一株产L‑苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用

摘要

本发明公开了一株产L‑苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用，属于代谢工程领域。本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株Corynebacterium glutamcium ATCC 13032中，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的两个穿梭表达载体pEC‑XK99E和pXMJ19表达L‑Phe合成途径中八个关键酶基因：aroFfbr，tktA，ppsA，aroL，pheAfbr，aroE，aroA，tyrB，并通过使用两个不同强度的启动子Ptac和Plac对八个基因进行组合表达提高L‑Phe产量，L‑Phe产量最高达到5.59±0.11g/L，莽草酸积累为0.31±0.11g/L。本发明提供了一种通过过量表达L‑Phe合成途径关键酶基因，提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑Phe的方法。

权利要求

1.一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，是在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中过量表达了编码3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶的aroFfbr、编码莽草酸脱氢酶的aroE，编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA、编码转酮酶的tktA、编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶的pheAfbr、编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的aroA、编码氨基转移酶的tyrB和编码莽草酸激酶的aroL；aroFfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，aroE的核苷酸序列如Gene ID:3343183所示，ppsA的核苷酸序列如Gene ID:14791674所示，tktA的核苷酸序列如Gene ID:3343601所示，pheAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，aroA的核苷酸序列如Gene ID:3345010，tyrB的核苷酸序列如Gene ID:12933673所示，aroL的核苷酸序列如Gene ID:12930837所示；aroFfbr、aroE、ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转化谷氨酸棒状杆菌；pheAfbr、aroA、tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌株。

3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL；将重组质粒转化宿主，筛选阳性克隆。

4.一种构建权利要求1所述重组谷氨酸棒状杆菌的方法，是将aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA；将pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL；将两重组质粒转化谷氨酸棒状杆菌，筛选阳性克隆。

5.一种应用权利要求1所述重组谷氨酸棒状杆菌生产L-Phe的方法，是将活化的种子接入发酵培养基中，同时加入IPTG诱导质粒表达重组酶，通风发酵培养60-80h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计含有：葡萄糖

100.0，玉米浆干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙

20.0；pH 6.8-7.0。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，IPTG添加量终浓度为1.0mM。

8.权利要求1所述重组谷氨酸棒状杆菌在生产L-苯丙氨酸中的应用。

说明书

一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用，属于代谢工程领域。

背景技术

[0002] 苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)，即D.L-α-氨基-β-苯基丙酸，是一种芳香族杂环、非极性、电中性的氨基酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phe)，比旋光度为-35.1°。L-Phe在生物体内可被辅酶四氢生物喋呤不可逆地转化为L-酪氨酸(L-Tyrosine，L-Tyr)，后继续分解，经转氨基生成少量苯丙酮酸。L-Phe广泛存在于自然界中，是人体和动物所必须的8种氨基酸之一，而D-Phe在自然界中并不存在，只有通过合成的方法获得。

[0003] L-Phe的生产技术主要包括天然蛋白质水解法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中天然蛋白质水解法由于其生产工艺相对复杂，产品质量不稳定，难以用于工业化生产。化学合成法因其生产路线长、副产物多且产物为消旋不宜推广使用等缺点，因而逐渐被淘汰。由于酶法具有生产工艺简单、产物浓度高、纯化步骤简单等特点是目前工业化L-Phe的主要生产方式之一，微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小，产物浓度高等优点成为国内外工业化生产L-Phe的主要方法。

[0004] 谷氨酸棒杆菌中L-Phe合成途径主要分为三个部分：1、中心碳源代谢途径提供两个前体物质，来源于糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate,PEP)以及来源于磷酸戊糖途径的4-磷酸-赤藓糖(Erythrose-4-phosphate,E4P)；2、莽草酸途径是芳香族氨基酸合成的共同代谢途径；3、分支酸路径，以分支酸(Chorismate)为节点通过不同的酶作用分别流向三种不同的芳香族氨基酸L-Phe，L-酪氨酸和L-色氨酸。

[0005] 虽然大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸能到很高的水平，但大肠杆菌由于其自身的特点而在大工业化生产中受到了限制，尤其在制备食品级的大工业化生产中。这是因为大肠杆菌本身是一种条件致病菌，所生产的重组蛋白、有机酸等产物中残留有大肠杆菌的相关抗原，从而易引起人或其他动物的免疫反应，这是公众卫生所不能接受的；此外，大肠杆菌是一种很好的噬菌体宿主菌，在大工业化发酵生产中极易遭受噬菌体的感染。

[0006] 谷氨酸棒杆菌是一种食品级的微生物，本发明旨在提供一种L-苯丙氨酸产量提高的重组谷氨酸棒状杆菌。

发明内容

[0007] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，是在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中过量表达了八个L-Phe合成途径的八个关键酶基因：aroFfbr(3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶)，aroE(莽草酸脱氢酶)，fbrppsA(磷酸烯醇式丙酮酸合成酶)、tktA(转酮酶)、pheA (双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)，aroA(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)，tyrB(氨基转移酶)和aroL(莽草酸激酶)。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，aroE的核苷酸序列如Gene ID:3343183所示，ppsA的核苷酸序列如Gene ID:14791674所示，tktA的核苷酸序列如Gene ID:3343601所示，pheAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，aroA的核苷酸序列如Gene ID:3345010，tyrB的核苷酸序列如Gene ID:12933673所示，aroL的核苷酸序列如Gene ID:12930837所示。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbr，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转化谷氨酸棒状杆菌；pheAfbr，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。

[0011] 在本发明的另一种实施方式中，aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载fbr体pEC-XK99E后，在aroF -aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL，简写为pSDTL。

[0012] 所述启动子Ptac由Trp启动子和Plac启动子杂合而成，受IPTG诱导，具有更高的转录效率。

[0013] 所述启动子Plac受IPTG诱导，其强度约为Ptac启动子强度的1/11。

[0014] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌的方法，是将aroFfbr、aroE、ppsA、tktA连接到一个表达载体，将pheAfbr、aroA、tyrB和aroL连接到一个表达载体，共同转化谷氨酸棒状杆菌。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，aroFfbr，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转化谷氨酸棒状杆菌；pheAfbr，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。

[0016] 在本发明的另一种实施方式中，aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL，简写为pSDTL。

[0017] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-Phe的方法，是将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200-300r/min)上，30℃发酵培养60-80h。

[0018] 种子活化培养基(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，葡萄糖5.0，装液量20mL/250mL。

[0019] 种子活化培养基(LBG固体)(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，营养琼脂15.0～20.0。

[0020] 发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆干粉17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

[0021] 发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

[0022] 谷氨酸棒杆菌培养基根据需要添加对应的抗生素：氯霉素(17mg/L)；硫酸卡那霉素(25mg/L)，IPTG添加量终浓度为1.0mM，发酵诱导时间为0h诱导。

[0023] 种子培养：接种一环LBG平板种子于发酵种子培养基，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃培养18h。

[0024] 发酵培养：按10％接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃发酵培养72h。

[0025] 本发明的有益效果：本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamiucm ATCC 13032中，采用两个质粒pEC-XK99E和pXMJ19对L-Phe合成途径不同来源的八个关键酶基因(aroFfbr，tktA，ppsA，aroL，pheAfbr，aroE，aroA，tyrB)结合两个启动子Ptac和Plac进行调控表达，通过理性的改造提高谷氨酸棒状杆菌模式菌株ATCC 13032中L-Phe产量，获得了一株重组谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)，最终通过诱导表达C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)L-Phe产量最高为5.59±0.11g/L，莽草酸积累为0.31±0.11g/L，出发菌株ATCC 13032L-Phe产量为0.16±0.05g/L，莽草酸为0.29±0.02g/L，结果表明可以通过代谢工程的手段过量表达L-Phe合成代谢途径中的关键酶基因并结合调控表达的策略，构建出L-Phe的产生菌株，同时可以应用于提高L-Phe产生菌株L-Phe的产量。

附图说明

[0026] 图1：调控表达载体pSUTL和pSDTL构建流程示意图。

[0027] 图2：PCR以及融合PCR获取莽草酸上游基础质粒pSU组合基因

[0028] 1:DL 1000DNA marker；2:DL 1000DNA marker；3:ppsA-tktA；4:tktA；5:ppsA；6:aroFfbr-aroE；7:aroE；8:aroFfbr

[0029] 图3：莽草酸上游基础质粒pSU酶切验证

[0030] 1:pEC-XK99E-aroFfbr-aroE-ppsA-tktA酶切aroFfbr-aroE；

[0031] 2:pEC-XK99E-ppsA-tktA酶切ppsA-tktA；3:DL 10000DNAmarker

[0032] 图4：PCR以及融合PCR获取莽草酸下游基础质粒pSD组合基因

[0033] 1:tyrB-aroL；2:aroL；3:tyrB；4:pheAfbr-aroA；5:aroA；6:pheAfbr；7:DL 2000DNAmarker

[0034] 图5：莽草酸下游基础质粒pSD酶切验证

[0035] 1:pSD pXMJ19-pheAfbr-aroA-tyrB-aroL双切pheAfbr-aroA；

[0036] 2:pSD pXMJ19-pheAfbr-aroA-tyrB-aroL双切tyrB-aroL和双切tyrB-aroL与pheAfbr-aroA；

[0037] 3:DL1000DNAmarker

[0038] 图6：重组谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)与C.glutamicum ATCC 13032发酵L-Phe以及莽草酸(Shikimate)积累量

[0039] A:菌株C.glutamicum ATCC 13032；B：菌株C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)具体实施方式

[0040] L-Phe的测定：高效液相色谱(HPLC)。

[0041] 仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)。

[0042] 色谱柱：Thermo ODS-2HYPERSIL 4.6*250mm。

[0043] 流动相：A(1L)：无水醋酸钠5.0g，5mL四氢呋喃，200μL三乙胺，pH 7.2。B：无水醋酸钠5.0g(定容200mL，调节pH 7.2)抽虑后加入400mL乙腈和400mL甲醇。

[0044] 色谱条件：流速，1mL/min；柱温，40℃；进样量，10μL；紫外检测器波长，338nm；在线衍生化进样，梯度洗脱程序如下表所示：

[0045]

[0046] 氨基酸样品分析处理：

[0047] 取待分析的样品，在10,000rpm常温离心10min，取上清液使用5％三氯乙酸稀释到合适的浓度，经0.45μm滤膜过滤转移到1.5mL离线管中，10,000rpm常温离心10min供氨基酸液相分析用。

[0048] 实施例1 重组质粒pSUTL和pSDTL构建，以及重组菌株C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)构建。

[0049] 以pEC-XK99E(GenBank:AY219683.1)过量表达四个基因aroFfbr，aroE，ppsA和tktA，同时结合两个启动子Ptac和Plac构建重组质粒pECXK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA简写为pSUTL。以pXMJ19(Jakoby M,Ngouoto-Nkili CE,Burkovski A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors[J]fbr.Biotechnology techniques.1999.13(6):437-441)过量表达四个基因pheA 、aroA、tyrB和aroL，同时结合两个启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL简写为pSDTL。

[0050] 根据构建调控表达载体pSUTL和pSDTL构建流程示意图1所示，aroE、ppsA、tktA和aroA来源于C.glutamicum ATCC 13032基因组；tyrB和aroL来源于Escherichia coli W3110基因组，以对应的模板分别单独获取八个关键酶基因(aroFfbr和pheAfbr基因序列见序列表，aroE(Gene ID:3343183)、ppsA(Gene ID:14791674)、tktA(Gene ID:3343601)、aroA(Gene ID:3345010)、tyrB(Gene ID:12933673)、aroL(Gene ID:12930837)，PCR反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火Tm(根据实际设计的引物而定)30s，延伸72℃(时间根据PCR获取基因的长度而定)(返回到变性步骤重复30个循环)；后延伸72℃10min，并以1％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，结果为扩增得到基因片段与设计的一致见图
2和图3所示，进一步构建融合基因aroFfbr-aroE，ppsA-tktA，pheAfbr-aroA和tyrB-aroL(图2和图3)。将aroFfbr-aroE、ppsA-tktA与pEC-XK99E酶切连接，将pheAfbr-aroA、tyrB-aroL与pXMJ19酶切连接，最终获取八个基因的基础调控质粒pSU和pSD，酶切验证图分别见图3和图
5，进一步对基础质粒pSU和pSD按照图1所示进行酶切两次，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac(SEQ ID NO.3)和Plac(SEQ ID NO.4)，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac，构建获得到重组质粒pSUTL和pSDTL。获取的两个重组质粒pSUTL和pSDTL，通过电击转化到出发菌株C.glutamicum ATCC 13032中，通过菌落PCR验证，获得阳性重组子重组菌株C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)。

[0051] 谷氨酸棒状杆菌电击转化：

[0052] (1)-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态(Xu D,Tan Y,Huan X,Hu X,Wang X.Construction of a novel shuttle vector for use in Brevibacterium flavum,an industrial amino acid producer[J].Journal ofmicrobiological methods.2010.80(1):86-92)，冰浴中融化。

[0053] (2)加入1-5μL预冷质粒混匀(DNA总量约为1μg)，冰浴上放置5-10min。

[0054] (3)加入于预冷的0.1cm电击杯中，1.8KV 5ms电击2次。

[0055] (4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBHIS)1mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后放入冰浴中。

[0056] (5)将菌体置于巡回式摇床(100r/min)上，30℃后培养2h。

[0057] (6)6,000rpm，常温离心1min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。

[0058] (7)感受态效率的验证：阴性对照加入5μL无菌的ddH2O，无菌落形成，阳性对照加入0.1μL的质粒pXMJ19或者pEC-XK99E，长出大量菌落。

[0059] 谷氨酸棒状杆菌重组子验证：

[0060] 将检出平板中的转化子，使用白色无菌枪头挑选单菌落，点种到新的相同抗生素的LBG平板中，置于30℃恒温培养箱培养12h，同时点种到菌落PCR体系中，进行PCR验证之后进行电泳，挑选正确的重组子，对平板中对应的重组子进行转接到LBG液体培养基中，培养12h，提取重组质粒，使用限制性内切酶酶切，DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定。

[0061] 实施例2 重组谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)过量表达L-Phe合成途径八个关键酶基因对L-Phe发酵的影响

[0062] 种子活化培养基(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，葡萄糖5.0。装液量20mL/250mL。

[0063] 种子活化培养基(LBG固体)(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，营养琼脂15.0～20.0。

[0064] 发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆干粉17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

[0065] 发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

[0066] 谷氨酸棒杆菌培养基根据需要添加对应的抗生素：氯霉素(17mg/L)；硫酸卡那霉素(25mg/L)，IPTG添加量终浓度为1.0mM，发酵诱导时间为0h诱导。

[0067] 种子培养：接种一环LBG平板种子于发酵种子培养基，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃培养18h。

[0068] 发酵培养：按10％接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃发酵培养72h。

[0069] 重组谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)与出发菌株C.glutamicum ATCC13032进行发酵实验对比。重组菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)进行诱导发酵72h L-Phe最高产量达到最大值5.59±0.11g/L，莽草酸积累为0.31±0.11g/L，出发菌株C.glutamicum ATCC13032L-Phe产量为0.16±0.05g/L莽草酸为0.29±0.02g/L(图6)。

[0070] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。