg·kg )，每组10只；造模前大鼠禁食24h，自由饮水；乙醚麻醉大鼠后用一直径-1
2.0mm硅胶管由肛门轻缓插入8cm，TNBS(80mg·kg )溶解于体积分数为50％乙醇溶液，缓慢推入结肠，迅速堵住大鼠肛门并倒拎60s；正常组用生理盐水代替造模液，其他操作步骤相同。造模后第二日开始给药，每日上午10时给药，连续给药14天，试验期间自由饮水摄食。

[0211] 检测指标：

[0212] 评分实验过程中每日观察大鼠体重变化和大便性状，并且每日观察或用粪便隐血试纸检测大便带血情况，参考文献标准略作改动进行DAI评分，按下述指标进行积分：大鼠体重改变百分率(0分：无改变；1分：下降1％---5％；2分：下降6％---10％；3分：下降11％---15％；4分：下降>15％)、大便黏稠度(正常为0分；松散大便为2分；腹泻为4分)和血便程度(正常0分；隐血阳性为2分；显性出血为4分)，三者相加累计；解剖去结肠，测量结肠长度和重量计算结肠单位长度重量。肛门至盲肠段结肠沿肠系膜纵轴剪开，冷生理盐水冲洗干净，进行大体形态评分。参照文献：0为无损伤；1为轻度充血、水肿，无糜烂或溃疡；2为中度充血、水肿，糜烂或浅溃疡；3为重度充血、水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡小于1cm；4为重度充血、水肿，坏死及溃疡形成，溃疡大于1cm；切取距肛门8cm处结肠组织，10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片(4um)，HE染色，显微镜下观察，按文献方法行病理评分(histological index，HI)结肠组织学损伤评分指标包括溃疡、肉芽肿，纤维化按有无及轻重计为0、1、2分，病变深度(达黏膜下层1分、肌层2分、浆膜层3分)，各项相加得总分。

[0213] 3.实验结果

[0214] 大鼠疾病活动指数(DAI)及结肠重量长度比(g/cm)见表8；

[0215] 大鼠结肠大体形态评分及组织病理学评分见表9。

[0216] 表8大鼠疾病活动指数(DAI)及结肠重量长度比(g/cm)

[0217]

[0218]## * #

[0219] 与正常组比较，P <0.01；与TNBS模型组比较，P<0.01，P<0.05；与化合物1组比*较，P<0.05。

[0220] 从表中可以看出，TNBS模型组大鼠结肠DAI评分、结肠重量长度比与正常组相比有显著性升高；与TNBS模型组相比，GAOH组、GAOHF组、GAOHF-1组、GAOHF-2组、GAOHF-3组的DAI评分、结肠重量长度比显著下降；化合物1组的DAI评分、结肠重量长度比有所下降；提示GAOH衍生物能够明显减轻TNBS大鼠结肠炎症损伤，并且疗效优于化合物1。

[0221] 表9大鼠结肠大体形态评分及组织病理学评分

[0222]

[0223] 与正常组比较，P##<0.01；与TNBS模型组比较，P*<0.01，P#<0.05；与化合物1组比较，P*<0.05。

[0224] 从表中可看出，大体形态观察：正常组大鼠结肠均匀细长，颜色呈嫩粉色且色泽均一；TNBS模型组结肠黏膜充血水肿、糜烂，肠壁增厚，伴有溃疡出现，且形成巨结肠，黏膜表面坏死，病变处粘膜呈黑褐色；GAOH组、GAOHF组、GAOHF-1组、GAOHF-2组、GAOHF-3组能显改善肠黏膜充血、水肿、糜烂(P*<0.01)症状，未见明显巨结肠；化合物1组对肠黏膜充血、水肿、糜烂(P#<0.05)症状有所改善，但是效果不如GAOH衍生物效果好，个别会出现小溃疡