一种将多肽或蛋白质共价偶联至微球上的偶联方法

摘要

本发明涉及一种将多肽或蛋白质共价偶联至微球上的偶联方法，其包括步骤：提供微球；提供多肽或蛋白质；将微球与多肽或蛋白质同时接触碳二亚胺和N?羟基硫代琥珀酰亚胺，进行共价偶联反应。利用本方法制备的试剂，有效改善多肽或蛋白质在偶联过程中的自我聚合；且绘制标准曲线时具有更好的线性。

权利要求

1.一种将蛋白质共价偶联至胶乳颗粒上的偶联方法，其包括步骤：

1)取100μL 10％的胶乳颗粒，加2mL 10mM pH值为6.1的MES溶液混匀，15,000rpm离心

50min，弃上清之后，加2mL 10mM pH值为6.1的MES溶液，用吸液器反复抽吸使胶乳颗粒分散混匀，使得胶乳颗粒浓度为0.5％，

2)取4.5μL浓度为22mg/mL的兔抗人Cys-C抗体，用pH7.4的PBS缓冲液稀释到100μL，混匀，

3)将步骤1)获得的胶乳颗粒溶液与40μL步骤2)获得的抗Cys-C抗体溶液混合，置于磁力搅拌器上加转子搅拌15min使两者充分混匀，

4)取25μL的5mg/mL碳二亚胺连同25μL的50mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺同时加到步骤3)所得溶液中，在20至25℃持续搅拌反应3h，

5)反应结束后，将步骤4)所得反应液在15,000rpm离心40min，弃上清，获得偶联有抗Cys-C抗体的胶乳颗粒；

其中，所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，且粒径为150nm，所述步骤1)和步骤2)的顺序是可互换的。

2.一种偶联有抗Cys-C抗体的胶乳颗粒，其是通过权利要求1所述方法所制备的。

3.一种胶乳增强免疫比浊试剂，其含有权利要求2所述的偶联有抗Cys-C抗体的胶乳颗粒。

4.一种胶乳增强免疫比浊试剂盒，其含有权利要求3所述的胶乳增强免疫比浊试剂。

说明书

一种将多肽或蛋白质共价偶联至微球上的偶联方法

[0001] 本申请是申请号为201310236062.8申请日为2013年06月17日发明名称为“一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及生化和临床检验领域。具体而言，本发明涉及一种共价偶联方法。更具体而言，涉及一种将含氨基的分子共价偶联到微球上的偶联方法。

背景技术

[0003] 在传统免疫比浊法当中，如果样本中待检测的抗原或抗体浓度太低、或者分子量过小，则抗原-抗体复合物极难形成浊度，除非放置比较长的时间。如要形成较大的复合物，则抗原和抗体的用量也相应增加。鉴于上述缺陷，便发展出了胶乳增强免疫比浊法。

[0004] 胶乳增强免疫比浊法利用生物化学方法将抗体(或抗原)与微球结合。当样本中待检测的抗原(或抗体)与标记到微球上的抗体(或抗原)相结合时，便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物。这无疑改善了浊度的形成，增强了反应吸光度。利用生化分析仪进行比浊测定，整个分析过程只需几分钟，该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。

[0005] 在进行胶乳增强免疫比浊法过程中，需要将抗体(或抗原)与微球进行结合。结合方式可以分为两大类：物理吸附或共价偶联。其中物理吸附是靠蛋白质分子结构上的疏水基团与微球表面的疏水基团间的相互作用，将抗原或抗体吸附到微球表面。共价偶联法是通过蛋白质与微球表面的化学基团发生反应，将蛋白质共价偶联在微球上。

[0006] 共价偶联法由于特异性好、易保存、分散性良好等特点，现已广泛应用于体外诊断试剂中。市面上可见多种类型的微球，其中最为常见的是聚苯乙烯胶乳颗粒。很多胶乳颗粒表面带有化学基团包括但不限于羧基、氨基、酰肼、醛基、环氧基、巯基、羟基、金属基、硅羟基。这些基团，经过适当的反应，可以共价偶联上各种生物分子。其中，羧基胶乳颗粒可以采用多种策略进行活化，产生能够和蛋白质中的亲核基团(如氨基)发生偶联的反应性中间体。

[0007] 目前为止，用于将蛋白质以及其它含氨基的分子偶联到羧基胶乳颗粒上最常见的反应策略是水溶性碳二亚胺(EDC，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)介导的方法。该方法可以通过两种模式来进行：一步法；或者两步法。

[0008] 在一步法中，EDC直接加到蛋白质与微球混合液中，羧基胶乳颗粒被水溶性EDC激活而产生中间体酯，中间体酯可以直接与蛋白上的氨基发生反应。

[0009] 在两步法中，先用EDC激活胶乳颗粒，再进一步加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)来生成另一个二级中间体酯(NHS-酯或Sulfo-NHS酯)。和一步法的中间体酯相比，NHS-酯或Sulfo-NHS酯在结构上更加稳定。因此，两步法的产量通常更高(Greg T.Hermanson.Bioconjugate Techniques.Academic Press，2010)。

[0010] 偶联过程中，由于大多数蛋白质上同时存在有很多氨基(如赖氨酸、精氨酸残基)和羧基(如丝氨酸、苏氨酸残基)，过量的EDC容易介导蛋白质之间发生自我聚合，两步法能够克服这种缺陷，但是由于步骤繁多，不仅增加了时间成本，企业还不得不编写更多的SOP文件(操作规程文件)、不得不引入更多的质量控制环节。显然，从现代化的大规模生产的角度而言，两步法不是一种经济有效的方式。

[0011] 相比较而言，一步法的步骤简单快捷，更适合大规模生产。但是，自我聚合现象会相对比较严重，这无疑导致了原材料的浪费、成本增加。并且，制备出来的试剂空白值较高，可以想象这势必会有损产品的空白检测限和灵敏度。此外，传统一步法制备的试剂在测绘标准曲线时线性较差，从而最终影响到待测样本的测定值。因此，本领域仍需要一种改进的一步偶联方法。

发明内容

[0012] 发明人将只有两步法中才使用的NHS引入到一步法当中时，出乎意料地发现，通过这种方法所制备的试剂不仅空白低、线性也得到显著改善。并且，Sulfo-NHS比NHS显示出了更加优越的效果。

[0013] 因此，根据本发明的一个方面，提供一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法，其包括步骤：

[0014] 1)提供微球；

[0015] 2)提供含氨基的分子；

[0016] 3)将微球与含氨基的分子混合均匀，获得微球与含氨基的分子的混合物；

[0017] 4)使步骤3)混合物同时接触碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，进行共价偶联反应；

[0018] 5)收获偶联有含氨基的分子的微球，

[0019] 其中所述步骤1)和步骤2)的顺序是可互换的。

[0020] 在一些实施方式中，所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0021] 本发明所用微球可以是任何合适的市售微球，比如Bangs Laboratories、Sigma、Roche、Gibco、Merck、Amresco、Invitrogen、Millipore等供应商都提供有各种型号、规格的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。本领域技术人员可以理解，自行制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒也可以用于实施本发明。

[0022] 在一些实施方式中，所述微球直径为80nm至250nm。然而，本领域技术人员可以理解，本发明的实施并不依赖于微球的尺寸，只要其表面修饰有羧基基团就可以用于实施本发明。微球供应商提供各种不同尺寸的微球，在胶乳增强免疫比浊检测领域当中，常见微球的尺寸为80nm至250nm。在一个具体的实施方式中，所用微球直径为150或200nm。

[0023] 在一些实施方式中，所述含氨基的分子选自多肽或蛋白质。然而，本领域技术人员可以理解，在偶联过程中，羧基微球经活化之后产生能够和亲核基团(如氨基)发生偶联的反应性中间体。鉴于此，理论上而言，任何含有氨基的分子都能通过本申请的方法共价偶联至羧基微球上。在免疫比浊检测的领域当中，通常的做法是将蛋白质或多肽偶联至微球上，以便于借此检测样本中的待测分子。所述蛋白质或多肽包括但不限于抗原、抗体、酶、配体、受体。在一个具体实施方式中，将抗体偶联至微球上。在一个具体实施方式中，将多肽偶联至微球上。

[0024] 在一些实施方式中，步骤1)可以按照现有技术中的一步法操作进行。例如，将微球悬浮在适当的缓冲液中来提供微球，也可以按照微球供应商推荐的方法来提供微球。可用的缓冲液包括，但不限于，MES缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、或者上述缓冲液的组合。缓冲液pH可以在pH 5-8范围内。应当理解，本领域技术人员可以根据胶乳颗粒的类型自行确定缓冲液类型及其pH范围，也可以采用微球供应商推荐的缓冲液。在一个具体的实施方式中，将微球悬浮在MES溶液pH 6-7的缓冲液中来提供微球。

[0025] 在一些实施方式中，步骤2)可以按照现有技术中的一步法操作进行。例如，将含氨基的分子溶解在适当的缓冲液中。在一个具体实施方式中，将抗体溶解在pH7.4的PBS缓冲液中来提供含氨基的分子。但是，应当理解本申请的方法并不限于此，可用的缓冲液包括，但不限于，MES缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、或者上述缓冲液的组合。缓冲液pH可以在pH 5-8范围内。应当理解，本领域技术人员可以根据待偶联的分子自行确定适当的缓冲液类型及其pH范围。

[0026] 在一些实施方式中，使微球和含氨基的分子的混合物同时接触碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，进行共价偶联反应。传统一步法仅采用碳二亚胺一种化合物作为偶联剂。和传统一步法相比，本申请的方法还同时引入了N-羟基琥珀酰亚胺。N-羟基琥珀酰亚胺是在两步法当中才会用到的。两步法中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺是彼此分开，先后加入至反应体系中的。与两步法不同，本申请的方法是使微球和含氨基的分子的混合物同时接触碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。

[0027] 在一些实施方式中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺配制在同一溶液中，加入反应体系。

[0028] 在一些实施方式中，步骤4)的N-羟基琥珀酰亚胺可以替换为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。不限于这种理论，可以认为N-羟基硫代琥珀酰亚胺比N-羟基琥珀酰亚胺带有更多的负电荷，这有助于在微球之间赋予更多的静电排斥力，从而在偶联期间更长时间地保持微球稳定的混悬状态，这进一步改善了自我聚合的现象。

[0029] 在一些实施方式中，可以在传统一步法偶联反应条件下进行偶联反应；也可以按照微球供应商推荐的反应条件进行；也可以按照待偶联分子公知的偶联反应条件进行。本领域技术人员可以根据生产规模、微球规格、含有氨基分子的性质确定适当的反应容器、反应温度、反应时间、是否搅拌以及搅拌速度。对于有些蛋白质，需要在2-8摄氏度的反应温度下进行；对于有些蛋白质，可以在比较广范围的温度下进行，例如2-40摄氏度。反应时间可以为0.5-5小时，优选1-4小时，更优选2-3小时。通常提高搅拌速度有助于反应的进行，但是过快的搅拌速度，由于机械力会破坏蛋白质的活性。因此，本领域技术人员可以自行确定是否搅拌以及搅拌的速度。

[0030] 在一个具体的实施方式中，偶联反应在室温(20-25摄氏度)下进行，温和搅拌，持续2-3小时。

[0031] 在一些实施方式中，可以按照现有技术收获经过偶联的微球。例如，离心、过滤、沉淀等。

[0032] 在一个具体的实施方式中，通过离心来收获经过偶联的微球。

[0033] 根据本发明的另一个方面，本发明提供一种根据上述方法所制备的偶联有含氨基的分子的微球。

[0034] 在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种偶联有抗Cys-C抗体的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0035] 在另一个具体的实施方式中，本发明提供了一种偶联有链球菌溶血素O的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0036] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种胶乳增强免疫比浊试剂，其含有上述偶联有含氨基的分子的微球。

[0037] 在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种Cys-C胶乳增强免疫比浊试剂，其含有偶联有抗Cys-C抗体的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0038] 在另一个具体的实施方式中，本发明提供了一种抗链球菌溶血素O的胶乳增强免疫比浊试剂，其含有偶联有链球菌溶血素O的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0039] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述试剂盒含有上述偶联有含氨基的分子的微球、或含有上述胶乳增强免疫比浊试剂。

[0040] 在一些实施方式中，本发明提供了一种胶乳增强免疫比浊试剂盒，其可以是单试剂形式、或者多试剂形式。

[0041] 在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种Cys-C胶乳增强免疫比浊试剂盒，其是双试剂形式。所述试剂盒含有第一试剂和第二试剂。其中第一试剂含有缓冲液、盐、多聚物、表面活性剂，任选地根据需要还可以含有稳定剂和/或防腐剂。其中第二试剂含有偶联有抗Cys-C抗体的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒和缓冲液，任选地根据需要还可以含有盐、多聚物、表面活性剂、稳定剂和/或防腐剂。

[0042] 其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、PC300中的一种或多种。所述多聚物选自PEG系列、PVP系列中的一种或多种。其中所述非离子表面活性剂选自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中的一种或多种。

[0043] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了根据上述方法所制备的偶联有含氨基的分子的微球在制备诊断试剂中的用途。

附图说明

[0044] 图1：用传统一步法制备的Cys-C胶乳增强免疫比浊试剂绘制的标准曲线。

[0045] 图2：用本发明的方法(加入Sulfo-NHS)制备的Cys-C胶乳增强免疫比浊试剂绘制的标准曲线。

[0046] 图3：用传统一步法制备的抗链球菌溶血素O胶乳增强免疫比浊试剂绘制的标准曲线。

[0047] 图4：用本发明的方法(加入NHS)制备的抗链球菌溶血素O胶乳增强免疫比浊试剂绘制的标准曲线。

具体实施方式

[0048] 为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。除非另有指明，“％”表示质量/体积。

[0049] 以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

[0050] 以下实施例以抗Cys-C抗体和链球菌溶血素O为例进行了测试，但是本领域技术人员能够理解，其它多肽、蛋白质等含有氨基的分子同样可用来实施本发明。

[0051] 术语

[0052] 在本发明上下文中，“多肽”是指α-氨基酸通过肽链连接在一起而形成的化合物，通常含有由2-50个氨基酸组成。

[0053] 在本发明上下文中，“蛋白质”是指α-氨基酸通过肽链连接在一起而形成，再由一条或一条以上的多肽链按照特定方式结合而形成的高分子化合物，通常由50个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质。

[0054] 在本发明上下文中，“聚苯乙烯胶乳颗粒”是指以苯乙烯为单体聚合而成的聚合物；胶乳颗粒的大小，随聚合中各物质的比例不同而异，可根据不同用途进行合成，直径从几十纳米到几微米不等；常见的胶乳颗粒多为表面修饰的，因为此类颗粒可以广泛用于许多领域(如生物化学、医学、药学、色谱柱填料及临床检验等)，这些修饰基团例如羧基、羟基、氨基、乙烯基、偶氮基、酰肼、醛基、环氧基、巯基、金属基、硅羟基等。

[0055] 材料和仪器

[0056]

[0057]

[0058] 实施例1：传统一步法偶联抗Cys-C抗体

[0059] 1)取100μL 10％胶乳颗粒(150nm)，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)混匀，15,000rpm离心50min，弃上清之后，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)用吸液器反复抽吸使胶乳颗粒分散混匀，胶乳颗粒浓度为0.5％。

[0060] 2)取4.5μL浓度为22mg/mL的兔抗人Cys-C抗体，用pH7.4的PBS缓冲液稀释到100μL，混匀。

[0061] 3)将步骤1)获得的微球溶液与40μL步骤2)获得的抗Cys-C抗体溶液混合，置于磁力搅拌器上加转子搅拌15min使两者充分混匀。

[0062] 4)精确称取0.0050g EDC溶于1mL去离子水中获得5mg/mL的EDC，取25μL加到混匀的胶乳颗粒与抗Cys-C抗体混合溶液中，在室温下，持续搅拌反应3h。

[0063] 5)反应结束后，将反应液在15,000rpm离心40min，弃上清，获得偶联有抗Cys-C抗体的胶乳颗粒。

[0064] 实施例2：本发明方法(采用Sulfo-NHS)偶联抗Cys-C抗体

[0065] 1)取100μL 10％胶乳颗粒(150nm)，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)混匀，15,000rpm离心50min，弃上清之后，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)用吸液器反复抽吸使胶乳颗粒分散混匀，胶乳颗粒浓度为0.5％。

[0066] 2)取4.5μL浓度为22mg/mL的兔抗人Cys-C抗体，用pH7.4的PBS缓冲液稀释到100μL，混匀。

[0067] 3)将步骤1)获得的微球溶液与40μL步骤2)获得的抗Cys-C抗体溶液混合，置于磁力搅拌器上加转子搅拌15min使两者充分混匀。

[0068] 4)取25μLEDC(5mg/mL)连同25μLSulfo-NHS(50mg/mL)同时加到混匀的胶乳颗粒与抗Cys-C抗体混合溶液中，在室温下，持续搅拌反应3h。

[0069] 5)反应结束后，将反应液在15,000rpm离心40min，弃上清，获得偶联有抗Cys-C抗体的胶乳颗粒。

[0070] 实施例3：Cys-C试剂的制备

[0071] 取实施例1(或2)收获的胶乳颗粒加2mL 0.01M PBS(pH7.4)超声分散进行清洗；15,000rpm离心40min弃上清；加5mL 0.1M甘氨酸缓冲液(含0.5％BSA，0.05％NaN3，pH 8.4)超声分散获得浓度为0.2％的胶乳颗粒；磁力搅拌30min后，置于2-8℃储存直至使用。

[0072] 配方如下：

[0073] 0.1M甘氨酸缓冲液pH8.4；

[0074] 0.5％BSA；

[0075] 0.2％偶联有抗Cys-C抗体的微球；

[0076] 0.05％NaN3。

[0077] 实施例4：Cys-C诊断试剂盒的制备

[0078] 按照如下配方制备Cys-C诊断试剂盒：

[0079] 第一试剂R1：

[0080] 0.1M甘氨酸缓冲液pH8.4；

[0081] 0.8％NaCl：

[0082] 0.5％PEG-6000：

[0083] 0.05％Tween-20；

[0084] 0.05％NaN3。

[0085] 第二试剂R2：将实施例3制备的Cys-C试剂作为第二试剂R2。

[0086] 分别将第一试剂和第二试剂放置在合适的容器中，例如当用于全自动生化分析仪时，可以将第一试剂和第二试剂放置仪器专用小瓶中。

[0087] 实施例5：绘制标准曲线

[0088] 将实施例4制备的诊断试剂装载到东芝-40生化分析仪上，对Cys-C标准品(0.5、1、2、4、8mg/L)按照如下参数进行检测，并绘制标准曲线：

[0089] 检测模式：两点终点法；

[0090] 主波长/副波长：546nm/700nm；

[0091] 读点：60-62/34-36；

[0092] 反应方向：正向；

[0093] 校准类型：Spline；

[0094] 样品量：2.1μL；

[0095] R1/R2：175μL/35μL。

[0096] 实施例6：实验结果

[0097] 1.用传统一步法获得的微球所配制的试剂的结果见表1和图1：

[0098] 表1.Cys-C标准品测定值(三次重复实验的均值)

[0099]标准品浓度 ΔA A(主-副) A(主)
0 0.0029 0.3328 0.6151
0.5 0.0256 0.3507 0.6585
1 0.0494 0.3847 0.7392
2 0.0815 0.4330 0.8655
4 0.1084 0.4857 1.0115
8 0.1169 0.5113 1.1024

[0100] 采用上述测定值建立标准曲线方程，线性方程和相关系数为：

[0101] Y＝0.0133X+0.0298，r2＝0.7591

[0102] 在实施例1偶联反应的3小时过程中，在后期观察到了自我聚合的现象，颗粒不能稳定地处于混悬状态，有沉淀可见。

[0103] 2.用本发明方法(加Sulfo-NHS)获得的微球所配制的试剂的结果如表2和图2所示：

[0104] 表2.Cys-C标准品测定值(三次重复实验的均值)

[0105]标准品浓度 ΔA A(主-副) A(主)
0 -0.0033 0.2883 0.5161
0.5 0.0024 0.3008 0.5497
1 0.0086 0.3127 0.5805
2 0.0281 0.3483 0.6652
4 0.0723 0.4205 0.8519
8 0.1099 0.4963 1.0747

[0106] 采用上述测定值建立标准曲线方程，线性方程和相关系数为：

[0107] Y＝0.0148X-0.002，r2＝0.9709

[0108] 在实施例2偶联反应的3小时过程中，全程均没有观察到自我聚合的现象，颗粒稳定地处于混悬状态。并且申请人还尝试将反应时间延长至更长的时间比如4小时的时候，仍然可以保持混悬状态，未见胶乳颗粒的聚集。

[0109] 从理论上而言，理想的线性方程应当是经过原点的。通过比较可见，当X＝0时，Y＝0.0298(传统方法)，Y＝-0.002(本发明方法)；当Y＝0时，X＝-2.24(传统方法)，X＝0.135(本发明方法)。这意味着本发明的方法所获得的线性方程与坐标轴的交叉点更加靠近原点。

[0110] 并且，本发明的方法具有更好的线性相关系数r2＝0.9709(而传统方法的线性相关系数仅为0.7591)。技术人员知道，r2越接近1相关性越强。可见这种优良线性完全能够满足临床检验的应用要求。

[0111] 实施例7：传统一步法偶联链球菌溶血素O

[0112] 1)取100μL 10％胶乳颗粒(200nm)，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)混匀，15,000rpm离心50min，弃上清之后，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)用吸液器反复抽吸使胶乳颗粒分散混匀，胶乳颗粒浓度为0.5％。

[0113] 2)取1mg链球菌溶血素O溶于1ml pH7.4的PBS缓冲液中，混匀。

[0114] 3)将步骤1)获得的微球溶液与40μL步骤2)获得的链球菌溶血素O溶液混合，置于磁力搅拌器上加转子搅拌15min使两者充分混匀。

[0115] 4)取25μLEDC(5mg/mL)加到混匀的胶乳颗粒与链球菌溶血素O混合溶液中，在室温下，持续搅拌反应2h。

[0116] 5)反应结束后，将反应液在15,000rpm离心40min，弃上清，获得偶联有链球菌溶血素O的胶乳颗粒。

[0117] 实施例8：本发明方法(采用NHS)偶联链球菌溶血素O

[0118] 1)取100μL 10％胶乳颗粒(200nm)，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)混匀，15,000rpm离心50min，弃上清之后，加2mL 10mM MES溶液(pH6.1)用吸液器反复抽吸使胶乳颗粒分散混匀，胶乳颗粒浓度为0.5％。

[0119] 2)取1mg链球菌溶血素O溶于1ml pH7.4的PBS缓冲液中，混匀。

[0120] 3)将步骤1)获得的微球溶液与40μL步骤2)获得的链球菌溶血素O溶液混合，置于磁力搅拌器上加转子搅拌15min使两者充分混匀。

[0121] 4)取25μL EDC(5mg/mL)连同25μLNHS(20mg/mL)同时加到混匀的胶乳颗粒与链球菌溶血素O混合溶液中，在室温下，持续搅拌反应2h。

[0122] 5)反应结束后，将反应液在15,000rpm离心40min，弃上清，获得偶联有链球菌溶血素O的胶乳颗粒。

[0123] 实施例9：链球菌溶血素O试剂的制备

[0124] 取实施例7(或8)收获的胶乳颗粒加2mL 0.01M PBS(pH7.4)超声分散进行清洗；离心弃上清；加5mL 0.1M pH8.4甘氨酸缓冲液(含有0.5％BSA、0.1％NaN3)超声分散获得浓度为0.2％的胶乳颗粒；磁力搅拌30min后，置于2-8℃储存直至使用。

[0125] 配方如下：

[0126] 0.1M pH8.4甘氨酸缓冲液；

[0127] 0.5％BSA：

[0128] 0.1％NaN3；

[0129] 0.2％偶联有链球菌溶血素O的微球。

[0130] 实施例10：抗链球菌溶血素O诊断试剂盒的制备

[0131] 按照如下配方制备抗链球菌溶血素O诊断试剂盒：

[0132] 第一试剂R1：

[0133] 0.1M pH8.4甘氨酸缓冲液；

[0134] 300mM NaCl：

[0135] 0.1％Tween 20；

[0136] 1％PEG6000；

[0137] 0.1％NaN3。

[0138] 第二试剂R2：将实施例9制备的链球菌溶血素O试剂作为第二试剂R2。分别将第一试剂和第二试剂放置在合适的容器中，例如当用于全自动生化分析仪时，可以将第一试剂和第二试剂放置仪器专用的小瓶中。

[0139] 实施例11：绘制标准曲线

[0140] 将实施例10制备的诊断试剂装载到东芝-40生化分析仪上，对链球菌溶血素O标准品(50、100、200、400、800IU/mL)按照如下参数进行检测，并绘制标准曲线：

[0141] 检测模式：两点终点法；

[0142] 主波长/副波长：570nm/700nm；

[0143] 读点：48-50/34-36

[0144] 反应方向：正

[0145] 校准类型：Spline；

[0146] 样品量：3μL；

[0147] R1/R2：240μL/60μL。

[0148] 实施例12：实验结果

[0149] 1.用传统一步法(实施例7)获得的微球所配制的试剂的结果，如表3和图3所示：

[0150] 表3.链球菌溶血素O标准品测定值(三次重复实验的均值)

[0151]标准品浓度 ΔA A(主-副) A(主)
0 0.1893 0.4990 0.6679
50 0.2375 0.5234 0.7260
100 0.3350 0.5408 0.8137
200 0.4373 0.5659 0.9813
400 0.5046 0.6180 1.2906
800 0.5918 0.7255 1.3438

[0152] 采用上述测定值建立标准曲线方程，线性方程和相关系数为：

[0153] Y＝0.0005X+0.2597，r2＝0.8367

[0154] 在实施例7偶联反应的2小时过程中，在后期观察到了自我聚合的现象，颗粒不能稳定地处于混悬状态，有沉淀可见。

[0155] 2.用本发明方法(实施例8)获得的微球所配制的试剂的结果如表4和图4所示：

[0156] 表4.链球菌溶血素O标准品测定值(三次重复实验的均值)

[0157]标准品浓度 ΔA A(主-副) A(主)
0 -0.0018 0.4156 0.6613
50 0.0751 0.4490 0.7348
100 0.1263 0.4884 0.8283
200 0.2280 0.5594 0.9958
400 0.4544 0.6961 1.3348
800 0.6047 0.8137 1.5641

[0158] 采用上述测定值建立标准曲线方程，线性方程和相关系数为：

[0159] Y＝0.0008X+0.0515，r2＝0.9407

[0160] 在实施例8偶联反应的2小时过程中，全程均没有观察到自我聚合的现象，颗粒稳定地处于混悬状态。申请人继续尝试将反应时间延长至更长的时间比如3-4小时，开始见到较微弱的胶乳颗粒聚集。和实施例2的情况相比，可见Sulfo-NHS对于抗自我聚合的效果要优于NHS。但是无论如何，加入NHS仍然比传统的偶联方法具有更好的抗自我聚合效果。

[0161] 本发明的方法比传统方法具有更好的线性相关系数r2＝0.9407。技术人员知道，r2越接近1相关性越强。可见这种优良线性完全能够满足临床检验的应用要求。