具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体转让专利
申请号 : CN201380041416.1
文献号 : CN104540852B
文献日 : 2018-10-02
发明人 : G·D·扬科普洛斯 , N·J·帕帕多普洛斯 , A·J·墨菲 , N·斯塔尔
申请人 : 瑞泽恩制药公司
摘要 :
本发明提供在中性pH比在酸性pH以更大亲和力专一地与原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9(PCSK9)结合的抗体及其抗原结合片段。本发明之抗体相较于不具有pH‑依赖性结合特性之抗体，可以具有一或多个氨基酸改变。例如，本发明包括在一或多个互补决定区具有一或多个组氨酸取代的抗‑PCSK9抗体。本发明的具有pH‑依赖性结合性质之抗体，相较于不具有pH‑依赖性结合性质之抗‑PCSK9抗体，延长时间地保留在动物对象的循环中和展现出降胆固醇活性。本发明之抗体因此可用于治疗与升高的HDL胆固醇有关之疾病和病症，其中本发明之抗体，相较于不具有pH‑依赖性结合性质之抗体，可以以较低剂量及/或较低频率施用于病患。
权利要求 :
1.一种与人原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)结合之分离的抗体或其抗原结合片段，其中：(a)按表面等离子体共振测定，该抗体或其抗原结合片段在中性pH比在酸性pH以高至少13倍的亲和力与PCSK9结合；
(b)按表面等离子体共振测定，在25℃时该抗体或其抗原结合片段与PCSK9结合之酸性/中性KD比值大于12.5；
(c)按表面等离子体共振测定，在25℃时该抗体或其抗原结合片段与PCSK9结合之酸性/中性kd比值大于7.5；
(d)按表面等离子体共振测定，在25℃时该抗体或其抗原结合片段与PCSK9结合之酸性/中性t1/2比值小于0.14；
(e)该抗体或其抗原结合片段在25℃及酸性pH以小于4.5分钟之解离半衰期(t1/2)与1
PCSK9结合，其中该抗体或其抗原结合片段在25℃及中性pH以大于35分钟之t/2与PCSK9结合；
(f)按表面等离子体共振测定，该抗体或其抗原结合片段在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比该抗体在中性pH与PCSK9结合之t1/2短至少10倍；或(g)该抗体或其抗原结合片段在中性pH比在酸性pH以高至少12倍的亲和力与PCSK9结合，其中该抗体或其抗原结合片段在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比该抗体在中性pH与PCSK9结合之t1/2短至少10倍；
且其中该抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)及3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1序列为SEQ ID NO：220；
其中HCDR2序列为SEQ ID NO：222；
其中HCDR3序列为SEQ ID NO：224或788；
其中LCDR1序列为SEQ ID NO：802；
其中LCDR2序列为SEQ ID NO：230；及
其中LCDR3序列为SEQ ID NO：232。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，在(a)中，该抗体或其抗原结合片段在中性pH比在酸性pH以高至少14或15倍的亲和力与PCSK9结合。
3.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中，在(e)中，该抗体或其抗原结合片段在25℃及酸性pH以小于2分钟或小于1.5分钟之解离半衰期(t1/2)与PCSK9结合，其中该抗体或其抗原结合片段在25℃及中性pH以大于35分钟之t1/2与PCSK9结合。
4.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中在(f)中，该抗体或其抗原结合片段
1 1
在酸性pH与PCSK9结合之t/2比该抗体在中性pH与hPCSK9结合之t/2短至少15倍或至少20倍。
5.权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段在中性pH以如下IC50阻断人原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)和低密度脂蛋白受体(LDLR)间的相互作用，其中所述IC50值比该抗体或其抗原结合片段在酸性pH的PCSK9/LDLR阻断IC50值小至少36倍。
6.权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段当以10mg/kg之单一剂量施用给对象时，与基线相比使血清LDL-C降低至少33％，且其中该血清LDL-C降低在施用后持续至少26天、或至少33天。
7.权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段当以10mg/kg之单一剂量施用给对象时，与基线相比使血清LDL-C降低至少15％，且其中该血清LDL-C降低在施用后持续至少42天或至少55天。
8.权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，(a)其中HCVR序列为SEQ ID NO：218；且其中LCVR序列为含有L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体；或(b)其中HCVR序列为含有D106H氨基酸取代之SEQ ID NO：218的变体；且其中LCVR序列为含有L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求1至4之任一项的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗高胆固醇血症或用于降低血清LDL-C水平的药物中的用途。
说明书 :
具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体
技术领域
[0001] 本发明涉及特异地与原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)相互作用的抗原结合分子，及此等分子治疗高胆固醇血症及其它特征为胆固醇水平升高的相关病症
的用途。
的用途。
背景技术
[0002] 原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)为一种原蛋白转化酶，属于分泌性枯草杆菌酶(subtilase)家族之蛋白酶K亚家族。此编码的蛋白被合成为可溶性酶原，
其在内质网中经历自催化的分子内加工。循环PCSK9与肝细胞表面上的低密度脂蛋白受体
(LDLR)结合，并靶向破坏该受体。此过程降低了肝结合和移除LDL胆固醇(LDL-C)的能力，因此造成LDL-C水平增加。特异与PCSK9结合并阻断其与LDL受体之相互作用的抗体已被证明，对于降低人受试者中血浆LDL-C量具有治疗上的效用。(参见，例如Stein等人,New
Engl.J.Med.2012；366:1108-1118)。
其在内质网中经历自催化的分子内加工。循环PCSK9与肝细胞表面上的低密度脂蛋白受体
(LDLR)结合，并靶向破坏该受体。此过程降低了肝结合和移除LDL胆固醇(LDL-C)的能力，因此造成LDL-C水平增加。特异与PCSK9结合并阻断其与LDL受体之相互作用的抗体已被证明，对于降低人受试者中血浆LDL-C量具有治疗上的效用。(参见，例如Stein等人,New
Engl.J.Med.2012；366:1108-1118)。
[0003] 产生治疗效用所需的抗体给药剂量及/或给药频率一般取决于可被单一抗体分子中和的抗原数。例如，如果在抗体于宿主内被靶向降解前该抗体仅可结合及中和一个抗原，则必须施用相当大量的抗体以产生治疗效用、和/或必须相对频繁地施用抗体。另一方面，若单一抗体在降解前能重复地与多个抗原结合，则为了产生有效的治疗反应，所需施用的
抗体减少，且可以以较低的频率给药。
抗体减少，且可以以较低的频率给药。
[0004] 本领域需要能结合PCSK9的新治疗分子，与目前已知和可得的PCSK9拮抗剂相比，该新治疗分子可以更长期地和/或以更低的给药量产生有效治疗反应。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供对原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)具有pH-依赖性结合的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括在中性pH中比在酸性pH中以较大亲和力
与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段(亦即，在酸性pH中结合亲和力降低)。如文中所述之实施例中所示，在酸性pH中结合亲和力降低之抗-PCSK9抗体，相较于在酸性pH中不显示结
合亲和力降低之抗体，具有各种改良的/增进的生物特性。例如，在酸性pH中结合亲和力降低之本发明抗-PCSK9抗体，当施用给动物对象(包括人类病患)时，相较于在酸性pH中不具
有降低的结合亲和力之抗-PCSK9抗体，其在循环中具有较长的半衰期。换言之，在酸性pH中结合PCSK9的亲和力降低之本发明抗-PCSK9抗体，比缺乏pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体，
被更缓慢地从循环中清除。更缓慢的抗体清除(亦即较长的循环半衰期)与本发明抗体较长
的降胆固醇效力相关。因此，本发明之抗体可以较低频率及/或较低剂量地施用于对象，并且与在酸性pH中不具有降低的结合亲和力之抗-PCSK9抗体相比，仍具有相等(或更佳)的效
力。
与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段(亦即，在酸性pH中结合亲和力降低)。如文中所述之实施例中所示，在酸性pH中结合亲和力降低之抗-PCSK9抗体，相较于在酸性pH中不显示结
合亲和力降低之抗体，具有各种改良的/增进的生物特性。例如，在酸性pH中结合亲和力降低之本发明抗-PCSK9抗体，当施用给动物对象(包括人类病患)时，相较于在酸性pH中不具
有降低的结合亲和力之抗-PCSK9抗体，其在循环中具有较长的半衰期。换言之，在酸性pH中结合PCSK9的亲和力降低之本发明抗-PCSK9抗体，比缺乏pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体，
被更缓慢地从循环中清除。更缓慢的抗体清除(亦即较长的循环半衰期)与本发明抗体较长
的降胆固醇效力相关。因此，本发明之抗体可以较低频率及/或较低剂量地施用于对象，并且与在酸性pH中不具有降低的结合亲和力之抗-PCSK9抗体相比，仍具有相等(或更佳)的效
力。
[0007] 不受限于理论，据信，相较于中性pH，在酸性pH中具有较低结合亲和力之抗-PCSK9抗体，会在内涵体(endosome)的酸性环境中与抗原解离，并被再循环到血浆，在该处其能进行另外回合的治疗性抗原结合。此现象称为「抗体的再循环」或「捉放」，因为单一抗体分子可结合和中和多个抗原，该现象能大大地改善抗体的体内效力。相反地，相较于中性pH，在酸性pH中以相等或较大的亲和力与PCSK9结合之抗体，由于其在内涵体中与抗原的强力结合，仅在单次抗体-抗原结合后，即循着路径到达溶酶体以降解。
[0008] 抗-PCSK9抗体之结合特性可在体外藉由例如表面等离子体共振来定量，其可以提供抗体与PCSK9在中性pH和酸性pH中结合时的结合性质的数值(例如ka、kd、KD、t1/2等)。这些参数可用于确定抗体与PCSK9结合是否具有pH-依赖性结合特性。本发明因此包括，按表
面等离子体共振测定，在中性pH中比在酸性pH中以至少高5倍的亲和力与PCKS9结合的抗体
或其抗原结合片段(或反言之，按表面等离子体共振所测，该抗体在酸性pH中比在中性pH中以至少低5倍的亲和力与PCSK9结合)。本发明亦包括与PCSK9结合之抗体或其抗原结合片
段，其中，如表面等离子体共振所测，其在酸性pH中结合PCSK9之t1/2比在中性pH中结合
PCSK9之t1/2短至少5倍(或反言之，如表面等离子体共振所测，该抗体在中性pH中结合
PCSK9之t1/2比其在酸性pH中结合PCSK9之t1/2长至少5倍)。根据某些实施方案，本发明提
供，在中性pH中比在酸性pH中以高至少5倍之亲和力与PCSK9结合、且在酸性pH中与PCSK9结合之t1/2比在中性pH中与PCSK9结合之t1/2短至少5倍的抗-PCSK9抗体。
面等离子体共振测定，在中性pH中比在酸性pH中以至少高5倍的亲和力与PCKS9结合的抗体
或其抗原结合片段(或反言之，按表面等离子体共振所测，该抗体在酸性pH中比在中性pH中以至少低5倍的亲和力与PCSK9结合)。本发明亦包括与PCSK9结合之抗体或其抗原结合片
段，其中，如表面等离子体共振所测，其在酸性pH中结合PCSK9之t1/2比在中性pH中结合
PCSK9之t1/2短至少5倍(或反言之，如表面等离子体共振所测，该抗体在中性pH中结合
PCSK9之t1/2比其在酸性pH中结合PCSK9之t1/2长至少5倍)。根据某些实施方案，本发明提
供，在中性pH中比在酸性pH中以高至少5倍之亲和力与PCSK9结合、且在酸性pH中与PCSK9结合之t1/2比在中性pH中与PCSK9结合之t1/2短至少5倍的抗-PCSK9抗体。
[0009] 根据本发明特定的实施方案，提供抗-PCSK9抗体，当其以约10mg/kg之剂量施用给对象时，与基线相比降低血清LDL-C至少25％，并维持血清LDL-C的降低至少20天。
[0010] 本发明之抗-PCSK9抗体可例如藉由使不具有pH-依赖性结合或仅具有中间型pH-依赖性结合之亲本抗-PCSK9抗体的氨基酸序列突变，藉此产生具有pH-依赖性结合的变体
抗-PCSK9抗体。例如，可以将亲本抗-PCSK9抗体之一或多个互补决定区(CDR)内的一或多个氨基酸改变为组氨酸残基，该生成的组氨酸变体抗体可以就pH-依赖性结合(例如相较于在
中性pH中，在酸性pH中对PCSK9的亲和力降低)，进行测试。
抗-PCSK9抗体。例如，可以将亲本抗-PCSK9抗体之一或多个互补决定区(CDR)内的一或多个氨基酸改变为组氨酸残基，该生成的组氨酸变体抗体可以就pH-依赖性结合(例如相较于在
中性pH中，在酸性pH中对PCSK9的亲和力降低)，进行测试。
[0011] 根据本发明可以在氨基酸序列水平作修饰以产生具有增进的pH-依赖性结合性质之变体抗-PCSK9抗体的一个示例性亲本抗-PCSK9抗体，为称作300N的抗体。备选地，可以使用包含抗体300N之重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)(亦即包括SEQ ID NO：218/226)或包括
抗体300N之重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)(亦即包括SEQ ID
NOs:220-222-224-228-230-232)的任何抗-PCSK9抗体，作为亲本抗体，经由组氨酸取代诱
变从其产生具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体。此外，包括本文表1中所述之HCVR/
LCVR氨基酸序列对、或HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的任何抗-
PCSK9抗体或其抗原结合片段，可用作为亲本抗体，经由组氨酸取代诱变从其产生具有pH-
依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体。
抗体300N之重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)(亦即包括SEQ ID
NOs:220-222-224-228-230-232)的任何抗-PCSK9抗体，作为亲本抗体，经由组氨酸取代诱
变从其产生具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体。此外，包括本文表1中所述之HCVR/
LCVR氨基酸序列对、或HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的任何抗-
PCSK9抗体或其抗原结合片段，可用作为亲本抗体，经由组氨酸取代诱变从其产生具有pH-
依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体。
[0012] 本发明包括治疗疾病和病症之方法，其中该疾病和病症藉由拮抗PCSK9，例如藉由阻断PCSK9与LDL受体(LDLR)之相互作用，为可治疗及/或改善的。根据本发明此方面之方法包括：给有此需要之对象施用包含具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体或其抗原结合
片段的药物组合物。根据本发明此方面之方法可用于治疗，例如高胆固醇血症和如文中他
处所述及的其它相关疾病或病症。
片段的药物组合物。根据本发明此方面之方法可用于治疗，例如高胆固醇血症和如文中他
处所述及的其它相关疾病或病症。
[0013] 本发明亦包括治疗性给药疗法，其包括：给有此需要之对象施用多个剂量之具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体。根据本发明此方面的特定实施方案，具有pH-依赖性
结合特性之抗-PCSK9抗体的各个剂量可以以低于一个月一次之频率施用于对象(例如每二
个月一次、每三个月一次、每四个月一次等)。
结合特性之抗-PCSK9抗体的各个剂量可以以低于一个月一次之频率施用于对象(例如每二
个月一次、每三个月一次、每四个月一次等)。
[0014] 本发明包括：具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段用于治疗疾病和病症，其中所述疾病和病症通过拮抗PCSK9，例如通过阻断PCSK9与LDL受体(LDLR)的相互作用，是可治疗的和/或得到改善，所述疾病和病症包括本文特别述及的任何示例性PCSK9相关疾病和病症。具有pH-依赖性结合特性的本发明抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段
可以根据本文教导的治疗性给药疗法予以施用。
可以根据本文教导的治疗性给药疗法予以施用。
[0015] 本发明包括药物组合物用于治疗疾病和病症，其中所述疾病和病症通过拮抗PCSK9，例如通过阻断PCSK9与LDL受体(LDLR)的相互作用，是可治疗的和/或得到改善，所述疾病和病症优选本文在治疗可以通过拮抗PCSK9予以治疗和/或改善的疾病和病症的方法
中所教导的那些疾病和病症。根据本发明此方面的药物组合物可以包含用于治疗如下疾病
和病症的具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病和病
症可以通过拮抗PCSK9得到治疗和/或改善。本发明的药物组合物可以根据本文教导的治疗
性给药疗法进行施用。
中所教导的那些疾病和病症。根据本发明此方面的药物组合物可以包含用于治疗如下疾病
和病症的具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病和病
症可以通过拮抗PCSK9得到治疗和/或改善。本发明的药物组合物可以根据本文教导的治疗
性给药疗法进行施用。
[0016] 从后续的发明详述中，本发明其它的实施方案将是显而易见的。
附图说明
[0017] 图1显示，在以1mg/kg剂量给小鼠皮下施用抗PCSK9抗体后，在不同时间点在小鼠中测定的抗PCSK9抗体的血清浓度，其中所述小鼠仅表达小鼠PCSK9(即，不表达人PCSK9)。
[0018] 图2A、2B和2C显示，在以1mg/kg剂量给小鼠皮下施用抗PCSK9抗体后，在不同时间点在小鼠中测定的抗PCSK9抗体的血清浓度，其中所述小鼠表达人PCSK9(替代小鼠PCSK9)。
用于图2A、2B和2C所述实验中的抗体描述在本文表5中。
用于图2A、2B和2C所述实验中的抗体描述在本文表5中。
[0019] 图3A-3G显示从表面等离子体共振结合实验获得的传感图，在所述实验中抗PCSK9抗体被允许在中性pH(pH7.4)与人PCSK9抗原结合，之后转移至具有不同pH(7.2、7.4、6.0和
5.75)的缓冲液用于解离相。实验中所用抗体为：316P(v1)和300N(v2)(图3A)；VH-D106H和VK-L30H(图3B)；VH-D106H/VK-L30H和比对物1(图3C)；比对物2和比对物3(图3D)；比对物4和比对物5(图3E)；比对物6和比对物7(图3F)；和比对物8和比对物9(图3G)。每幅图中的各条线代表相应抗体在不同浓度的结合反应。用于这些实验的抗体描述在本文表5中。所有实验在37℃进行。解离半衰期值(t1/2)标注在各个传感图的上方。
5.75)的缓冲液用于解离相。实验中所用抗体为：316P(v1)和300N(v2)(图3A)；VH-D106H和VK-L30H(图3B)；VH-D106H/VK-L30H和比对物1(图3C)；比对物2和比对物3(图3D)；比对物4和比对物5(图3E)；比对物6和比对物7(图3F)；和比对物8和比对物9(图3G)。每幅图中的各条线代表相应抗体在不同浓度的结合反应。用于这些实验的抗体描述在本文表5中。所有实验在37℃进行。解离半衰期值(t1/2)标注在各个传感图的上方。
[0020] 发明详述
[0021] 在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此等方法和条件可改变。亦应了解，文中所用的术语仅作为描述特定实施方案之目的，并不旨在构成限制，本发明之范围仅受限于后附的权利要求书。
[0022] 除非另有说明，否则文中所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属技术之一般技术人员所通常理解的含义。如文中所用，术语“大约”当用于具体述及的数值时，指该值可以从该述及的值发生不大于1％的偏离。例如，如文中所用，表述“约100”包括99和101及所有介于之间的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0023] 现描述优选方法和材料，但是在施行或试验本发明时可使用与文中所述类似或相当的任何方法和材料。
[0024] 一般定义
[0025] 表述“原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型”、“PCSK9”或“PCSK9片段”及其类似表述，在文中，除非特别指出来自非人物种(例如“小鼠PCSK9”、“小鼠PCSK9片段”、“猴PCSK9”、“猴PCSK9片段”等)，否则涉及人PCSK9蛋白或片段。人PCSK9(有时在文中缩写为“hPCSK9”)具有如SEQ ID NO:755所述之氨基酸。
[0026] 术语“抗体”如文中所用，系指包括至少一个与特定抗原(例如PCSK9)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的、任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括：包含四条多肽链——藉由二硫键相连的二条重(H)链和二条轻(L)链——的免疫球蛋白分子
以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包括重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)及重链恒定区。
重链恒定区包括三个域，CH1、CH2和CH3。每条轻链系包括轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下列顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)之FR可以与人种系序列相同，或可以经自然
或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于二或多个CDR之并排(side-by-side)分析来定义。术语“抗体”在本文中涵盖重组抗体。
以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包括重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)及重链恒定区。
重链恒定区包括三个域，CH1、CH2和CH3。每条轻链系包括轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下列顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)之FR可以与人种系序列相同，或可以经自然
或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于二或多个CDR之并排(side-by-side)分析来定义。术语“抗体”在本文中涵盖重组抗体。
[0027] 术语“抗体”，如文中所用，亦包括全抗体分子之抗原结合片段。术语抗体之“抗原结合部分”、抗体之“抗原结合片段”等等，如文中所用，包括任何与抗原特异性结合形成复合物之天然的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗体之抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术，例如蛋白酶解消化、或涉及操作和表达编码抗体可变区和可选地恒定区之DNA的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。此DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)取得，或可合成。可以通过化学方式或藉由使用分子生物技术来测序和操作此DNA，例如将一或多个可变及/或恒定区
安排成合适的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
安排成合适的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
[0028] 抗原结合片段之非限定实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区之氨基酸残基组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)，或限制的FR3-CDR3-
FR4肽(constrained peptide)。其它工程化分子，例如域特异性抗体、单域抗体、域缺失抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药(SMIP)及鲨可变IgNAR域，亦涵盖在文中所用的“抗原结合片段”之表述内。
FR4肽(constrained peptide)。其它工程化分子，例如域特异性抗体、单域抗体、域缺失抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药(SMIP)及鲨可变IgNAR域，亦涵盖在文中所用的“抗原结合片段”之表述内。
[0029] 抗体之抗原结合片段典型地包括至少一个可变域。可变域可为任何大小或氨基酸组成，且一般包括与一或多个构架序列相邻或符合读框的至少一个CDR。在具有与VL域结合的VH域之抗原结合片段中，VH和VL域的彼此相对位置可以为任何合适的安排方式。例如可
变区可为二聚体，含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体之抗原结合片段可含有单体VH或VL区。
变区可为二聚体，含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体之抗原结合片段可含有单体VH或VL区。
[0030] 在特定的实施方案中，抗体之抗原结合片段可含有与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以存在于本发明之抗体的抗原结合片段中的非限制性示例性可变和恒
定域构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在任何可变和恒定域构型中，包括上列任何的示例性构型，可变域和恒定域可直接彼此相连接或可藉由完整或部分
的绞链区或接头区相连。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定域间产生柔性或半柔性连结。在一些实施方案中，铰链区由2至60个氨基酸，例如5-50个氨基酸或10-40个氨基酸组成。再者，本发明之抗体的抗原结合片段可以包括任何上列的可变和恒定域构型的同源二聚体或异源二聚体
(或其它多聚体)，其中所述构型非共价或共价地彼此相互连接和/或与一或多个单体VH或
VL域连接(例如以二硫键)。
定域构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在任何可变和恒定域构型中，包括上列任何的示例性构型，可变域和恒定域可直接彼此相连接或可藉由完整或部分
的绞链区或接头区相连。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定域间产生柔性或半柔性连结。在一些实施方案中，铰链区由2至60个氨基酸，例如5-50个氨基酸或10-40个氨基酸组成。再者，本发明之抗体的抗原结合片段可以包括任何上列的可变和恒定域构型的同源二聚体或异源二聚体
(或其它多聚体)，其中所述构型非共价或共价地彼此相互连接和/或与一或多个单体VH或
VL域连接(例如以二硫键)。
[0031] 术语“人抗体”，如文中所用，旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列之可变和恒定区的抗体。本发明之人抗体可以，例如在CDR中及特别是CDR3中，包括非由人种系免疫球蛋白序列编码之氨基酸残基(例如藉由随机或体外定点诱变或体内体细胞突变而导入的突变)。然而，术语“人抗体”，如文中所用，不旨在包括这样的抗体，其中衍生自其它哺乳动物物种(例如小鼠)之种系的CDR序列被稼接到人构架序列上。在某些实施方案中，人抗体可以是重组人抗体，定义见下文。
[0032] 术语“重组人抗体”，如文中所用，旨在包括通过重组方法制备、表达、构建、或分离的所有人抗体，例如，使用转染至宿主细胞中的重组表达载体(进一步详述于下)表达的抗体，由重组的组合人抗体文库(进一步详述于下)分离的抗体，由经人免疫球蛋白基因转基
因之动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-
6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列拼接的任何其它方法而制备、
表达、产生或分离的抗体。重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区。
然而，在一些实施方案中，重组人抗体发生体外诱变(或，当使用以人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体之VH和VL区的氨基酸序列，尽管源自人种系VH和VL序列且与之相关，但可能并不天然存在于体内人抗体种系库(repertoire)中。
因之动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-
6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列拼接的任何其它方法而制备、
表达、产生或分离的抗体。重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区。
然而，在一些实施方案中，重组人抗体发生体外诱变(或，当使用以人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体之VH和VL区的氨基酸序列，尽管源自人种系VH和VL序列且与之相关，但可能并不天然存在于体内人抗体种系库(repertoire)中。
[0033] 人抗体可以以二种与绞链异质性有关之形式存在。第一种形式，免疫球蛋白分子包括约150-160kDa的稳定四链结构，其中二聚体藉由链间重链二硫键靠在一起。第二种形
式，二聚体不经由二硫键连接，形成由共价偶联的轻链和重链组成的约75-80kDa之分子(半抗体)。这些形式极难分离，即使在亲和纯化后。
式，二聚体不经由二硫键连接，形成由共价偶联的轻链和重链组成的约75-80kDa之分子(半抗体)。这些形式极难分离，即使在亲和纯化后。
[0034] 在各种完整的IgG同种型中，第二种形式出现的频率系因(但不限于)与抗体之绞链区同种型有关的结构差异所致。在人IgG4绞链之绞链区中单一氨基酸取代可显著地降低
第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)，达到使用人IgG1绞链时所典型观察到的水平。本发明涵盖绞链、CH2或CH3区中具有一或多个突变之抗体，所述突变可能是期望的，例如在生产上，用以改善期望抗体形式之产率。
第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)，达到使用人IgG1绞链时所典型观察到的水平。本发明涵盖绞链、CH2或CH3区中具有一或多个突变之抗体，所述突变可能是期望的，例如在生产上，用以改善期望抗体形式之产率。
[0035] “分离的抗体”，如文中所用，指已经获得鉴定、以及从其天然环境的至少一个成分中分离和/或回收的抗体。例如，已经从生物体的至少一个成分中、或从抗体天然所在的组织或细胞中、或天然产生抗体的组织或细胞中分离或移出之抗体，是本发明的“分离抗体”。分离的抗体亦包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体为已经历经至少一个纯化或分离步
骤之抗体。根据一些实施方案，分离的抗体可以实质性地不含有其它细胞物质和/或化学
物。
骤之抗体。根据一些实施方案，分离的抗体可以实质性地不含有其它细胞物质和/或化学
物。
[0036] “中和”或“阻断”抗体，如文中所用，旨在指这样的抗体，该抗体与PCSK9之结合降低或可检查地抑制PCSK9和LDL受体(LDLR)或LDLR之胞外片段间的相互作用.
[0037] 相较于抗体所源自的相应种系序列，文中所公开的抗-PCSK9抗体可在重链和轻链可变域之构架及/或CDR区中包括一或多个氨基酸取代、插入及/或缺失(例如，1、2、3、4、5、
6、7、8、9、或10个取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个插入，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个缺失)。此等突变可藉由将文中所揭示之氨基酸序列与得自例如公开的抗体序列文
库之种系序列相比较，容易地加以确定。赋予本发明抗-PCSK9抗体pH-依赖性结合特性之特定的氨基酸改变详细论述于文中他处。本发明包括由任何文中所揭示的氨基酸序列所衍生
之抗体及其抗原结合片段，其中在一或多个构架及/或CDR区中的一或多个氨基酸(例如，1、
2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸)突变成抗体所源自的种系序列的对应残基、或另一种人种系序列之对应残基、或对应种系残基之保守氨基酸取代(此等序列之改变在文中统称为
“种系突变”)。本领域技术人员，由文中所揭示之重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个单种系突变或其组合之抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，VH
及/或VL域内的所有构架及/或CDR残基回复突变为此抗体源自之原始种系序列中存在的残
基。在其它实施方案中，仅特定的残基回复突变到原始的种系序列，例如仅存在于FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中的突变残基，或仅存在于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残
基。在其它的实施方案中，一或多个构架及/或CDR残基突变成不同种系序列(亦即，与抗体最初源自之种系序列不同的种系序列)之对应残基。再者，本发明之抗体可以在构架及/或
CDR区内含有任何的二或多个种系突变之组合，例如，其中一些单残基突变成特定种系序列之对应残基，而一些与原始种系序列不同的其它残基维持原样或突变成不同种系序列之对
应残基。一旦得到后，含有一或多个种系突变之抗体和抗原结合片段可容易地试验其一或
多种期望的性质，例如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增进的拮抗剂或激动剂生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方法所得的抗体和抗原结合片段
涵盖在本发明中。
6、7、8、9、或10个取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个插入，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个缺失)。此等突变可藉由将文中所揭示之氨基酸序列与得自例如公开的抗体序列文
库之种系序列相比较，容易地加以确定。赋予本发明抗-PCSK9抗体pH-依赖性结合特性之特定的氨基酸改变详细论述于文中他处。本发明包括由任何文中所揭示的氨基酸序列所衍生
之抗体及其抗原结合片段，其中在一或多个构架及/或CDR区中的一或多个氨基酸(例如，1、
2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸)突变成抗体所源自的种系序列的对应残基、或另一种人种系序列之对应残基、或对应种系残基之保守氨基酸取代(此等序列之改变在文中统称为
“种系突变”)。本领域技术人员，由文中所揭示之重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个单种系突变或其组合之抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，VH
及/或VL域内的所有构架及/或CDR残基回复突变为此抗体源自之原始种系序列中存在的残
基。在其它实施方案中，仅特定的残基回复突变到原始的种系序列，例如仅存在于FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中的突变残基，或仅存在于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残
基。在其它的实施方案中，一或多个构架及/或CDR残基突变成不同种系序列(亦即，与抗体最初源自之种系序列不同的种系序列)之对应残基。再者，本发明之抗体可以在构架及/或
CDR区内含有任何的二或多个种系突变之组合，例如，其中一些单残基突变成特定种系序列之对应残基，而一些与原始种系序列不同的其它残基维持原样或突变成不同种系序列之对
应残基。一旦得到后，含有一或多个种系突变之抗体和抗原结合片段可容易地试验其一或
多种期望的性质，例如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增进的拮抗剂或激动剂生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方法所得的抗体和抗原结合片段
涵盖在本发明中。
[0038] 本发明亦包括抗-PCSK9抗体，其包含具有一或多个保守取代之文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括抗-PCSK9抗体，其具有，相对于文中所揭示之任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，带有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少之保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。
[0039] 术语“表位”指与抗体分子可变区中称为互补位(paratope)的特异性抗原结合位置相互作用之抗原决定簇。单一抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可为构象或线性的。构象表位由来自线性多
肽链的不同区段上的氨基酸在空间上靠拢而形成。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基
产生。在一些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基结构部分。
肽链的不同区段上的氨基酸在空间上靠拢而形成。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基
产生。在一些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基结构部分。
[0040] 术语“实质上同一”或“实质上相同”，当涉及核酸或其片段时，表示：当通过合适的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳对齐后，以任何熟知的序列同一性算法，例如FASTA、BLAST或Gap来测量，在至少约95％、优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，见下面的讨论。在本发明公开中就核酸序列述及序列
同一性百分数时，除非另有说明，否则该百分数旨在相对于相应参考核酸序列的全长进行
计算。与参照核酸分子具有实质上同一性的核酸分子，在一些情况下，可编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或实质上类似的氨基酸序列之多肽。
同一性百分数时，除非另有说明，否则该百分数旨在相对于相应参考核酸序列的全长进行
计算。与参照核酸分子具有实质上同一性的核酸分子，在一些情况下，可编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或实质上类似的氨基酸序列之多肽。
[0041] 应用于多肽时，术语“实质上相似性”或“实质上相似”指，二个肽序列，当以例如GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳对齐后，享有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在本公开中就氨基酸序列述及序列同一性百分数时，除非另有说明，否则该百分数旨在相对于相应参考氨基酸序列的全长进行计算。优选地，不同的残基位置系
相差在保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基经另一带有化学性质类似(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)之氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在二个或多个不同氨基酸序列彼此相差保守性
取代的情形中，可以上调序列同一性或相似度百分比，以就取代的保守性质作出校正。调整之方法为本领域技术人员所熟知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-
331。具有化学性质类似之侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守性置换为在Gonnet等人
(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250对数似然矩阵中具有正值之任何变化。“中度保守性”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值之任何变化。
相差在保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基经另一带有化学性质类似(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)之氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在二个或多个不同氨基酸序列彼此相差保守性
取代的情形中，可以上调序列同一性或相似度百分比，以就取代的保守性质作出校正。调整之方法为本领域技术人员所熟知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-
331。具有化学性质类似之侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守性置换为在Gonnet等人
(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250对数似然矩阵中具有正值之任何变化。“中度保守性”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值之任何变化。
[0042] 多肽之序列相似性，亦称作序列同一性，典型地使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件通过使用分配给各种取代、缺失和其它修饰作用(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度值，进行相似序列的匹配。例如，GCG软件含有程序例如Gap和Bestfit，其可使用默认参数，测定密切相关的多肽间，例如来自不同生物物种之同源多肽，或野生型和其突变蛋白间之序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA(一种GCG Version 6.1内的程序)，利用默认或建议参数，作比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)
supra)。当将本发明序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库作比较时，另一优选
的算法为使用默认参数之计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：
3389-402。
supra)。当将本发明序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库作比较时，另一优选
的算法为使用默认参数之计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：
3389-402。
[0043] 具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体
[0044] 本发明提供显示pH-依赖性结合特性之抗体及其抗原结合片段。如文中所用，表述“pH-依赖性结合”指，抗体或其抗原结合片段表现出“在酸性pH中相较于中性pH中与PCSK9的结合下降”(就本公开之目的，二个表述可互换使用)。例如，“带有pH-依赖性结合特性”的抗体包括在中性pH比在酸性pH时以较大亲和力与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段。在
一些实施方案中，本发明之抗体及其抗原结合片段在中性pH中比在酸性pH中以高至少3、5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍的亲和力与PCSK9结合。表述“具有pH-依赖性结合特性”的抗体亦包括如文中他处所定义的带有“中间pH-依赖性结合特性”之抗体。
一些实施方案中，本发明之抗体及其抗原结合片段在中性pH中比在酸性pH中以高至少3、5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍的亲和力与PCSK9结合。表述“具有pH-依赖性结合特性”的抗体亦包括如文中他处所定义的带有“中间pH-依赖性结合特性”之抗体。
[0045] 抗体对抗原(例如PCSK9)之“亲和力”，就本公开之目的，以抗体的KD表示。抗体的KD指抗体-抗原相互作用之平衡解离常数。就抗体与其抗原结合而言KD值越大，则抗体对于此特定抗原之结合亲和力越弱。因此，如文中所用，“在中性pH比在酸性pH具更高亲和力”(或等同表述“pH-依赖性结合”)系指，在酸性时抗体与PCSK9结合之KD大于在中性时抗体与PCSK9结合之KD。例如，在本发明中，若在酸性pH时抗体与PCSK9结合之KD大于中性pH时抗体与PCSK9结合之KD至少约3倍，则此抗体被视为在中性pH比在酸性pH时以更高亲和力与
PCSK9结合。因此，本发明包括抗体及其抗原结合片段，其在酸性pH与PCSK9结合之KD比在中性pH时与PCSK9结合之KD大至少约3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍(意味着，在中性pH时该抗体或其抗原结合片段与PCSK9结合之亲和力比在酸性pH时大至少约3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍)。
PCSK9结合。因此，本发明包括抗体及其抗原结合片段，其在酸性pH与PCSK9结合之KD比在中性pH时与PCSK9结合之KD大至少约3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍(意味着，在中性pH时该抗体或其抗原结合片段与PCSK9结合之亲和力比在酸性pH时大至少约3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍)。
[0046] 抗体对于特定抗原之结合性质亦可藉由抗体的kd来表示。抗体的kd指抗体对于特定抗原之解离速率常数，以秒的倒数来表示(亦即sec-1)。kd值增加意味着抗体对其抗原之结合较弱。本发明因此包括，相较于中性pH，在酸性pH时以较高kd值与PCSK9结合的抗体。本发明包括在酸性pH时与PCSK9结合之kd比在中性pH时与PCSK9结合之kd大至少约3、5、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100或更多倍的抗体及其抗原结合片段。
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100或更多倍的抗体及其抗原结合片段。
[0047] 抗体对于特定抗原之结合性质亦可藉由抗体的t1/2来表示。抗体之t1/2系指抗体-抗原相互作用之半衰期。因此，根据本发明，带有“pH-依赖性结合特性”(或同等词“相较于中性pH，在酸性pH时与PCSK9结合降低”)之抗体，包括在酸性pH比在中性pH时以较短的
t1/2与PCSK9结合之抗体。例如，本发明包括在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比中性pH时与
PCSK9结合之t1/2短至少5倍的抗体或其抗原结合片段。例如，本发明包括在酸性pH时与
PCSK9结合之t1/2比在中性pH时与PCSK9结合之t1/2短至少约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60或更多倍的抗体及其抗原结合片段。作为一个示例性实例，若抗-PCSK9抗体在中性pH时显示21分钟之t1/2，而在酸性pH时t1/2为3分钟，则就本公开之目的，该抗体在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比该抗体在中性pH与PCSK9结合之t1/2短7倍[亦即21分钟
除以3分钟]。
t1/2与PCSK9结合之抗体。例如，本发明包括在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比中性pH时与
PCSK9结合之t1/2短至少5倍的抗体或其抗原结合片段。例如，本发明包括在酸性pH时与
PCSK9结合之t1/2比在中性pH时与PCSK9结合之t1/2短至少约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60或更多倍的抗体及其抗原结合片段。作为一个示例性实例，若抗-PCSK9抗体在中性pH时显示21分钟之t1/2，而在酸性pH时t1/2为3分钟，则就本公开之目的，该抗体在酸性pH与PCSK9结合之t1/2比该抗体在中性pH与PCSK9结合之t1/2短7倍[亦即21分钟
除以3分钟]。
[0048] 在一些情况下，“在酸性pH中相较于在中性pH中与PCSK9结合降低”，以在酸性pH时抗体与PCSK9结合之KD值与在中性pH时该抗体与PCSK9结合之KD值的比值来表示(或反之亦然)。例如，就本发明之目的，若抗体或其抗原结合片段具有约3.0或更大的酸性/中性KD比值，则该抗体或其抗原结合片段可被认为“在酸性pH相较于在中性pH与PCSK9的结合降低”。
在一些示例性实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性KD比可以为约
3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、
12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
在一些示例性实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性KD比可以为约
3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、
12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
[0049] 在一些情况下，“在酸性pH相较于在中性pH与PCSK9结合降低”，以在酸性pH时抗体与PCSK9结合之kd值与在中性pH时抗体与PCSK9结合之kd值的比值来表示(或反之亦然)。例如，就本发明之目的，若抗体或其抗原结合片段具有约3.0或更大的酸性/中性kd比，则抗体或其抗原结合片段可被认为显示“在酸性pH相较于在中性pH与PCSK9结合降低”。在一些示例性实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性kd比可以为约3.0、3.5、
4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、
12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、
12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
[0050] 在一些情况下，“在酸性pH相较于在中性pH时与PCSK9结合降低”，以在酸性pH时抗体与PCSK9结合之t1/2值与在中性pH时抗体与PCSK9结合之t1/2值的比值来表示(或反之亦然)。例如，就本发明之目的，若抗体或其抗原结合片段具有约0.20或更小的酸性/中性t1/2比，则抗体或其抗原结合片段可被认为显示“在酸性pH相较于在中性pH时与PCSK9结合降
低”。在一些示例性实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性t1/2比可以为约0.20、0.15、0.14.0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更低。
低”。在一些示例性实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性t1/2比可以为约0.20、0.15、0.14.0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更低。
[0051] 在一些情况下，本发明之抗体，在酸性pH时相较于在中性pH时，可以以较低的亲和力(亦即较高的KD)及较短的t1/2与PCSK9结合。例如，本发明包括这样的抗体，所述抗体与PCSK9结合的亲和力在中性pH时比在酸性pH时高至少5倍、且在酸性pH时的t1/2比抗体与PCSK9在中性pH时结合之t1/2短至少5倍。然而，在一些情况中，在中性pH时比在酸性pH时具有较高的PCSK9结合亲和力(如以KD值表示)的抗体，可能并不一定具有在酸性pH时比在中
性pH时较短的t1/2。
性pH时较短的t1/2。
[0052] 如文中所用，表述“酸性pH”指6.0或更低的pH(例如，低于约6.0，低于约5.5，低于约5.0，等等)。表述“酸性pH”包括约6.0、5.95、5.90、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低的pH值。
[0053] 如文中所用，表述“中性pH”指约7.0至约7.4的pH。表述“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4之pH值。
[0054] 除非另行说明，否则：如果在酸性pH测定本发明抗体或其抗原结合片段的任何性质(例如，KD值、Kd值、t1/2时间、IC50值等)、并与在中性pH时的相同性质比较(或反之亦然)，则应当认为该比较性测量是在6.0的酸性pH和7.4的中性pH、以及温度20℃进行的测
定。
定。
[0055] KD值、kd值和t1/2时间，如文中所示，可使用表面等离子体共振为基础的生物传感器来测定，用以表征抗体-抗原相互作用(参见，例如文中实施例3)。KD值、kd值和t1/2时间可于25℃或37℃测定。
[0056] 已发现，在酸性pH比在中性pH显示下降的PCSK9结合之抗体及其抗原结合片段，相对于在酸性pH比在中性pH不显示下降的PCSK9结合之抗体及其抗原结合片段，具有改良的
药物动力学性质。例如，如文中提供的实施例所验证，在酸性pH比在中性pH显示下降的
PCSK9结合的一些本发明抗体，当施用给动物对象时，相较于不具有pH-依赖性结合特性之
抗-PCSK9抗体，表现出较缓慢的循环清除。根据本发明此方面，提供在酸性pH比在中性pH显示PCSK9结合下降之抗体，所述抗体，相对于在酸性pH比在中性pH不具有下降的PCSK9结合
之抗体，具有至少慢2倍的循环清除。清除率可藉由抗体的半衰期来表示，其中较慢的清除与较长的半衰期相关。本发明亦包括在酸性pH比在中性pH具有下降的PCSK9结合之抗-
PCSK9抗体，其中该抗体，当以约1mg/kg之剂量施用给表达人PCSK9之动物时，在施用后至少
30天可以在动物的血清中检测到大于约1.0μg/ml之浓度。
药物动力学性质。例如，如文中提供的实施例所验证，在酸性pH比在中性pH显示下降的
PCSK9结合的一些本发明抗体，当施用给动物对象时，相较于不具有pH-依赖性结合特性之
抗-PCSK9抗体，表现出较缓慢的循环清除。根据本发明此方面，提供在酸性pH比在中性pH显示PCSK9结合下降之抗体，所述抗体，相对于在酸性pH比在中性pH不具有下降的PCSK9结合
之抗体，具有至少慢2倍的循环清除。清除率可藉由抗体的半衰期来表示，其中较慢的清除与较长的半衰期相关。本发明亦包括在酸性pH比在中性pH具有下降的PCSK9结合之抗-
PCSK9抗体，其中该抗体，当以约1mg/kg之剂量施用给表达人PCSK9之动物时，在施用后至少
30天可以在动物的血清中检测到大于约1.0μg/ml之浓度。
[0057] 也已经发现，在酸性pH比在中性pH具有降低的PCSK9结合之抗体及其抗原结合片段，相对于在酸性pH比在中性pH不具有降低的PCSK9结合之抗体及其抗原结合片段，具有改良及延长的降胆固醇活性。例如，本发明提供：相较于在酸性pH不显示降低的PCSK9结合之抗体及其抗原结合片段，提供延长的降LDL-C能力之抗-PCSK9抗体。根据本发明一些实施方案，提供抗-PCSK9抗体，所述抗体当以约10mg/kg之剂量施用给对象时，使血清LDL-C水平与基线相比降低至少25％，并维持此降低的血清LDL-C水平至少25天。在一些情况下，提供抗-PCSK9抗体，所述抗体当以约10mg/kg之剂量施用给对象时，使血清LDL-C水平与基线相比降低至少25％，并维持此降低的血清LDL-C水平例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多天。如文中所用，术语“基线”，当其涉及LDL-C(或其它相关参数)时，指，临在将抗-PCSK9抗体(或其它比较性治疗介入措施)施用给对象之前测量的、该对象之血清中的LDL-C水平。
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多天。如文中所用，术语“基线”，当其涉及LDL-C(或其它相关参数)时，指，临在将抗-PCSK9抗体(或其它比较性治疗介入措施)施用给对象之前测量的、该对象之血清中的LDL-C水平。
[0058] 本发明人已发现，至少在一些治疗情况下，对于与PCSK9结合，抗体具有太高的pH敏感度可能是有害的。亦即，在一些情况下，可能有利的是，抗体在酸性pH比在中性pH具有较低的结合亲和力，但仍然保留在酸性pH的一定程度的PCSK9结合亲和力。因此，根据本发明一些实施方案，提供具有中间pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体。
[0059] 如文中所用，表述“中间pH-依赖性结合特性”指，抗体或其抗原结合片段具有大于3.0但低于8.0之酸性/中性KD比。在一些示例性实施方案中，具有“中间pH-依赖性结合特
性”之抗体的酸性/中性KD比为3.5至8.0；4.0至8.0；4.5至8.0；5.0至8.0；5.5至8.0；6.0至
8.0；6.5至8.0；3.0至7.5；3.0至7.0；3.0至6.5；3.0至8.0；3.5至7.5；4.0至7.0；4.5至7.0；
5.0至7.0；或4.5至6.5。在一些示例性实施方案中，具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗体的酸性/中性KD比为约3.0，约3.5，约4.0，约4.5，约5.0，约5.5，约6.0，约6.5，约7.0，约7.5或约8.0。具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗-PCSK9抗体亦可具有低于约1.0但大于约
0.15之酸性/中性t1/2比。为测定抗体是否具有如文中所定义的“中间pH-依赖性结合特
性”，可以在25℃藉由表面等离子体共振测定酸性/中性KD比及/或酸性/中性t1/2比。如文中其它地方所述，酸性/中性KD比及/或酸性/中性t1/2比等，可以在6.0的酸性pH和7.4的中性pH、或者在5.75的酸性pH和7.2的中性pH测定。
性”之抗体的酸性/中性KD比为3.5至8.0；4.0至8.0；4.5至8.0；5.0至8.0；5.5至8.0；6.0至
8.0；6.5至8.0；3.0至7.5；3.0至7.0；3.0至6.5；3.0至8.0；3.5至7.5；4.0至7.0；4.5至7.0；
5.0至7.0；或4.5至6.5。在一些示例性实施方案中，具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗体的酸性/中性KD比为约3.0，约3.5，约4.0，约4.5，约5.0，约5.5，约6.0，约6.5，约7.0，约7.5或约8.0。具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗-PCSK9抗体亦可具有低于约1.0但大于约
0.15之酸性/中性t1/2比。为测定抗体是否具有如文中所定义的“中间pH-依赖性结合特
性”，可以在25℃藉由表面等离子体共振测定酸性/中性KD比及/或酸性/中性t1/2比。如文中其它地方所述，酸性/中性KD比及/或酸性/中性t1/2比等，可以在6.0的酸性pH和7.4的中性pH、或者在5.75的酸性pH和7.2的中性pH测定。
[0060] 如文中所用，具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗-PCSK9抗体亦包括，如表面等离子体共振所测，在酸性pH(例如pH 6.0)及25℃以小于约35分钟但大于约10.5分钟之t1/2与PCSK9结合之抗体及抗原结合片段。例如，本发明包括具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗-PCSK9抗体，其在酸性pH(例如pH 6.0)及25℃，以低于约20分钟但大于约10分钟；低于约20分钟但大于约11分钟；低于约20分钟但大于约12分钟；低于约20分钟但大于约13分钟；低于约20分钟但大于约14分钟；低于约20分钟但大于约15分钟；低于约30分钟但大于约11分钟；
低于约25分钟但大于约12分钟；低于约18分钟但大于约14分钟；低于约16分钟但大于约13
分钟；或低于约16分钟但大于约14分钟之t1/2，与PCSK9结合。
低于约25分钟但大于约12分钟；低于约18分钟但大于约14分钟；低于约16分钟但大于约13
分钟；或低于约16分钟但大于约14分钟之t1/2，与PCSK9结合。
[0061] 具有“中间pH-依赖性结合特性”之抗体亦包括：在酸性pH(例如pH6.0)及25℃以约10.5分钟，约11.0分钟，约11.5分钟，约12.0分钟，约12.5分钟，约13.0分钟，约13.5分钟，约
14.0分钟，约14.5分钟，约15.0分钟，约15.5分钟，约16.0分钟，约16.5分钟，约17.0分钟，约
17.5分钟，约18.0分钟，约18.5分钟，约19.0分钟，约19.5分钟，约20.0分钟，约20.5分钟，约
21.0分钟，约22.0分钟，约23.0分钟，约24.0分钟，约25.0分钟，约26.0分钟，约27.0分钟，约
28.0分钟，约29.0分钟，约30.0分钟，约31.0分钟，约32.0分钟，约33.0分钟，约34.0分钟或约35.0分钟之t1/2与PCSK9结合的抗体。
14.0分钟，约14.5分钟，约15.0分钟，约15.5分钟，约16.0分钟，约16.5分钟，约17.0分钟，约
17.5分钟，约18.0分钟，约18.5分钟，约19.0分钟，约19.5分钟，约20.0分钟，约20.5分钟，约
21.0分钟，约22.0分钟，约23.0分钟，约24.0分钟，约25.0分钟，约26.0分钟，约27.0分钟，约
28.0分钟，约29.0分钟，约30.0分钟，约31.0分钟，约32.0分钟，约33.0分钟，约34.0分钟或约35.0分钟之t1/2与PCSK9结合的抗体。
[0062] 带有组氨酸取代之pH-依赖的抗-PCSK9抗体
[0063] 本发明提供带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体，其中此等抗体，相较于亲本抗-PCSK9抗体，具有一或多个氨基酸差异。如文中所用，“亲本”抗-PCSK9抗体为不显示pH-依赖性结合特性或仅显示中间pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体(例如，其中，在中性pH
时亲本抗体对PCSK9之结合亲和力，与酸性pH时该抗体与PCSK9之结合亲和力相比，高至多3倍；或其中，在酸性pH时亲本抗体与PCSK9结合之t1/2，与在中性pH时该抗体与PCSK9结合之t1/2相比，短至多3倍)。在某些情况中，“亲本”抗-PCSK9抗体可为在酸性pH比在中性pH对PCSK9具有增加的结合之抗-PCSK9抗体。在某些实施方案中，“亲本”抗-PCSK9抗体藉由标准抗体制造/分离方法(例如小鼠免疫、噬菌体展示等)获得，其中在互补决定区(CDR)中无任
何人工导入的氨基酸修饰。
时亲本抗体对PCSK9之结合亲和力，与酸性pH时该抗体与PCSK9之结合亲和力相比，高至多3倍；或其中，在酸性pH时亲本抗体与PCSK9结合之t1/2，与在中性pH时该抗体与PCSK9结合之t1/2相比，短至多3倍)。在某些情况中，“亲本”抗-PCSK9抗体可为在酸性pH比在中性pH对PCSK9具有增加的结合之抗-PCSK9抗体。在某些实施方案中，“亲本”抗-PCSK9抗体藉由标准抗体制造/分离方法(例如小鼠免疫、噬菌体展示等)获得，其中在互补决定区(CDR)中无任
何人工导入的氨基酸修饰。
[0064] 根据本发明此方面，相对于亲本抗-PCSK9抗体，带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体可具有一或多个氨基酸变异。例如，带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体可
以，例如在亲本抗-PCSK9抗体的一或多个(例如，1、2、3、4、5、或6个)CDR中，含有一或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)组氨酸取代或插入。因此，根据本发明一些实施方案，提供抗-PCSK9抗体，其包含，除亲本抗体的一或多个CDR之一或多个氨基酸被组氨酸残基取代之外，与亲本抗-PCSK9抗体的CDR氨基酸序列相同之CDR氨基酸序列(例如重链和轻链
CDR)。带有pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体可以具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个组氨酸取代，所述取代位于亲本抗体之单一CDR中或分布于亲本抗-PCSK9抗体的多个(例如2、3、
4、5或6个)CDR中。例如，本发明包括带有pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体，其包含在亲本抗-PCSK9抗体的HCDR1中的一或多个组氨酸取代、在HCDR2中的一或多个组氨酸取代、在HCDR3
中的一或多个组氨酸取代、在LCDR1中的一或多个组氨酸取代、在LCDR2中的一或多个组氨
酸取代、和/或在LCDR3中的一或多个组氨酸取代。
以，例如在亲本抗-PCSK9抗体的一或多个(例如，1、2、3、4、5、或6个)CDR中，含有一或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)组氨酸取代或插入。因此，根据本发明一些实施方案，提供抗-PCSK9抗体，其包含，除亲本抗体的一或多个CDR之一或多个氨基酸被组氨酸残基取代之外，与亲本抗-PCSK9抗体的CDR氨基酸序列相同之CDR氨基酸序列(例如重链和轻链
CDR)。带有pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体可以具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个组氨酸取代，所述取代位于亲本抗体之单一CDR中或分布于亲本抗-PCSK9抗体的多个(例如2、3、
4、5或6个)CDR中。例如，本发明包括带有pH-依赖性结合之抗-PCSK9抗体，其包含在亲本抗-PCSK9抗体的HCDR1中的一或多个组氨酸取代、在HCDR2中的一或多个组氨酸取代、在HCDR3
中的一或多个组氨酸取代、在LCDR1中的一或多个组氨酸取代、在LCDR2中的一或多个组氨
酸取代、和/或在LCDR3中的一或多个组氨酸取代。
[0065] 可经修饰、突变或另外方式的工程化以具有pH-依赖性结合特性(或增进的pH-依赖性结合特性)之“亲本”抗-PCSK9抗体的例子包括：包含美国专利第8,062,640号中所揭示之任何互补决定区(CDR)或重链和轻链可变域(HCVR/LCVR)的抗-PCSK9抗体(亦概述于文中
实施例1、表1中)。仅具有中间pH-依赖性结合特性之亲本抗-PCSK9抗体的一个特定实例为
文中(及在美国专利第8,062,640号中)称为“300N”之抗体。300N包含具有SEQ ID NO：218/
226之HCVR/LCVR氨基酸序列、及分别具有SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之重链和轻链CDR序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)。因此，包含SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR氨基酸序列对、或SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列的任何抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，为可在氨基酸序列水平修饰(例如，在一或多个CDR中带有一或多个组氨酸取代及/或插入)以产生带有pH-
依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段之合适的“亲本”抗体。
实施例1、表1中)。仅具有中间pH-依赖性结合特性之亲本抗-PCSK9抗体的一个特定实例为
文中(及在美国专利第8,062,640号中)称为“300N”之抗体。300N包含具有SEQ ID NO：218/
226之HCVR/LCVR氨基酸序列、及分别具有SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之重链和轻链CDR序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)。因此，包含SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR氨基酸序列对、或SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列的任何抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，为可在氨基酸序列水平修饰(例如，在一或多个CDR中带有一或多个组氨酸取代及/或插入)以产生带有pH-
依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段之合适的“亲本”抗体。
[0066] 备选地，包含美国专利第8,062,640号中所述之任何示例性抗-PCSK9抗体的HCVR/LCVR氨基酸序列对或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列(也总结于文中实施例1表1中)的任何抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，亦为可在氨基酸序列水平作修饰
(例如，在一或多个CDR中带有一或多个组氨酸取代及/或插入)以产生带有pH-依赖性结合
特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段之合适的“亲本”抗体。
(例如，在一或多个CDR中带有一或多个组氨酸取代及/或插入)以产生带有pH-依赖性结合
特性的抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段之合适的“亲本”抗体。
[0067] 在一些实施方案中，本发明提供显示pH-依赖性结合特性且包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述HCVR包含SEQ ID NO：2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、
186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、
334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、
482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、
642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742之任一的氨基酸序列、或其中在一或多个重链CDR中一或多个氨基酸被组氨酸残基取代的任何前述氨基酸序列的变
体；且其中所述LCVR包含SEQ ID NO：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、
120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、
274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、
428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、
576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、
730、740及744之任一的氨基酸序列、或其中在一或多个轻链CDR中一或多个氨基酸被组氨
酸残基取代之任何前述氨基酸序列的变体。
186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、
334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、
482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、
642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742之任一的氨基酸序列、或其中在一或多个重链CDR中一或多个氨基酸被组氨酸残基取代的任何前述氨基酸序列的变
体；且其中所述LCVR包含SEQ ID NO：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、
120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、
274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、
428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、
576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、
730、740及744之任一的氨基酸序列、或其中在一或多个轻链CDR中一或多个氨基酸被组氨
酸残基取代之任何前述氨基酸序列的变体。
[0068] 在一些实施方案中，本发明提供显示pH依赖性结合性质、并包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述HVCR/LCVR氨基酸
序列对包含SEQ ID NOs:2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/
82,90/92,94/96,98/106,114/116,118/120,122/130,138/140,142/144,146/154,162/
164,166/168,170/178,186/188,190/192,194/202,210/212,214/216,218/226,234/236,
238/240,242/250,258/560,262/264,266/274,282/284,286/288,290/298,306/308,310/
312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360,362/370,378/380,382/384,
386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432,434/442,450/452,454/456,458/
466,474/476,478/480,482/490,498/500,502/504,506/514,522/524,526/528,530/538,
546/548,550/552,554/562,570/572,574/576,578/586,594/596,598/600,602/610,618/
620,622/624,626/634,642/644,646/648,650/658,666/668,670/672,674/682,690/692,
694/696,698/706,714/716,718/720,722/730,738/740，和742/744中任一的氨基酸序列
对，或包含一个或多个重链CDR和/或轻链CDR中的一个或多个氨基酸被组氨酸取代的任何
前述氨基酸序列对的变体。
序列对包含SEQ ID NOs:2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/
82,90/92,94/96,98/106,114/116,118/120,122/130,138/140,142/144,146/154,162/
164,166/168,170/178,186/188,190/192,194/202,210/212,214/216,218/226,234/236,
238/240,242/250,258/560,262/264,266/274,282/284,286/288,290/298,306/308,310/
312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360,362/370,378/380,382/384,
386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432,434/442,450/452,454/456,458/
466,474/476,478/480,482/490,498/500,502/504,506/514,522/524,526/528,530/538,
546/548,550/552,554/562,570/572,574/576,578/586,594/596,598/600,602/610,618/
620,622/624,626/634,642/644,646/648,650/658,666/668,670/672,674/682,690/692,
694/696,698/706,714/716,718/720,722/730,738/740，和742/744中任一的氨基酸序列
对，或包含一个或多个重链CDR和/或轻链CDR中的一个或多个氨基酸被组氨酸取代的任何
前述氨基酸序列对的变体。
[0069] 例如，本发明提供称为“300N”之示例性亲本抗-PCSK9抗体之变体(亦即，包含SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体之变体)。特别地，本发明提供显示pH-依赖性结合特性及包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCVR包含SEQ ID NO：218或SEQ ID NO：218的变体，其中所述变体包含一或多个选自下列的氨基酸取代：N52H、Q53H、I100H、V101H、V104H、D106H、M107H、D108H和Y112H；
且其中LCVR包含SEQ ID NO：226或SEQ ID NO：226的变体，其中所述变体包含一或多个选自下列的氨基酸取代：L29H、L30H、N33H、G34H、Y37H、L97H、T99H和P100H。
且其中LCVR包含SEQ ID NO：226或SEQ ID NO：226的变体，其中所述变体包含一或多个选自下列的氨基酸取代：L29H、L30H、N33H、G34H、Y37H、L97H、T99H和P100H。
[0070] 根据一示例性实施方案，本发明提供显示pH-依赖性结合特性及包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCVR包括包含D106H
氨基酸取代之SEQ ID NO：218的变体，其中LCVR包含SEQ ID NO：226。D106H氨基酸取代位于重链CDR3(HCDR3)内。包括D106H氨基酸取代之变体HCDR3表示为文中表3所示的SEQ ID NO：
788氨基酸序列。
氨基酸取代之SEQ ID NO：218的变体，其中LCVR包含SEQ ID NO：226。D106H氨基酸取代位于重链CDR3(HCDR3)内。包括D106H氨基酸取代之变体HCDR3表示为文中表3所示的SEQ ID NO：
788氨基酸序列。
[0071] 根据另外的示例性实施方案，本发明提供具有pH-依赖性结合特性及包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中该HCVR包括SEQ
ID NO：218，及其中该LCVR包括包含L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体。该L30H氨基酸取代位于轻链CDR1(LCDR1)内。包括L30H氨基酸取代之变体LCDR1表示为文中表3所示的
SEQ ID NO：802氨基酸序列。
ID NO：218，及其中该LCVR包括包含L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体。该L30H氨基酸取代位于轻链CDR1(LCDR1)内。包括L30H氨基酸取代之变体LCDR1表示为文中表3所示的
SEQ ID NO：802氨基酸序列。
[0072] 根据另外的示例性实施方案，本发明提供显示pH-依赖性结合特性及包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中该HCVR包括包含
D106H氨基酸取代之SEQ ID NO：218的变体，及其中该LCVR包括包含L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体。
D106H氨基酸取代之SEQ ID NO：218的变体，及其中该LCVR包括包含L30H氨基酸取代之SEQ ID NO：226的变体。
[0073] 在一些实施方案中，本发明提供显示pH-依赖性结合特性及包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中该HCDR1包含SEQ ID NO：220(亲本)；其中HCDR2包含选自SEQ ID NO：
222(亲本)、772(N52H)和773(Q53H)之氨基酸序列；其中HCDR3包含选自SEQ ID NO：224(亲本)、782(I100H)、783(V101H)、786(V104H)、788(D106H)、789(M107H)、790(D108H)和794(Y112H)之氨基酸序列；其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：228(亲本)、801(L29H)、802(L30H)、
804(N33H)、805(G34H)和808(Y37H)之氨基酸序列；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；
其中LCDR3包含选自SEQ ID NO：232(亲本)、815(L97H)、817(T99H)和818(P100H)之氨基酸序列。
222(亲本)、772(N52H)和773(Q53H)之氨基酸序列；其中HCDR3包含选自SEQ ID NO：224(亲本)、782(I100H)、783(V101H)、786(V104H)、788(D106H)、789(M107H)、790(D108H)和794(Y112H)之氨基酸序列；其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：228(亲本)、801(L29H)、802(L30H)、
804(N33H)、805(G34H)和808(Y37H)之氨基酸序列；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；
其中LCDR3包含选自SEQ ID NO：232(亲本)、815(L97H)、817(T99H)和818(P100H)之氨基酸序列。
[0074] 根据一些实施方案，本发明提供显示pH-依赖性结合特性及包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：220(亲本)；其中HCDR2包含SEQ ID NO：222(亲本)；其中HCDR3包含SEQ ID NO：224(亲本)或788(D106H)；其中LCDR1包含SEQ ID NO：228(亲本)或802(L30H)；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；及其中LCDR3包含SEQ ID NO：
232(亲本)。
232(亲本)。
[0075] 根据一些实施方案，本发明提供具有pH-依赖性结合特性及包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：220(亲本)；其中HCDR2包含SEQ ID NO：222(亲本)；其中HCDR3包括SEQ ID NO：788(D106H)；其中LCDR1包含SEQ ID NO：228(亲本)；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；及其中LCDR3包含SEQ ID NO：232(亲本)。
[0076] 根据一些实施方案，本发明提供具有pH-依赖性结合特性及包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：220(亲本)；其中HCDR2包含SEQ ID NO：222(亲本)；其中HCDR3包含SEQ ID NO：224(亲本)；其中LCDR1包含SEQ ID NO：802(L30H)；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；及其中LCDR3包含SEQ ID NO：232(亲本)。
[0077] 根据一些实施方案，本发明提供具有pH-依赖性结合特性及包含3个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：220(亲本)；其中HCDR2包含SEQ ID NO：222(亲本)；其中HCDR3包含SEQ ID NO：788(D106H)；其中LCDR1包含SEQ ID NO：802(L30H)；其中LCDR2包含SEQ ID NO：230(亲本)；及其中LCDR3包含SEQ ID NO：232(亲本)。
[0078] 包括Fc变体之抗-PCSK9抗体
[0079] 根据本发明一些实施方案，提供包括Fc域之抗-PCSK9抗体，其中Fc域包含，例如在酸性pH比在中性pH，增进或减少抗体与FcRn受体结合之一或多个突变。例如，本发明包括在Fc域的CH2或CH3区中包含突变之抗-PCSK9抗体，其中所述突变增加酸性环境中Fc域与FcRn之亲和力(例如，在pH范围从约5.5至约6.0的内涵体中)。此等Fc修饰之非限定实例包括，例如，位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)及256(例如，S/R/Q/E/D或T)之修饰；或位置428及/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如，H/F或Y)之修饰；或位置250及/或428之修饰；或位置307或308(例如，308F、V308F)及
434之修饰。在一个实施方案中，此修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；
428L、259I(例如，V259I)及308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)及434(例如，434Y)修饰；252、254及256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和
M428L)；及307及/或308修饰(例如，308F或308P)。
434之修饰。在一个实施方案中，此修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；
428L、259I(例如，V259I)及308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)及434(例如，434Y)修饰；252、254及256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和
M428L)；及307及/或308修饰(例如，308F或308P)。
[0080] 本发明包括包含下列二者之抗-PCSK9抗体：(1)包含一或多个组氨酸取代之变体CDR序列，所述取代在酸性pH比在中性pH降低抗体与PCSK9之结合亲和力；及(2)包含一或多个突变之变体Fc域序列，所述突变在酸性pH比在中性pH增加Fc域对FcRn之亲和力。根据本
发明此方面，可构建包含如文中所述之任何组氨酸取代的重链或轻链可变区(HCVR/LCVR)
或CDR(参见例如，表3)、及含有任何上述突变之Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述突变使得Fc域在酸性pH时以较大亲和力与FcRn相结合。例如，本发明包括包含CDR氨基酸序列和Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述CDR氨基酸序列为例如文中称为“VH-D106H”之组氨酸变体抗-
PCSK9抗体的CDR氨基酸序列，其中所述Fc域包括一或多个选自以下的突变：T250Q/M248L；
M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；及H433K/N434F。本发明还包括包含CDR氨基酸序列和Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述CDR氨基酸序列为例如文中称为“VK-L30H”之组氨酸变体抗-PCSK9抗体的CDR氨基酸序列，其中所述Fc域包括一或多个选自以下的突变：T250Q/M248L；
M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；及H433K/N434F。文中所述的CDR组氨酸取代突变和Fc域突变之所有可能组合均涵盖在本发明范围内。
发明此方面，可构建包含如文中所述之任何组氨酸取代的重链或轻链可变区(HCVR/LCVR)
或CDR(参见例如，表3)、及含有任何上述突变之Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述突变使得Fc域在酸性pH时以较大亲和力与FcRn相结合。例如，本发明包括包含CDR氨基酸序列和Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述CDR氨基酸序列为例如文中称为“VH-D106H”之组氨酸变体抗-
PCSK9抗体的CDR氨基酸序列，其中所述Fc域包括一或多个选自以下的突变：T250Q/M248L；
M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；及H433K/N434F。本发明还包括包含CDR氨基酸序列和Fc域之抗-PCSK9抗体，其中所述CDR氨基酸序列为例如文中称为“VK-L30H”之组氨酸变体抗-PCSK9抗体的CDR氨基酸序列，其中所述Fc域包括一或多个选自以下的突变：T250Q/M248L；
M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；及H433K/N434F。文中所述的CDR组氨酸取代突变和Fc域突变之所有可能组合均涵盖在本发明范围内。
[0081] 抗体的生物特性
[0082] 除了具有pH-依赖性结合特性外，本发明之抗-PCSK9抗体亦可具有一或多种另外的有利生物性质。例如，本发明包括有效阻断PCSK9和低密度脂蛋白受体(LDLR)间的相互作用之抗-PCSK9抗体。在一些实施方案中，本发明之抗体在中性pH，以低于约1nM，例如，低于约900pM，低于约800pM，低于约700pM，低于约600pM，低于约500pM，低于约400pM，低于约
300pM，低于约200pM,或低于约100pM之IC50，阻断PCSK9和LDLR间的相互作用，例如，使用文中实施例4中所述之阻断ELISA或实质上类似的分析模式所测定。
300pM，低于约200pM,或低于约100pM之IC50，阻断PCSK9和LDLR间的相互作用，例如，使用文中实施例4中所述之阻断ELISA或实质上类似的分析模式所测定。
[0083] 在一些实施方案中，本发明之抗体在中性pH比在酸性pH能更有效地阻断PCSK9/LDLR相互作用(例如，反映抗体在酸性pH与PCSK9结合的降低)。抗-PCSK9抗体阻断PCSK9/
LDLR相互作用之能力可藉由IC50值来量化表示，例如，在中性和酸性pH时。(参见，例如，文中实施例4)。抗体在中性pH时相较于在酸性pH时阻断PCSK9/LDLR相互作用之程度可藉由在
酸性pH时所测量的抗体IC50值与在中性pH时所测量的抗体IC50值之比来表示。在此类分析
模式中较高的酸性/中性IC50比值反映在酸性pH比在中性pH阻断PCSK9/LDLR相互作用之能
力下降。因此，本发明包括抗-PCSK9抗体，其中如使用实施例4的分析模式或实质上类似的分析所测，抗体以大于约1，大于约5，大于约10，大于约20，大于约30，大于约32，大于约34，大于约36，大于约38，大于约40，大于约50，大于约60，大于约70，大于约80，大于约90，大于约100，大于约110，大于约120，大于约130，大于约140，大于约150，大于约160，大于约170，大于约180，大于约190，大于约200，大于约210，大于约220，大于约230或更大之酸性/中性IC50比，阻断PCSK9/LDLR相互作用。在一些实施方案中，酸性/中性IC50比在6.0的酸性pH和
7.4的中性pH和25℃温度测定。在其它实施方案中，酸性/中性IC50在5.75的酸性pH和7.2的中性pH和25℃温度测定。
LDLR相互作用之能力可藉由IC50值来量化表示，例如，在中性和酸性pH时。(参见，例如，文中实施例4)。抗体在中性pH时相较于在酸性pH时阻断PCSK9/LDLR相互作用之程度可藉由在
酸性pH时所测量的抗体IC50值与在中性pH时所测量的抗体IC50值之比来表示。在此类分析
模式中较高的酸性/中性IC50比值反映在酸性pH比在中性pH阻断PCSK9/LDLR相互作用之能
力下降。因此，本发明包括抗-PCSK9抗体，其中如使用实施例4的分析模式或实质上类似的分析所测，抗体以大于约1，大于约5，大于约10，大于约20，大于约30，大于约32，大于约34，大于约36，大于约38，大于约40，大于约50，大于约60，大于约70，大于约80，大于约90，大于约100，大于约110，大于约120，大于约130，大于约140，大于约150，大于约160，大于约170，大于约180，大于约190，大于约200，大于约210，大于约220，大于约230或更大之酸性/中性IC50比，阻断PCSK9/LDLR相互作用。在一些实施方案中，酸性/中性IC50比在6.0的酸性pH和
7.4的中性pH和25℃温度测定。在其它实施方案中，酸性/中性IC50在5.75的酸性pH和7.2的中性pH和25℃温度测定。
[0084] 本发明亦包括带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体，其中抗体阻断PCSK9-介导的对LDL摄取之抑制作用。以细胞为基础的LDL摄取试验例如文中实施例5中所示，可用于测定抗-PCSK9抗体是否能阻断PCSK9-介导的LDL摄取之抑制作用及/或其程度。根据一些实
施方案，提供具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体，其中该抗体能阻断PCSK9-介导的
LDL摄取之抑制作用，其中例如，使用文中实施例5中所述之体外LDL摄取试验或实质上类似的实验模式进行测定，IC50值为低于约40nM，低于约35nM，低于约30nM，低于约25nM，低于约
20nM，低于约15nM或低于约10nM。
施方案，提供具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体，其中该抗体能阻断PCSK9-介导的
LDL摄取之抑制作用，其中例如，使用文中实施例5中所述之体外LDL摄取试验或实质上类似的实验模式进行测定，IC50值为低于约40nM，低于约35nM，低于约30nM，低于约25nM，低于约
20nM，低于约15nM或低于约10nM。
[0085] 本发明之抗体可具有一或多种前述的生物特性，或任何其组合。前面所列的本发明抗体之生物特性并非旨在穷举。本领域技术人员阅读本公开(包括文中工作实施例)后，
将明白本发明抗体之其它生物特性。
将明白本发明抗体之其它生物特性。
[0086] 产生带有pH-依赖性结合特性之抗体的方法
[0087] 本发明亦提供产生带有pH-依赖性结合特性之抗体的方法。根据本发明此方面之方法，包括筛选具有至少中间pH-依赖性结合特性之抗体，然后将此抗体进行进一步的诱变以增进此抗体对其抗原之pH-依赖性。筛选步骤可包括可以在特异于特定抗原的一群抗体
中辨识出具有中间pH-依赖性结合特性之抗体的任何方法或过程。在一些实施方案中，最初的抗体群可以藉由免疫动物或藉由筛选噬菌体展示文库寻找特异结合特定目的抗原的抗
体而获得。这些抗体，在一些实施方案中，可为全人抗体，例如全人重组抗体。在一些实施方案中，筛选步骤包括于酸性pH和中性pH测量最初的抗体群中各抗体之一或多个结合参数
(例如，KD或t1/2)。抗体之结合参数可使用，例如表面等离子体共振或能定量或定性评估抗体对特定抗原之结合特性的任何其它分析方法来测量。根据本发明此方面之特定的实施方
案，此筛选步骤包括鉴定以大于约3.0但低于约8.0之酸性/中性KD比与抗原结合之抗体。备选地，此筛选步骤可包括鉴定以低于约1.0但大于约0.15之酸性/中性t1/2比与抗原结合之
抗体。在再其它的实施方案中，此筛选步骤可包括鉴定在酸性pH(例如pH 6.0)时具有低于
40分钟但大于20分钟(例如于25℃)之t1/2的抗体。根据本发明此方面的一些实施方案，酸
性/中性KD比和/或酸性/中性t1/2比在6.0的酸性pH和7.4的中性pH和25℃温度测定。根据
其它实施方案，酸性/中性KD比和/或酸性/中性t1/2比在5.75的酸性pH和7.2的中性pH和25
℃温度测定。
中辨识出具有中间pH-依赖性结合特性之抗体的任何方法或过程。在一些实施方案中，最初的抗体群可以藉由免疫动物或藉由筛选噬菌体展示文库寻找特异结合特定目的抗原的抗
体而获得。这些抗体，在一些实施方案中，可为全人抗体，例如全人重组抗体。在一些实施方案中，筛选步骤包括于酸性pH和中性pH测量最初的抗体群中各抗体之一或多个结合参数
(例如，KD或t1/2)。抗体之结合参数可使用，例如表面等离子体共振或能定量或定性评估抗体对特定抗原之结合特性的任何其它分析方法来测量。根据本发明此方面之特定的实施方
案，此筛选步骤包括鉴定以大于约3.0但低于约8.0之酸性/中性KD比与抗原结合之抗体。备选地，此筛选步骤可包括鉴定以低于约1.0但大于约0.15之酸性/中性t1/2比与抗原结合之
抗体。在再其它的实施方案中，此筛选步骤可包括鉴定在酸性pH(例如pH 6.0)时具有低于
40分钟但大于20分钟(例如于25℃)之t1/2的抗体。根据本发明此方面的一些实施方案，酸
性/中性KD比和/或酸性/中性t1/2比在6.0的酸性pH和7.4的中性pH和25℃温度测定。根据
其它实施方案，酸性/中性KD比和/或酸性/中性t1/2比在5.75的酸性pH和7.2的中性pH和25
℃温度测定。
[0088] 一旦鉴定到带有中间pH-依赖性结合特性之抗体，则可以将所鉴定的抗体进行诱变以增进抗体对抗原之pH-依赖性结合。“增进的pH-依赖性结合”指，突变形式的抗体比突变前的原始“亲本”(亦即中间pH-依赖性)抗体具有较大的酸性/中性KD比、或较小的酸性/中性t1/2比。在一些实施方案中，“增进的pH-依赖性结合”指，在酸性pH(例如pH 6.0)时抗体与其抗原结合之t1/2小于诱变前抗体之t1/2。在一些实施方案中，“增进的pH-依赖性结合”指，在酸性pH(例如pH 6.0)时抗体与其抗原结合之t1/2低于约16分钟，低于约10分钟，低于约5分钟，低于约2分钟或低于约1.5分钟(例如在25℃)。
[0089] 根据本发明此方面，诱变步骤可包括在抗体的重链及/或轻链内缺失、取代或添加氨基酸。根据一些实施方案，此诱变在抗体的一或多个可变域内，例如在一或多个CDR内进行。例如，诱变可包括将抗体之一或多个CDR内的氨基酸取代为另外的氨基酸。在一些实施方案中，诱变包括将抗体之至少一个CDR内的一或多个氨基酸取代为组氨酸。
[0090] 在文中所述的工作实施例中，带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体(例如，全人抗-PCSK9抗体)使用如上所述之筛选/诱变方法产生；然而，根据本发明此方面之方法可
用于产生结合任何抗原的、带有pH-依赖性结合特性之抗体，其中所述抗体以有用或期望的pH-依赖特性结合抗原。根据本发明此方面之方法可用于产生当施用于对象或病患时具有
延长的血清半衰期之抗体。
用于产生结合任何抗原的、带有pH-依赖性结合特性之抗体，其中所述抗体以有用或期望的pH-依赖特性结合抗原。根据本发明此方面之方法可用于产生当施用于对象或病患时具有
延长的血清半衰期之抗体。
[0091] “双组氨酸”(His-His)诱变制造pH-依赖性的抗体
[0092] 基于文中所述的特定实验，意外地发现，在与CDR中天然的组氨酸残基临近(例如，紧上游或下游)之残基处，将组氨酸取代导入抗体的CDR中以藉此产生His-His氨基酸序列，可将带有中间pH-依赖性结合特性之抗体转变成具有更明显的pH-依赖性结合特性之抗体。如文中所用，“更明显的pH-依赖性结合特性”指，抗体在导入组氨酸取代后，比导入组氨酸取代之前，显示下列一或多项：(a)更大的酸性/中性KD比；(b)更大的酸性/中性kd比；及/或(c)更小酸性/中性t1/2比。例如，文中称为300N之抗体具有中间pH-依赖性结合特性且在
LCDR1(参见SEQ ID NO：228)之第五个氨基酸位置含有单一天然生成的组氨酸。藉由在
LCDR1之第四个氨基酸位置导入组氨酸取代(产生包含具有SEQ ID NO：802的LCDR1的“VK-
L30H”抗体)，所得抗体被发现具有比300N明显得多的pH-依赖性结合特性，如文中实施例3A和3B所示。此“双-His”突变策略为一种可以用于产生具有明显pH-依赖性结合特性之抗体的通用方法学。因此，本发明包括用于增进抗体之pH-依赖性质之方法，其包括选择带有中间pH-依赖性结合特性之抗体，并在与现有的组氨酸残基相邻的氨基酸位置，将组氨酸取代导入抗体之一或多个CDR中，藉此制造带有更明显pH-依赖性结合特性之抗体(例如，比导入组氨酸取代前之亲本抗体具有更大的酸性/中性KD比)。此方法亦可应于正常在CDR中缺乏
任何组氨酸残基之抗体，例如，通过在一或多个CDR内相邻的氨基酸位置导入二或多个组氨酸取代。
LCDR1(参见SEQ ID NO：228)之第五个氨基酸位置含有单一天然生成的组氨酸。藉由在
LCDR1之第四个氨基酸位置导入组氨酸取代(产生包含具有SEQ ID NO：802的LCDR1的“VK-
L30H”抗体)，所得抗体被发现具有比300N明显得多的pH-依赖性结合特性，如文中实施例3A和3B所示。此“双-His”突变策略为一种可以用于产生具有明显pH-依赖性结合特性之抗体的通用方法学。因此，本发明包括用于增进抗体之pH-依赖性质之方法，其包括选择带有中间pH-依赖性结合特性之抗体，并在与现有的组氨酸残基相邻的氨基酸位置，将组氨酸取代导入抗体之一或多个CDR中，藉此制造带有更明显pH-依赖性结合特性之抗体(例如，比导入组氨酸取代前之亲本抗体具有更大的酸性/中性KD比)。此方法亦可应于正常在CDR中缺乏
任何组氨酸残基之抗体，例如，通过在一或多个CDR内相邻的氨基酸位置导入二或多个组氨酸取代。
[0093] 表位作图(epitope mapping)及相关技术
[0094] 本发明包括与PCSK9之前域(pro-domain)(SEQ ID NO：755之1至152氨基酸)内的一或多个氨基酸相互作用之抗-PCSK9抗体。本发明亦包括与PCSK9之催化域(SEQ ID NO：
755之153至425氨基酸)内的一或多个氨基酸相互作用之抗-PCSK9抗体。本发明亦包括与
PCSK9之C-端域(SEQ ID NO：755之426至692氨基酸)内的一或多个氨基酸相互作用之抗-
PCSK9抗体。在一些情况下，本发明之抗-PCSK9抗体与位于PCSK9之二个相邻结构域内的氨
基酸相互作用。与抗体结合之表位可由位于一或多个PCSK9结构域内的3或更多个(例如3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。备选地，表位可由位于一或多个PCSK9结构域内的多数个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
755之153至425氨基酸)内的一或多个氨基酸相互作用之抗-PCSK9抗体。本发明亦包括与
PCSK9之C-端域(SEQ ID NO：755之426至692氨基酸)内的一或多个氨基酸相互作用之抗-
PCSK9抗体。在一些情况下，本发明之抗-PCSK9抗体与位于PCSK9之二个相邻结构域内的氨
基酸相互作用。与抗体结合之表位可由位于一或多个PCSK9结构域内的3或更多个(例如3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。备选地，表位可由位于一或多个PCSK9结构域内的多数个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
[0095] 各种本领域技术人员已知的技术皆可用于测定抗体是否与多肽或蛋白内的“一或多个氨基酸相互作用”。示例的技术包括，例如常规交叉阻断试验，例如描述于Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中的试验，丙氨酸
扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)、及肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位提取及抗原之化学修饰等方法(Tomer 2000,
Protein Science 9：487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体之相互作用之氨基酸的另外方法为，以质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法包括以氘标记目的蛋白，接着让抗体与氘标记的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合物转移至水中，以允许在除了受抗体保护的残基(其仍为氘标记)以外的所有残基处发生氢-氘交换。抗体解离后，将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析，藉此找出氘标记的残基，所述残基对应于与抗体交互作用之特异性氨
基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)、及肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位提取及抗原之化学修饰等方法(Tomer 2000,
Protein Science 9：487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体之相互作用之氨基酸的另外方法为，以质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法包括以氘标记目的蛋白，接着让抗体与氘标记的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合物转移至水中，以允许在除了受抗体保护的残基(其仍为氘标记)以外的所有残基处发生氢-氘交换。抗体解离后，将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析，藉此找出氘标记的残基，所述残基对应于与抗体交互作用之特异性氨
基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
[0096] 本发明还包括与任何文中所述之具体示例性抗体结合相同之表位的抗-PCSK9抗体。例如，本发明包括与文中表3所列的任何组氨酸取代变体抗体结合相同表位的抗-PCSK9抗体(例如，VH-G26H、VH-F27H、VH-T28H、VH-F29H、VH-S30H、VH-S31H、VH-W33H、VH-I51H、VH-N52H、VH-Q53H、VH-D54H、VH-G55H、VH-S56H、VH-E57H、VH-K58H、VH-A97、VH-R98H、VH-D99H、VH-I100H、VH-V101H、VH-L102H、VH-M103H、VH-V104H、VH-Y105H、VH-D106H、VH-M107H、VH-D108H、VH-Y109H、VH-Y110H、VH-Y111H、VH-Y112H、VH-G113H、VH-M114H、VH-D115H、VH-V116H、VK-Q27H、VK-S28H、VK-L29H、VK-L30H、VK-S32H、VK-N33H、VK-G34H、VK-N35H、VK-N36H、VK-Y37H、VK-L55H、VK-G56H、VK-S57H、VK-M94H、VK-Q95H、VK-T96H、VK-L97H、VK-Q98H、VK-T99H、VK-P100H、VK-L101H、VK-T102H)。同样的，本发明亦包括与任何文中表3所列的组氨酸取代变体抗体竞争结合PCSK9之抗-PCSK9抗体(例如，VH-G26H、VH-F27H、VH-T28H、VH-F29H、VH-S30H、VH-S31H、VH-W33H、VH-I51H、VH-N52H、VH-Q53H、VH-D54H、VH-G55H、VH-S56H、VH-E57H、VH-K58H、VH-A97、VH-R98H、VH-D99H、VH-I100H、VH-V101H、VH-L102H、VH-M103H、VH-V104H、VH-Y105H、VH-D106H、VH-M107H、VH-D108H、VH-Y109H、VH-Y110H、VH-Y111H、VH-Y112H、VH-G113H、VH-M114H、VH-D115H、VH-V116H、VK-Q27H、VK-S28H、VK-L29H、VK-L30H、VK-S32H、VK-N33H、VK-G34H、VK-N35H、VK-N36H、VK-Y37H、VK-L55H、VK-G56H、VK-S57H、VK-M94H、VK-Q95H、VK-T96H、VK-L97H、VK-Q98H、VK-T99H、VK-P100H、VK-L101H、VK-T102H)。
[0097] 藉由使用本领域已知的常规方法，可容易地测定抗体是否与参照抗-PCSK9抗体与相同的表位结合或竞争结合。例如，为了测定试验抗体是否与本发明之参照抗-PCSK9抗体
结合相同的表位，可以让参照抗体与PCSK9蛋白结合。接着，评估试验抗体与PCSK9分子结合之能力。若试验抗体在参照抗-PCSK9抗体饱和结合后能与PCSK9结合，则可得出结论：该试验抗体与参照抗-PCSK9抗体结合不同的表位。另一方面，若试验抗体在参照抗-PCSK9抗体
饱和结合后不能与PCSK9分子结合，则试验抗体可能与本发明之参照抗-PCSK9抗体结合相
同之表位。然后可进行另外常规实验(例如肽突变和结合分析)，以验证所观察到的无试验
抗体结合是否事实上是由于与参照抗-PCSK9抗体结合相同的表位所致，或是由空间阻断
(或另外的现象)造成了没有观察到结合。此类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本领域中可得的任何其它定量或定性抗体-结合试验来进行。依照本发明一些实施方案，如于竞争性结合试验中所测，若例如1-、5-、10-、20-或100-倍过量的一种抗体抑制另一抗体之结合达至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，则二种抗体与相同(或重叠)的表位结合(参见，例如Junghans等人,Cancer Res.199050：1495-1502)。备选地，若抗原中可以降低或消除一种抗体之结合的基本上所有的氨基酸突变也降低或消除另一种抗体之结合，则
二种抗体被认为与相同的表位结合。若降低或消除一种抗体之结合的氨基酸突变中仅一个
亚群会降低或消除另一种抗体之结合，则二种抗体被认为具有“重叠的表位”。
结合相同的表位，可以让参照抗体与PCSK9蛋白结合。接着，评估试验抗体与PCSK9分子结合之能力。若试验抗体在参照抗-PCSK9抗体饱和结合后能与PCSK9结合，则可得出结论：该试验抗体与参照抗-PCSK9抗体结合不同的表位。另一方面，若试验抗体在参照抗-PCSK9抗体
饱和结合后不能与PCSK9分子结合，则试验抗体可能与本发明之参照抗-PCSK9抗体结合相
同之表位。然后可进行另外常规实验(例如肽突变和结合分析)，以验证所观察到的无试验
抗体结合是否事实上是由于与参照抗-PCSK9抗体结合相同的表位所致，或是由空间阻断
(或另外的现象)造成了没有观察到结合。此类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本领域中可得的任何其它定量或定性抗体-结合试验来进行。依照本发明一些实施方案，如于竞争性结合试验中所测，若例如1-、5-、10-、20-或100-倍过量的一种抗体抑制另一抗体之结合达至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，则二种抗体与相同(或重叠)的表位结合(参见，例如Junghans等人,Cancer Res.199050：1495-1502)。备选地，若抗原中可以降低或消除一种抗体之结合的基本上所有的氨基酸突变也降低或消除另一种抗体之结合，则
二种抗体被认为与相同的表位结合。若降低或消除一种抗体之结合的氨基酸突变中仅一个
亚群会降低或消除另一种抗体之结合，则二种抗体被认为具有“重叠的表位”。
[0098] 为了测定一个抗体是否与参照抗-PCSK9抗体竞争结合，可以以二个方向实施上述结合方法：第一个方向，让参照抗体在饱和条件下与PCSK9结合，接着评估试验抗体与PCSK9分子之结合。第二个方向，让试验抗体在饱和条件下与PCSK9分子结合，接着评估参照抗体与PCSK9分子之结合。若在二个方向中仅有第一(饱和)抗体能与PCSK9分子结合，则可以得
出结论：试验抗体和参照抗体竞争与PCSK9结合。本领域技术人员明了，与参照抗体竞争结合之抗体可能不一定与参照抗体结合相同之表位，而可能藉由与重叠或相邻的表位结合而
在空间上阻断参照抗体之结合。
出结论：试验抗体和参照抗体竞争与PCSK9结合。本领域技术人员明了，与参照抗体竞争结合之抗体可能不一定与参照抗体结合相同之表位，而可能藉由与重叠或相邻的表位结合而
在空间上阻断参照抗体之结合。
[0099] 制备人抗体
[0100] 产生单克隆抗体(包括全长的人单克隆抗体)之方法已为本领域所知。任何此等已知的方法皆可用于本发明中，用以制造特异与人PCSK9结合之抗体，包括重组人抗体。然后此等抗体可用作亲本抗体，从其可衍生组氨酸取代的变体抗体(例如，具有pH-依赖性结合
性质之组氨酸取代的变体抗体)。
性质之组氨酸取代的变体抗体)。
[0101] 使用VELOCIMMUNETM技术或任何其它已知的产生单克隆抗体之方法，可以起初先分离对PCSK9具高亲和力之具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。表征抗体，并就所期望的性质来选择，包括亲和力、选择性、表位等。以所期望的人恒定区(例如野生型或修饰型IgG1或IgG4)置换小鼠恒定区，产生全人抗体。尽管所选的恒定区可能随特定用途而不同，但高亲和力抗原结合及靶特异性特征留存在可变区内。
[0102] 生物等同方案
[0103] 除了文中特定作为示例之组氨酸取代外，本发明亦涵盖具有与文中所述的抗体不同之氨基酸序列但保留以pH-依赖性结合性质结合人PCSK9的能力的抗体。此等变体抗体及
抗体片段，当与亲代序列相比较时，包括一或多个氨基酸之添加、缺失或取代，但具有与所述的抗体实质上相当之生物活性。同样地，本发明之抗-PCSK9抗体编码DNA序列，当与所公开的序列相比较时，包括含一或多个核苷酸添加、缺失或取代的序列，但其所编码的抗-
PCSK9抗体或抗体片段与本发明之抗-PCSK9抗体或抗体片段为实质上生物等同的。
抗体片段，当与亲代序列相比较时，包括一或多个氨基酸之添加、缺失或取代，但具有与所述的抗体实质上相当之生物活性。同样地，本发明之抗-PCSK9抗体编码DNA序列，当与所公开的序列相比较时，包括含一或多个核苷酸添加、缺失或取代的序列，但其所编码的抗-
PCSK9抗体或抗体片段与本发明之抗-PCSK9抗体或抗体片段为实质上生物等同的。
[0104] 对于二种抗原结合蛋白或抗体，如果例如它们为医药等同物或医药替代物，当于类似的实验条件下以相同的摩尔剂量单剂或多剂施用时，其吸收速率和程度并不显示显著
的差异，则这二种抗原结合蛋白或抗体被视为生物等同的。一些抗体若其具有相当的吸收
程度但不具有相当的吸收速率，则将被视为等同物或医药替代物，且仍可被视为生物等同
的，这是因为：吸收速率上的差异为有意的并反映在标签上，其对于达到(例如长期使用时)有效的身体药物浓度并非必要，并且就所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧
要的。
的差异，则这二种抗原结合蛋白或抗体被视为生物等同的。一些抗体若其具有相当的吸收
程度但不具有相当的吸收速率，则将被视为等同物或医药替代物，且仍可被视为生物等同
的，这是因为：吸收速率上的差异为有意的并反映在标签上，其对于达到(例如长期使用时)有效的身体药物浓度并非必要，并且就所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧
要的。
[0105] 在一实施方案中，二种抗原结合蛋白若在其安全性、纯度及效力上不具有临床上有意义的差异，则为生物等同的。
[0106] 在一实施方案中，如果病患可在参照产品和生物产品间进行一或多次转换，且相对于无转换的持续治疗，没有发生预期的副反应危险增加(包括免疫原性的临床显著改变
或减小的效力)，则这两种抗原结合蛋白为生物等同的。
或减小的效力)，则这两种抗原结合蛋白为生物等同的。
[0107] 在一实施方案中，若二种抗原结合蛋白藉由共同的作用机制(一种或多种)(就此机制已知的程度而言)在所用病况(一种或多种)中发挥作用，则这二种抗原结合蛋白为生
物等同的。
物等同的。
[0108] 生物等同性可藉由体内和体外方法来证实。生物等同性测量包括，例如(a)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中测量血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代谢物随时间变化之浓度；(b)与人体内生物利用度数据已经相互关联并且可合理预示该数据之
体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中随时间变化，测量抗体(或其目标)的合适急性药理效应；及(d)建立抗体之安全性、效力或生物利用度或生物等同性的良好对照的临床试验。
体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中随时间变化，测量抗体(或其目标)的合适急性药理效应；及(d)建立抗体之安全性、效力或生物利用度或生物等同性的良好对照的临床试验。
[0109] 本发明之抗-PCSK9抗体的生物等同变体可藉由，例如制造各种残基或序列之取代、或缺失生物活性不需要的末端或内部残基或序列来建构。例如，非生物活性所必需的半胱氨酸残基可以被缺失或以其它的氨基酸置换，以防止不必要或不正确的分子内二硫桥在
复性时形成。在其它上下文中，生物等同抗体可包括抗-PCSK9抗体变体，其包含修饰抗体之糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化之突变。
复性时形成。在其它上下文中，生物等同抗体可包括抗-PCSK9抗体变体，其包含修饰抗体之糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化之突变。
[0110] 物种选择性和物种交叉反应
[0111] 根据本发明一些实施方案，抗-PCSK9抗体与人PCSK9结合但不与其它物种的PCSK9结合。本发明亦包括与人PCSK9及来自一或多种非人物种之PCSK9结合的抗-PCSK9抗体。例
如本发明之抗-PCSK9抗体可与人PCSK9结合，并可以与或不与(视情况而定)一或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩PCSK9结合。
如本发明之抗-PCSK9抗体可与人PCSK9结合，并可以与或不与(视情况而定)一或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩PCSK9结合。
[0112] 多特异性抗体
[0113] 本发明之抗体可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个目标多肽之不同表位具特异性，或可含有对一个以上的目标多肽具特异性之抗原结合域。参见，例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22：
238-244。本发明之抗-PCSK9抗体可与另外的功能分子，例如另一肽或蛋白相连或共表达。
例如，抗体或其片段可与一或多个其它的分子实体，例如另外的抗体或抗体片段功能性连
接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价连结或其它)，产生带有第二结合特异性之双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白之一臂对人PCSK9或其片段具特异性，而免疫球蛋白之另一臂对第二治疗目标具特异性、或与治疗性结构部分
缀合。
238-244。本发明之抗-PCSK9抗体可与另外的功能分子，例如另一肽或蛋白相连或共表达。
例如，抗体或其片段可与一或多个其它的分子实体，例如另外的抗体或抗体片段功能性连
接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价连结或其它)，产生带有第二结合特异性之双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白之一臂对人PCSK9或其片段具特异性，而免疫球蛋白之另一臂对第二治疗目标具特异性、或与治疗性结构部分
缀合。
[0114] 可用于本发明中之示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域及第二Ig CH3域，其中第一和第二Ig CH3域至少有一个氨基酸互不相同，且其中相较于无此氨基酸差异之双特异性抗体，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白A之结合。在一实施方案中，第一Ig CH3域结合蛋白A而第二Ig CH3域含有降低或消除蛋白A结合之突变，例如H95R修饰(按IMGT外显子编号；按EU编号为H435R)。第二CH3可进一步包括Y96F修饰(按
IMGT；按EU为Y436F)。可以在第二CH3中发现的另外修饰包括：就IgG1抗体而言，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、和V82I(按IMGT；按EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；就IgG2抗体而言，N44S、K52N和V82I(按IMGT；按EU为N384S、K392N和V422I)；就IgG4抗体而言，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按IMGT；按EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之双特异性抗体形式之变异也涵盖在本发明之范围内。
IMGT；按EU为Y436F)。可以在第二CH3中发现的另外修饰包括：就IgG1抗体而言，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、和V82I(按IMGT；按EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；就IgG2抗体而言，N44S、K52N和V82I(按IMGT；按EU为N384S、K392N和V422I)；就IgG4抗体而言，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按IMGT；按EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之双特异性抗体形式之变异也涵盖在本发明之范围内。
[0115] 治疗性制剂及施用
[0116] 本发明提供包括本发明抗-PCSK9抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明之药物组合物使用合适的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、和其它提供改善的转运、递送、耐受性等等之药剂进行配制。大量合适的制剂可参见所有医药化学家已知的处方集：宾州伊斯顿马克出版公司之Remington'
sPharmaceutical Sciences。这些制剂包括，例如散剂、糊膏、软膏、软冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊膏、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量之聚乙二醇)、半固体凝胶、及含碳蜡之半固体混合物。亦参见Powell等人"Compendium of excipients for
parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311
sPharmaceutical Sciences。这些制剂包括，例如散剂、糊膏、软膏、软冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊膏、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量之聚乙二醇)、半固体凝胶、及含碳蜡之半固体混合物。亦参见Powell等人"Compendium of excipients for
parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311
[0117] 施用给病患之抗体剂量可依照病患的年龄和体型大小、目标疾病、病状、施用路径等而不同。优选的剂量典型地根据体重或体表面积来计算。抗-PCSK9抗体施用之有效剂量和时程安排可依经验来决定；例如可以通过定期评估来监看病患进步，并据此调整剂量。再者，可使用本领域熟知的方法进行物种间剂量的比例换算(例如Mordenti等人,1991,
Pharmaceut.Res.8：1351)。
Pharmaceut.Res.8：1351)。
[0118] 已知多种递送系统，其可用于施用本发明之药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微囊中，能表达突变病毒之重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。导入方法包括(但不限于)皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服路径。组合物可以以任何方便的路径，例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并可与其它生
物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。
物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。
[0119] 本发明之药物组合物可以使用标准针头和注射器由皮下或静脉内递送。此外，就皮下递送而言，笔型递送装置可容易地用于递送本发明之药物组合物。此笔型递送装置可
为重复使用型或一次性用品。可重复使用的笔型递送装置一般利用可更换的药筒容纳药物
组合物。一旦药筒内的所有药物组合物已被施用、药筒变空，可以方便地将此空药筒丢弃，换上含有药物组合物的新药筒。然后可重复使用此笔型递送装置。在一次性笔型递送装置
中无可置换的药筒。取而代之的，一次性笔型递送装置将药物组合物预填在装置内的储槽
中。一但储槽中的药物组合物用完，则丢弃整个装置。
为重复使用型或一次性用品。可重复使用的笔型递送装置一般利用可更换的药筒容纳药物
组合物。一旦药筒内的所有药物组合物已被施用、药筒变空，可以方便地将此空药筒丢弃，换上含有药物组合物的新药筒。然后可重复使用此笔型递送装置。在一次性笔型递送装置
中无可置换的药筒。取而代之的，一次性笔型递送装置将药物组合物预填在装置内的储槽
中。一但储槽中的药物组合物用完，则丢弃整个装置。
[0120] 许多可重复使用的笔型和自动注射器递送装置可以应用于皮下递送本发明之药物组合物。实例包括，但不限于，AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、
TM
DISETRONIC 笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX
75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、
NOVOPENTMI,II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo
Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、
TM TM TM TM
OPTIPEN 、OPTIPEN PRO 、OPTIPEN STARLET 及OPTICLIK (sanofi-aventis,Frankfurt,
Germany)，等等。可以用于皮下递送本发明药物组合物之一次性笔型递送装置包括，但不限于，SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,
Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，等等。
TM
DISETRONIC 笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX
75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、
NOVOPENTMI,II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo
Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、
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OPTIPEN 、OPTIPEN PRO 、OPTIPEN STARLET 及OPTICLIK (sanofi-aventis,Frankfurt,
Germany)，等等。可以用于皮下递送本发明药物组合物之一次性笔型递送装置包括，但不限于，SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,
Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，等等。
[0121] 在一些情况下，药物组合物可以使用控制释放系统来递送。在一实施方案中，可使用泵(参见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一实施方案中，可使用聚合物质；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在再一实施方案中，可以将控制
释放系统放置在靠近组成物的目标的位置，由此仅需要全身剂量之一小部分(参见，例如
Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,
pp.115-138)。其它的控制释放系统论述于Langer,1990,Science 249：1527-1533的综述
中。
释放系统放置在靠近组成物的目标的位置，由此仅需要全身剂量之一小部分(参见，例如
Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,
pp.115-138)。其它的控制释放系统论述于Langer,1990,Science 249：1527-1533的综述
中。
[0122] 注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌内注射、滴注等剂型。这些注射制剂可以通过公开已知的方法来制备。例如，可以例如藉由将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中，制备注射制剂。注射用水性介质有，例如生理盐水、含葡萄糖之等渗溶液和其它助剂等，其可与合适的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油之聚环氧乙烷(50mol)加合物)]等组合使用。油性介质可使用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地装入合适的安培瓶中。
[0123] 有利地，上述之口服或肠胃外使用之药物组合物可以制备成单位剂量合适供给活性成份剂量之剂型。该单位剂量的剂型包括，例如锭剂、片剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。
一般，每单位剂量的剂型中含有的前述抗体量为约5至约500毫克；特别地在注射剂形式中，优选前述抗体的含量为约5至约100毫克，而对于其它剂型优选为约10至约250毫克。
一般，每单位剂量的剂型中含有的前述抗体量为约5至约500毫克；特别地在注射剂形式中，优选前述抗体的含量为约5至约100毫克，而对于其它剂型优选为约10至约250毫克。
[0124] 抗体之治疗用途
[0125] 本发明提供抗PCSK9抗体和其抗原结合片段，包括具有pH依赖性结合性质的抗PCSK9抗体，用于药物中。本发明包括：将包含抗-PCSK9抗体(例如，具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体)之治疗组合物施用给有此需要之对象的方法。治疗组合物可以包含文中
所述的任何抗-PCSK9抗体或其片段。如文中所用，表述“有此需要之对象”指这样的人或非人动物，所述人或非人动物表现出高胆固醇血症之一或多种症候或迹象，或已经被诊断出
患有高胆固醇血症，或可以受利于总血清胆固醇、LDL、甘油三酯或VLDL的降低，或可以受利于HDL的增加。本发明亦包括藉由施用本发明抗-PCSK9抗体(例如，具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体)降低脂蛋白(a)[Lp(a)]水平之方法。
所述的任何抗-PCSK9抗体或其片段。如文中所用，表述“有此需要之对象”指这样的人或非人动物，所述人或非人动物表现出高胆固醇血症之一或多种症候或迹象，或已经被诊断出
患有高胆固醇血症，或可以受利于总血清胆固醇、LDL、甘油三酯或VLDL的降低，或可以受利于HDL的增加。本发明亦包括藉由施用本发明抗-PCSK9抗体(例如，具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体)降低脂蛋白(a)[Lp(a)]水平之方法。
[0126] 在一些情况下，以本发明治疗制剂治疗之病患，除了具有升高水平的胆固醇、脂质、甘油三酯或脂蛋白之外，是健康的。例如，病患在治疗时可以不表现任何其它心血管、血栓或其它疾病或病症之风险因子。然而，在其它的情况下，病患基于如下疾病或病症的诊断或发生风险而选择，所述疾病或病症由升高的血清胆固醇、脂质、甘油三酯或脂蛋白造成或与其相关或伴随其产生。例如，在施用本发明药物组合物之时或之前，病患可以被诊断为或鉴定为有发生心血管疾病或病症，例如冠状动脉疾病、急性心肌梗塞、无症状的颈动脉粥样硬化、中风、外周动脉阻塞疾病等之风险。心血管疾病或病症，在一些情况下，为高胆固醇血症。例如，若病患经诊断或鉴定具有发生高胆固醇血病况，例如杂合家族性高胆固醇血症
(heFH)、纯合家族性高胆固醇血症(hoFH)、以及不同于家族性高胆固醇血症之高胆固醇血
症发病(nonFH)的风险，则此病患可被选择以本发明药物组合物进行治疗。
(heFH)、纯合家族性高胆固醇血症(hoFH)、以及不同于家族性高胆固醇血症之高胆固醇血
症发病(nonFH)的风险，则此病患可被选择以本发明药物组合物进行治疗。
[0127] 在其它的情况下，在施用本发明药物组合物之时或之前，病患可以经诊断或鉴定为有发生血栓闭塞性疾病或病症，例如肺栓塞、视网膜中央静脉阻塞等之风险。在一些实施方案中，基于病患被诊断为具有二或多种上述疾病或病症之组合或有发生所述疾病组合的
风险，而选择病患。例如，在施用本发明药物组合物之时或之前，病患可以被诊断或鉴定为有发生冠状动脉疾病和肺栓塞之风险。其它的诊断组合(例如，动脉粥样硬化及视网膜中央静脉闭塞、heFH和中风等)亦包括在可用本发明药物组合物治疗之病患群的定义中。
风险，而选择病患。例如，在施用本发明药物组合物之时或之前，病患可以被诊断或鉴定为有发生冠状动脉疾病和肺栓塞之风险。其它的诊断组合(例如，动脉粥样硬化及视网膜中央静脉闭塞、heFH和中风等)亦包括在可用本发明药物组合物治疗之病患群的定义中。
[0128] 本发明之药物组合物亦可用于治疗由选自下列的潜在疾病或病症造成或与其相关之高胆固醇血症或血脂异常：代谢综合征、糖尿病、甲状腺机能减退、肾病综合征、肾衰竭、库欣氏综合征、胆汁性肝硬化、糖原储积病、肝瘤、胆汁郁积、生长激素缺乏。本发明之药物组合物亦可用于治疗由之前的治疗疗法，例如雌激素治疗、黄体酮治疗、β阻断剂或利尿剂等造成或与其相关之高胆固醇血症或血脂异常。
[0129] 在再其它的情况下，以本发明药物组合物治疗之病患基于选自下列的一或多个因素来选择：年龄(例如，大于40、45、50、55、60、65、70、75或80岁)、种族、性别(男性或女性)、运动习惯(例如，规律运动者、非运动者)、其它已存在的医学症状(例如，II型糖尿病、高血压等)及目前的用药状况(例如，目前服用他汀类(statins)[例如，西立伐他汀
(cerivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀
(pitavastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀
(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等]、β阻断剂、烟酸等)。本发明包括将本发明药物组合物(例如，包含具有pH依赖性结合特性的抗PCKS9抗体的组合物)施用给如下病患的方
法，所述病患不耐受他汀药物或对他汀药物过敏，或对常规他汀药物治疗的反应不完全或
不充分。在使用本发明方法进行治疗之前，可以基于这些因素之一或多个(例如，通过问卷、诊断评估等)，选择/筛选潜在的病患。
(cerivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀
(pitavastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀
(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等]、β阻断剂、烟酸等)。本发明包括将本发明药物组合物(例如，包含具有pH依赖性结合特性的抗PCKS9抗体的组合物)施用给如下病患的方
法，所述病患不耐受他汀药物或对他汀药物过敏，或对常规他汀药物治疗的反应不完全或
不充分。在使用本发明方法进行治疗之前，可以基于这些因素之一或多个(例如，通过问卷、诊断评估等)，选择/筛选潜在的病患。
[0130] 本发明亦包括：藉由将PCSK9抑制剂施用给对象、于此对象中增加经肠道的胆固醇分泌(TICE)之方法。例如，本发明提供藉由将带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体施用给对象而增加对象的TICE之方法。根据一些实施方案，本发明包括方法，所述方法包括：鉴定将受益于增进的TICE的对象，或鉴定具有受损的TICE的对象，和将PCSK9抑制剂施用给该对象。
[0131] 已知他汀类药物上调病患中PCSK9水平(参见，例如Dubuc等人,Aug.2004,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1454-1459)。接受常规的抗-PCSK9治疗剂之他汀类-治疗的病患，比没有在进行他汀治疗的病患，具有较快的抗-PCSK9血清清除率。不受限于理论，提出在服用他汀类药物之病患中升高的PCSK9量可能导致抗-PCSK9抗体通过目标-介导
的清除过程而被更快消除。因此，服用他汀类之病患可能需要较大剂量及/或较频繁给予常规的抗-PCSK9治疗剂(例如，抗-PCSK9抗体)，以达到最佳的胆固醇降低。如文中所用，术语“常规的抗-PCSK9治疗剂”指，任何不具有pH-依赖性结合特性之PCSK9-结合分子，亦即与在中性pH中相比，在酸性pH中不具有下降之PCSK9结合的分子。本发明人想到，可藉由使用能在他汀治疗的病患体内有效再循环之抗-PCSK9抗体，来避免或规避他汀引起的靶介导的清
除现象。因此，本发明包括：藉由在进行他汀治疗方案之对象中施用治疗上有效量之具有
pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体，克服/避免他汀引起的、靶介导的、抗-PCSK9结合剂之清除的方法。本发明亦包括：用于降低为达到充分的降胆固效用而必须施用给服用他汀的
病患之抗-PCSK9剂用量的方法，及/或用于降低向服用他汀的病患施用抗-PCSK9剂之频率
的方法，其中此方法包括：以具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体取代最初施用给病患之常规的抗-PCSK9剂，来修改病患的治疗给药方案。任何文中所述的pH-依赖的抗-PCSK9抗体皆可用于前述的方法中。
的清除过程而被更快消除。因此，服用他汀类之病患可能需要较大剂量及/或较频繁给予常规的抗-PCSK9治疗剂(例如，抗-PCSK9抗体)，以达到最佳的胆固醇降低。如文中所用，术语“常规的抗-PCSK9治疗剂”指，任何不具有pH-依赖性结合特性之PCSK9-结合分子，亦即与在中性pH中相比，在酸性pH中不具有下降之PCSK9结合的分子。本发明人想到，可藉由使用能在他汀治疗的病患体内有效再循环之抗-PCSK9抗体，来避免或规避他汀引起的靶介导的清
除现象。因此，本发明包括：藉由在进行他汀治疗方案之对象中施用治疗上有效量之具有
pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体，克服/避免他汀引起的、靶介导的、抗-PCSK9结合剂之清除的方法。本发明亦包括：用于降低为达到充分的降胆固效用而必须施用给服用他汀的
病患之抗-PCSK9剂用量的方法，及/或用于降低向服用他汀的病患施用抗-PCSK9剂之频率
的方法，其中此方法包括：以具有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体取代最初施用给病患之常规的抗-PCSK9剂，来修改病患的治疗给药方案。任何文中所述的pH-依赖的抗-PCSK9抗体皆可用于前述的方法中。
[0132] 组合治疗
[0133] 本发明亦提供包括将包含文中所述之任何示例性抗-PCSK9抗体之药物组合物与一或多种另外的治疗剂组合施用之治疗方法。可与本发明之抗-PCSK9抗体组合施用之示例
性另外的治疗剂包括，例如他汀类(阿伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀等)、烟酸、纤维酸(fibric acid)、胆酸螯合剂(例如，胆苯烯铵(cholestyramine))、考来维仑(colesevelam)、考来替泊(colestipol)、依折麦布(ezetimibe)、抗-高血压剂、抗-糖尿病剂、类血管生成素蛋白3(ANGPTL3)或类血管生成素蛋白-4(ANGPTL4)之拮抗剂(例如，抗-ANGPTL3抗体[例如，如WO2008/073300或US 7,
935,796中所述之抗-ANGPTL3抗体]或抗-ANGPTL4抗体[例如，如WO2006/0074228或WO2007/
109307或WO 2011/0792575中所述之抗-ANGPTL4抗体])以及任何前述另外治疗剂之组合。
性另外的治疗剂包括，例如他汀类(阿伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀等)、烟酸、纤维酸(fibric acid)、胆酸螯合剂(例如，胆苯烯铵(cholestyramine))、考来维仑(colesevelam)、考来替泊(colestipol)、依折麦布(ezetimibe)、抗-高血压剂、抗-糖尿病剂、类血管生成素蛋白3(ANGPTL3)或类血管生成素蛋白-4(ANGPTL4)之拮抗剂(例如，抗-ANGPTL3抗体[例如，如WO2008/073300或US 7,
935,796中所述之抗-ANGPTL3抗体]或抗-ANGPTL4抗体[例如，如WO2006/0074228或WO2007/
109307或WO 2011/0792575中所述之抗-ANGPTL4抗体])以及任何前述另外治疗剂之组合。
[0134] 另外的治疗活性剂可在本发明抗-PCSK9抗体临用前、同时、或之后不久施用(就本公开之目的，此等施用疗法被视为是本发明之抗-PCSK9抗体与另外的治疗活性剂的“组合”施用)。本发明包括其中本发明之抗-PCSK9抗体与一或多种如文中他处所述之另外的治疗
活性组份共配制之药物组合物。
活性组份共配制之药物组合物。
[0135] 本发明亦提供包括将包含文中所述之任何示例性抗-PCSK9抗体之药物组合物施用给病患的方法，其中，在本发明药物组合物施用之时或临用前所述病患在接受用于治疗
高胆固醇血症或相关症状之治疗方案。例如，之前已诊断患有高胆固醇血症之病患可以，在包括本发明抗-PCSK9抗体之药物组合物施用之前及/或同时，已经被给予并正接受另外药
物的稳定治疗方案处方。该之前或同时的治疗方案可包括，例如(1)藉由抑制3-羟基-3-甲
基-戊二酰基(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶，引起细胞耗竭胆固醇合成之药剂，例如他汀类(例
如，西立伐他汀、阿伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀及普伐他汀等)；(2)抑制胆固醇摄取及/或胆酸再吸收之药剂；(3)增加脂蛋白代谢之药剂(例如烟
酸)；及/或(4)参与胆固醇消除之LXR转录因子的活化剂，例如22-羟基胆固醇。在一些实施方案中，在施用抗-PCSK9抗体之前及/或同时，病患在服用治疗剂之固定组合，例如依折麦布+辛伐他汀；他汀与胆酸树脂(例如胆苯烯铵、考来替泊、考来维仑)；烟酸+他汀(例如烟酸与洛伐他汀)；或联合其它降脂质药物，例如ω-3-脂肪酸乙酯(例如omacor)。
高胆固醇血症或相关症状之治疗方案。例如，之前已诊断患有高胆固醇血症之病患可以，在包括本发明抗-PCSK9抗体之药物组合物施用之前及/或同时，已经被给予并正接受另外药
物的稳定治疗方案处方。该之前或同时的治疗方案可包括，例如(1)藉由抑制3-羟基-3-甲
基-戊二酰基(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶，引起细胞耗竭胆固醇合成之药剂，例如他汀类(例
如，西立伐他汀、阿伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀及普伐他汀等)；(2)抑制胆固醇摄取及/或胆酸再吸收之药剂；(3)增加脂蛋白代谢之药剂(例如烟
酸)；及/或(4)参与胆固醇消除之LXR转录因子的活化剂，例如22-羟基胆固醇。在一些实施方案中，在施用抗-PCSK9抗体之前及/或同时，病患在服用治疗剂之固定组合，例如依折麦布+辛伐他汀；他汀与胆酸树脂(例如胆苯烯铵、考来替泊、考来维仑)；烟酸+他汀(例如烟酸与洛伐他汀)；或联合其它降脂质药物，例如ω-3-脂肪酸乙酯(例如omacor)。
[0136] 剂量
[0137] 根据本发明之方法和施用方案，施用给对象之抗-PCSK9抗体的量一般为治疗上有效量。如文中所用，“治疗上有效量”一词指，导致可检测的血清LDL-C降低之抗-PCSK9抗体剂量，或抑制、防止、减轻或延迟高胆固醇血症及/或相关症状之进展的抗-PCSK9抗体剂量。
就带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体的情况而言，治疗上有效量可从约0.05mg至约
600mg，例如约0.05mg，约0.1mg，约1.0mg，约1.5mg，约2.0mg，约10mg，约20mg，约30mg，约
40mg，约50mg，约60mg，约70mg，约75mg，约80mg，约90mg，约100mg，约110mg，约120mg，约
130mg，约140mg，约150mg，约160mg，约170mg，约180mg，约190mg，约200mg，约210mg，约
220mg，约230mg，约240mg，约250mg，约260mg，约270mg，约280mg，约290mg，约300mg，约
310mg，约320mg，约330mg，约340mg，约350mg，约360mg，约370mg，约380mg，约390mg，约
400mg，约410mg，约420mg，约430mg，约440mg，约450mg，约460mg，约470mg，约480mg，约
490mg，约500mg，约510mg，约520mg，约530mg，约540mg，约550mg，约560mg，约570mg，约
580mg，约590mg或约600mg的抗-PCSK9抗体。
就带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体的情况而言，治疗上有效量可从约0.05mg至约
600mg，例如约0.05mg，约0.1mg，约1.0mg，约1.5mg，约2.0mg，约10mg，约20mg，约30mg，约
40mg，约50mg，约60mg，约70mg，约75mg，约80mg，约90mg，约100mg，约110mg，约120mg，约
130mg，约140mg，约150mg，约160mg，约170mg，约180mg，约190mg，约200mg，约210mg，约
220mg，约230mg，约240mg，约250mg，约260mg，约270mg，约280mg，约290mg，约300mg，约
310mg，约320mg，约330mg，约340mg，约350mg，约360mg，约370mg，约380mg，约390mg，约
400mg，约410mg，约420mg，约430mg，约440mg，约450mg，约460mg，约470mg，约480mg，约
490mg，约500mg，约510mg，约520mg，约530mg，约540mg，约550mg，约560mg，约570mg，约
580mg，约590mg或约600mg的抗-PCSK9抗体。
[0138] 包含在各单剂量中之抗-PCSK9抗体的量可以以每公斤病患体重之抗体毫克数来表示(亦即mg/kg)。例如，抗-PCSK9可以以约0.0001至约10mg/kg病患体重之剂量施用给病
患。
患。
[0139] 施用方案
[0140] 根据本发明一些实施方案，可于规定的时程中将多个剂量的抗-PCSK9抗体(例如包含带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体的药物组合物)施用给对象。根据本发明此方
面之方法包括：将多个剂量的抗-PCSK9抗体相继地施用给对象。如文中所用，“相继施用”指，每个剂量之抗-PCSK9抗体分别于不同的时间点施用给对象，例如，以预定的时间间隔
(例如小时、日、周或月)分开在不同日施用。本发明包括方法，其中所述方法包括：向病患相继地施用单一起始剂量之抗-PCSK9抗体，接着一或多个第二剂量之抗-PCSK9抗体、及任选
地接着一或多个第三剂量之抗-PCSK9抗体。
面之方法包括：将多个剂量的抗-PCSK9抗体相继地施用给对象。如文中所用，“相继施用”指，每个剂量之抗-PCSK9抗体分别于不同的时间点施用给对象，例如，以预定的时间间隔
(例如小时、日、周或月)分开在不同日施用。本发明包括方法，其中所述方法包括：向病患相继地施用单一起始剂量之抗-PCSK9抗体，接着一或多个第二剂量之抗-PCSK9抗体、及任选
地接着一或多个第三剂量之抗-PCSK9抗体。
[0141] 术语“起始剂量”、”第二剂量”和“第三剂量”系指，施用抗-PCSK9抗体之时间顺序。因此，”起始剂量”为在治疗方案开始时施用之剂量(亦称为“基线”剂量)；”第二剂量”为在起始剂量之后施用之剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后施用之剂量。起始、第二和第三剂量皆可含有相同量之抗-PCSK9抗体，但就施用的频率而言，一般可彼此不同。在一些实施方案中，然而，包含在起始、第二及/或第三剂量中之抗-PCSK9抗体的量在治疗期间可互不相同(例如，酌情上调或下调)。在一些实施方案中，在治疗方案开始时施用二或更多个(例如2、3、4或5个)剂量的“负荷剂量”(load doses)，接着以较低频率施用后续剂量(例如“维持剂量”)。负荷剂量可以以例如，一周一次，每2周一次、每3周一次、一个月一次、每2个月一次、每3个月一次等频率施用。
[0142] 在本发明一示例性的实施方案中，每个第二及/或第三剂量都在紧前一个剂量之后的1至60周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、40、50、60或更久)施用。“紧前一个剂量”一词，如文中所用，指在一系列的多个施用中，按序列在紧接下一个剂量施用之前给予病患的抗PCSK9抗体剂量，没有介入在所述两个剂量之间的剂量。
24、25、26、27、28、29、30、40、50、60或更久)施用。“紧前一个剂量”一词，如文中所用，指在一系列的多个施用中，按序列在紧接下一个剂量施用之前给予病患的抗PCSK9抗体剂量，没有介入在所述两个剂量之间的剂量。
[0143] 根据本发明此方面之方法可包括将任何数目之第二及/或第三剂量之抗-PCSK9抗体施用给病患。例如，在一些实施方案中，仅将单一一个第二剂量施用给病患。在其它实施方案中，将二或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量施用给病患。同样地，在一些实施方案中，仅将单一一个第三剂量施用给病患。在其它实施方案中，将二或多个(例如2、3、
4、5、6、7、8或更多)第三剂量施用给病患。在一些情况中，第二及/或第三剂量可以以特定的频率施用多年或持续对象的一生。
4、5、6、7、8或更多)第三剂量施用给病患。在一些情况中，第二及/或第三剂量可以以特定的频率施用多年或持续对象的一生。
[0144] 在涉及多重第二剂量之实施方案中，每个第二剂量可以与其它第二剂量以相同的频率来施用。例如，每个第二剂量都可以在紧前一个剂量后1至60周施用给病患。类似地，在涉及多重第三剂量之实施方案中，每个第三剂量都可以与其它第三剂量以相同的频率来施
用。例如，每个第三剂量都可以在紧前一个剂量后1至60周施用给病患。备选地，施用给病患之第二及/或第三剂量的频率，在治疗方案期间可不同。在治疗期间，施用频率亦可依照个体病患之需求在临床检查后由医师做调整。
实施例
用。例如，每个第三剂量都可以在紧前一个剂量后1至60周施用给病患。备选地，施用给病患之第二及/或第三剂量的频率，在治疗方案期间可不同。在治疗期间，施用频率亦可依照个体病患之需求在临床检查后由医师做调整。
实施例
[0145] 提出下列实施例，以向本领域技术人员提供有关如何制造及使用本发明方法和组合物之完整公开和说明，但这些实施例不旨在限制本发明的范围。虽已尽力确保所用的数
字(例如量、温度等)之准确性，但仍应对某些实验误差和偏差作出考虑。除非另有指出，否则份数为按重量计之份数，分子量为平均分子量，温度以摄氏度表示，而压力为或接近大气压。
字(例如量、温度等)之准确性，但仍应对某些实验误差和偏差作出考虑。除非另有指出，否则份数为按重量计之份数，分子量为平均分子量，温度以摄氏度表示，而压力为或接近大气压。
[0146] 实施例1.产生抗人PCSK9之人抗体
[0147] 人抗-PCSK9抗体按照美国专利第8,062,640号中所述而产生。表1列出所选的抗-PCSK9抗体之重链和轻链可变区氨基酸序列对和CDR氨基酸序列的序列识别符、及其对应的
抗体名称。核苷酸序列以对应于表1中的偶数序列标识符的奇数序列标识符给出。例如，SEQ ID NO:1是编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列；SEQ ID NO:3是编码SEQ ID NO:4
的氨基酸序列的核苷酸序列；等等。
抗体名称。核苷酸序列以对应于表1中的偶数序列标识符的奇数序列标识符给出。例如，SEQ ID NO:1是编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列；SEQ ID NO:3是编码SEQ ID NO:4
的氨基酸序列的核苷酸序列；等等。
[0148] 表1：所选的抗-PCSK9抗体之氨基酸序列识别符
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153] 表1中所列的任何抗-PCSK9抗体(已经述及其相应重链和经链可变区及/或CDR之氨基酸序列)均可用作亲本抗体，如下列非限定性工作实施例所示，可从其产生pH-依赖的
组氨酸取代变体抗体。
组氨酸取代变体抗体。
[0154] 实施例2.建构人抗-PCSK9抗体的组氨酸取代突变体
[0155] 命名为300N之抗-PCSK9抗体已知具有在酸性pH对PCSK9结合亲和力下降之中间pH-依赖性结合性质、及增进的药物动力学(参见美国专利第8,062,640号)。为了产生具有
甚至更大的pH-依赖性结合性质(亦即相较于中性pH，在低pH结合下降)及改善的体内效力
(例如，更长的抗体血清半衰期、延长的降胆固醇活性等)之300N变体，建构了一系列变体抗体。具体地，建构了突变版本之300N，其中300N之互补决定区(CDR)内的各氨基酸被单个地突变成组氨酸。如表1所示，亲本300N抗体之重链可变区(HCVR)包含SEQ ID NO：218氨基酸序列，亲本300N抗体之轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO：226氨基酸序列。亲本300N抗体之CDR序列如表2所示。表3显示His-取代的突变、以及衍生自300N之组氨酸取代变体抗体的对应抗体名称(例如，VH-G26H、VH-F27H等)。
甚至更大的pH-依赖性结合性质(亦即相较于中性pH，在低pH结合下降)及改善的体内效力
(例如，更长的抗体血清半衰期、延长的降胆固醇活性等)之300N变体，建构了一系列变体抗体。具体地，建构了突变版本之300N，其中300N之互补决定区(CDR)内的各氨基酸被单个地突变成组氨酸。如表1所示，亲本300N抗体之重链可变区(HCVR)包含SEQ ID NO：218氨基酸序列，亲本300N抗体之轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO：226氨基酸序列。亲本300N抗体之CDR序列如表2所示。表3显示His-取代的突变、以及衍生自300N之组氨酸取代变体抗体的对应抗体名称(例如，VH-G26H、VH-F27H等)。
[0156] 表2：mAb 300N之CDR序列
[0157]CDR 氨基酸序列 SEQ ID NO：
HCDR1 GFTFSSHW 220
HCDR2 INQDGSEK 222
HCDR1 GFTFSSHW 220
HCDR2 INQDGSEK 222
[0158]HCDR3 ARDIVLMVYDMDYYYYGMDV 224
LCDR1 QSLLHSNGNNY 228
LCDR2 LGS 230
LCDR3 MQTLQTPLT 232
LCDR1 QSLLHSNGNNY 228
LCDR2 LGS 230
LCDR3 MQTLQTPLT 232
[0159] 表3：mAb 300N之组氨酸取代变体之修饰的CDR序列
[0160]
[0161]
[0162] 就表3中所列的各变体抗体，除了表中所指出的突变CDR序列外，其余所有的CDR序列与亲本300N抗体(包括SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之CDR序列)相同。例如，称为“VH-D106H”之组氨酸取代变体抗体包括具有SEQ ID NO：220、222、788、228、230、232氨基酸序列之重链和轻链CDR序列(其中SEQ ID NO：224之HCDR3序列被SEQ ID NO：788之变体
HCDR3序列置换)。同样地，称为”VK-L30H”之组氨酸取代变体抗体包括具有SEQ ID NO：220、
222、224、802、230、232氨基酸序列之重链和轻链CDR序列(其中SEQ ID NO：228之LCDR1序列被SEQ ID NO：802之变体LCDR1序列置换)。
HCDR3序列置换)。同样地，称为”VK-L30H”之组氨酸取代变体抗体包括具有SEQ ID NO：220、
222、224、802、230、232氨基酸序列之重链和轻链CDR序列(其中SEQ ID NO：228之LCDR1序列被SEQ ID NO：802之变体LCDR1序列置换)。
[0163] 实施例3A.变体抗-PCSK9抗体在中性和酸性pH的结合性质
[0164] 使用实时等离子体共振生物传感器(Biacore T200)试验，在25℃、pH5.75或pH 7.2，测试实施例2之组氨酸取代变体抗体与人PCSK9的pH-依赖性结合。本实验的目的为鉴
定在酸性pH相对于在中性pH显示出降低的人PCSK9结合之组氨酸取代变体抗体。
定在酸性pH相对于在中性pH显示出降低的人PCSK9结合之组氨酸取代变体抗体。
[0165] Biacore CM4传感器芯片用单克隆小鼠抗-人Fc抗体衍生化，以捕捉人抗体。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达后，将来自培养基的组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体捕获
在抗-人Fc传感器表面。将范围在3.125nM至500nM之间的不同浓度的、带有C-端myc-myc-六组氨酸标签(hPCSK9-mmH)的人PCSK9(SEQ ID NO：755)，以50μl/min之流速注射在捕获了
抗-PCSK9单克隆抗体的表面上。监测抗体-抗原结合4或5分钟，然后监测抗原从捕获的单克隆抗体的解离5或8分钟。使用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理数据并与1：1结合模型拟合，测定了动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。结合解离平衡常数(KD)及解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算：KD(M)＝kd/ka；及t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
在抗-人Fc传感器表面。将范围在3.125nM至500nM之间的不同浓度的、带有C-端myc-myc-六组氨酸标签(hPCSK9-mmH)的人PCSK9(SEQ ID NO：755)，以50μl/min之流速注射在捕获了
抗-PCSK9单克隆抗体的表面上。监测抗体-抗原结合4或5分钟，然后监测抗原从捕获的单克隆抗体的解离5或8分钟。使用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理数据并与1：1结合模型拟合，测定了动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。结合解离平衡常数(KD)及解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算：KD(M)＝kd/ka；及t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
[0166] 在pH 7.2(中性)和pH 5.75(酸性)，各组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体与人PCSK9结合之KD值和t1/2值，以及这些相应值之pH 5.75/pH 7.2比值，显示在表4中。亲本300N抗体的值也显示于该表的最下行。KD值以molar(M)表示，t1/2以分钟(min)表示。
[0167] 表4：组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体之KD和t1/2值
[0168]
[0169]
[0170] 如表4所示(所有测量于25℃进行)，亲本(300N)抗体在pH 7.2和pH 5.75都显示中度结合亲和力(KD～0.9–1.0nM)，而相较于pH 7.2，在pH 5.75时t1/2下降3倍以上(亦即，在pH 5.75更快解离；pH 5.75/pH7.2比＝0.26)。
[0171] 相较于原来的序列，几种单组氨酸取代在pH 7.2和pH 5.75两者均造成实质上下降的结合，而其它的取代对pH依赖性结合影响极小。然而，重要地，几种单组氨酸突变导致抗体，相对于亲本抗体，在pH 5.75比在pH 7.2显示出实质上更快的解离速率(在pH 5.75之t1/2比pH 7.2之t1/2小至少5-倍)。带有pH-依赖性结合特性的这些抗体包括带重链CDR取代之抗体：VH-W33H、VH-Q53H、VH-I100H、VH-V104H、VH-D106H、VH-M107H和VH-Y112H；及带有轻链CDR取代之抗体：VK-L29H、VK-L30H、VK-N33H、VK-L97H、VK-T99H和VK-P100H。组氨酸取代变体抗体VH-D106H和VK-L30H显示出特别明显的pH-依赖性结合，被选择供进一步研究用。
[0172] 为了进一步研究组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体VH-D106H和VK-L30H以及双组氨酸取代变体(VH-D106H/VK-L30H)之pH-依赖性结合特性，将抗体纯化，并于中性pH(pH 7.4)
(表6)及酸性pH(pH 6.0)(表7)使用类似上述的条件进行与人PCSK9结合之试验。酸性pH对
中性pH之结合性质的比值如表8所示。数种对照/比对物抗体亦包括在这些实验中。此分析
中所测试的抗体汇总在表5中。所有的测量均在25℃进行。
(表6)及酸性pH(pH 6.0)(表7)使用类似上述的条件进行与人PCSK9结合之试验。酸性pH对
中性pH之结合性质的比值如表8所示。数种对照/比对物抗体亦包括在这些实验中。此分析
中所测试的抗体汇总在表5中。所有的测量均在25℃进行。
[0173] 表5：测试抗体的pH-依赖性结合性质
[0174]
[0175]
[0176] 表6：选择的纯化抗体于pH 7.4(中性pH)对人PCSK9的结合特性
[0177]抗体 ka(1/Ms) kd(1/sec) KD(M) t1/2(min)
316P(v1) 4.99E+05 3.08E-04 6.16E-10 37.6
316P(v2) 5.17E+05 2.92E-04 5.66E-10 39.5
300N(v1) 1.39E+05 7.03E-05 5.07E-10 164.4
300N(v2) 1.45E+05 7.93E-05 5.46E-10 145.6
VH-D106H 8.47E+04 8.98E-05 1.06E-09 128.6
VK-L30H 1.61E+05 2.93E-04 1.82E-09 39.4
VH-D106/VK-L30H 1.04E+05 2.78E-04 2.68E-09 41.5
比对物1 3.21E+04 1.02E-04 3.18E-09 113.1
比对物2 5.40E+05 3.33E-05 6.16E-11 347.3
比对物3 2.50E+05 3.26E-04 1.30E-09 35.4
比对物4 4.23E+05 2.14E-04 5.05E-10 54.0
比对物5 7.42E+05 7.31E-05 9.85E-11 158.0
比对物6 3.15E+05 6.61E-05 2.10E-10 174.7
比对物7 8.36E+04 6.09E-05 7.28E-10 189.8
比对物8 7.56E+03 7.23E-04 6.92E-08 22.1
比对物9 4.34E+03 2.14E-05 4.92E-09 540.7
316P(v1) 4.99E+05 3.08E-04 6.16E-10 37.6
316P(v2) 5.17E+05 2.92E-04 5.66E-10 39.5
300N(v1) 1.39E+05 7.03E-05 5.07E-10 164.4
300N(v2) 1.45E+05 7.93E-05 5.46E-10 145.6
VH-D106H 8.47E+04 8.98E-05 1.06E-09 128.6
VK-L30H 1.61E+05 2.93E-04 1.82E-09 39.4
VH-D106/VK-L30H 1.04E+05 2.78E-04 2.68E-09 41.5
比对物1 3.21E+04 1.02E-04 3.18E-09 113.1
比对物2 5.40E+05 3.33E-05 6.16E-11 347.3
比对物3 2.50E+05 3.26E-04 1.30E-09 35.4
比对物4 4.23E+05 2.14E-04 5.05E-10 54.0
比对物5 7.42E+05 7.31E-05 9.85E-11 158.0
比对物6 3.15E+05 6.61E-05 2.10E-10 174.7
比对物7 8.36E+04 6.09E-05 7.28E-10 189.8
比对物8 7.56E+03 7.23E-04 6.92E-08 22.1
比对物9 4.34E+03 2.14E-05 4.92E-09 540.7
[0178] 表7：选择的纯化抗体于pH 6.0(酸性pH)对人PCSK9的结合特性
[0179]
[0180]
[0181] *＝解离速率由于数据收集持续时间而被固定在1.00E-05s-1；因此KD和t1/2值分别以上限和下限报告在表7中。
[0182] 表8：选择的纯化抗体于pH 6.0/pH 7.4对人PCSK9的结合特性的比值(酸性/中性比)
[0183]
[0184] *＝对于该pH6.0测量，解离速率由于数据收集持续时间被固定在1.00E-05s-1；因此KD和t1/2值分别以上限和下限报告在表8中。
[0185] 高数值(例如，大于约12)之kd和KD的酸性/中性比，及低数值(例如，低于约0.20)之t1/2的酸性/中性比指示pH-依赖性结合。以这些标准，组氨酸取代变体抗体VK-L30H和双突变体VH-D106H/VK-L30H，在所有试验抗体中，具有最大程度的pH-依赖性结合特性。具体地，这些抗体各自表现出大于约28的kd酸性/中性比、大于约14的KD酸性/中性比、及小于约
0.05的t1/2酸性/中性比。
0.05的t1/2酸性/中性比。
[0186] 实施例3B.组氨酸变体抗-PCSK9抗体对人PCSK9之结合特性：在中性pH结合及在一系列中性和酸性pH解离
[0187] 为了进一步评估本发明抗-PCSK9抗体之pH-依赖性结合特性，进行结合实验，其中于37℃中性pH观察抗体/抗原结合相及于一系列中性或酸性pH观察抗体/抗原解离相。
[0188] Biacore CM4传感器芯片以Fab'2多克隆抗-人Fc抗体衍生，用以捕获人抗体。将选择的纯化组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体(VH-D106H、VK-L30H和VH-D016H/VK-L30H)以及亲
本抗体(316P和300N)和比对物抗体(比对物1-7，参见表5)捕获在抗-人Fc传感器表面。将带有C-端myc-myc-六组氨酸标签(hPCSK9-mmH)之人PCSK9，以从3.125nM至50nM的不同浓度，
以30μl/min之流速，注射于捕获了抗-PCSK9单克隆抗体的表面。于pH 7.4监测抗体-抗原结合历时6分钟，然后于pH 7.4、7.2、6.0或5.75监测抗原从捕获的单克隆抗体的解离历时5分钟。藉由使用Scrubber 2.0版曲线拟合软件处理及拟合数据，测定解离(kd)速率常数。解离半衰期(t1/2)由解离速率常数计算：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60。描绘抗体在各种pH条件下的结合/解离特性的传感图如图3A至3G中之图形所示。
本抗体(316P和300N)和比对物抗体(比对物1-7，参见表5)捕获在抗-人Fc传感器表面。将带有C-端myc-myc-六组氨酸标签(hPCSK9-mmH)之人PCSK9，以从3.125nM至50nM的不同浓度，
以30μl/min之流速，注射于捕获了抗-PCSK9单克隆抗体的表面。于pH 7.4监测抗体-抗原结合历时6分钟，然后于pH 7.4、7.2、6.0或5.75监测抗原从捕获的单克隆抗体的解离历时5分钟。藉由使用Scrubber 2.0版曲线拟合软件处理及拟合数据，测定解离(kd)速率常数。解离半衰期(t1/2)由解离速率常数计算：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60。描绘抗体在各种pH条件下的结合/解离特性的传感图如图3A至3G中之图形所示。
[0189] 这些实验的结果证实，相较于亲本抗体，组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体VH-D106H、VK-L30H和VH-D016H/VK-L30H在低pH时展现出从抗原上更加快速的解离(如图3A-3G所示，在pH 6.0和5.75实验中反应水平在360秒点上快速下降)。
[0190] 实施例4.变体抗-PCSK9抗体之受体阻断活性
[0191] 首先使用基于ELISA的免疫分析，测试了选择的组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体在中性pH时阻断重组人PCSK9与人LDLR(hLDLR)结合之能力。
[0192] 简言之，用表达的带有C-端人Fc标签的人LDLR的表皮生长因子样结构域A(SEQ ID NO：758的氨基酸313-355)("hLDLR EGFA-hFc")，以2μg/ml在PBS中包被96-孔微量滴定盘，于4℃过夜，接着以PBS中的0.5％(重量/体积)BSA溶液封闭。将此盘用于测量在中性pH
(pH7.2)时以不同浓度的抗-hPCSK9抗体(亲本或组氨酸取代变体)预平衡过的hPCSK9-mmH
溶液中游离的PCSK9，如表9A所示。
(pH7.2)时以不同浓度的抗-hPCSK9抗体(亲本或组氨酸取代变体)预平衡过的hPCSK9-mmH
溶液中游离的PCSK9，如表9A所示。
[0193] 作为测量中性pH(pH 7.2)时抗体之阻断性质的初始实验，将固定最终浓度500pM的hPCSK9-mmH(参见实施例3)与范围从0至约100nM的抗体系列稀释物预混合，接着于室温
孵育1小时以允许结合达到平衡。然后将平衡过的样本溶液转移至如上文描述制备的LDLR
EGFA-hFc包被的盘中。1小时孵育后，清洗受体包被的微量滴定盘，并使用HRP-缀合抗-myc二级抗体(Novus,#NB600-341)检测与盘结合的hPCSK9-mmH，使用TMB HRP底物(BD
Biosciences,#555214)生成比色信号。记录450nm之吸光度，以反映在预平衡的PCSK9-抗体溶液中可用于结合盘上包被的LDLR受体的游离hPCSK9-mmh浓度。IC50值定义为与无抗体相
比导致来自样品的PCSK9-mmH结合信号降低50％的抗体浓度，其使用Prism软件(GraphPad)
由数据测定，并显示于表9A中。(进行二个分开的实验；在各实验中并非每一种抗体皆进行了测试，如表9A中虚线[--]所示)。
孵育1小时以允许结合达到平衡。然后将平衡过的样本溶液转移至如上文描述制备的LDLR
EGFA-hFc包被的盘中。1小时孵育后，清洗受体包被的微量滴定盘，并使用HRP-缀合抗-myc二级抗体(Novus,#NB600-341)检测与盘结合的hPCSK9-mmH，使用TMB HRP底物(BD
Biosciences,#555214)生成比色信号。记录450nm之吸光度，以反映在预平衡的PCSK9-抗体溶液中可用于结合盘上包被的LDLR受体的游离hPCSK9-mmh浓度。IC50值定义为与无抗体相
比导致来自样品的PCSK9-mmH结合信号降低50％的抗体浓度，其使用Prism软件(GraphPad)
由数据测定，并显示于表9A中。(进行二个分开的实验；在各实验中并非每一种抗体皆进行了测试，如表9A中虚线[--]所示)。
[0194] 表9A：在中性pH下PCSK9阻断性ELISA
[0195] 实验#1 实验#2
抗体
亲本(300N) 2.26E-10 1.53E-10
VH-V101H 8.57E-10 --
VH-V104H 3.31E-10 --
VH-D106H 3.49E-10 3.95E-10
VH-M107H 7.04E-10 --
VH-D108H 3.34E-10 --
VH-Y112H 5.06E-10 --
VK-L30H 1.66E-10 1.98E-10
VH-D106H/VK-L30H -- 4.61E-10
抗体
亲本(300N) 2.26E-10 1.53E-10
VH-V101H 8.57E-10 --
VH-V104H 3.31E-10 --
VH-D106H 3.49E-10 3.95E-10
VH-M107H 7.04E-10 --
VH-D108H 3.34E-10 --
VH-Y112H 5.06E-10 --
VK-L30H 1.66E-10 1.98E-10
VH-D106H/VK-L30H -- 4.61E-10
[0196] 亲本抗体300N显示约0.20nM之IC50值。相较于300N，组氨酸取代变体抗体一般具有轻微的效力降低，但皆保持IC50值<1.0nM。VK-L30H变体保持接近亲本抗体之阻断效力(在二个分开的测量中IC50值为0.17和0.20nM)。
[0197] 然后将本发明组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体的一个亚群和比对物抗体，使用类似的ELISA为基础的免疫分析，测试了在中性和低pH条件下阻断重组人PCSK9与人LDLR
(hLDLR)结合之能力。
(hLDLR)结合之能力。
[0198] 简言之，将hLDLR EGFA-hFc以2μg/mL在PBS中包被在96-孔微量滴定盘上，于4℃过夜，接着以PBS中0.5％(重量/体积)BSA溶液封闭。使用此盘测量以不同浓度的抗-hPCSK9抗体在中性pH(pH7.2)或低pH(pH 5.75)预平衡过的hPCSK9-mmH溶液中游离的hPCSK9-mmH。
[0199] 对于该阻断实验，将固定最终浓度500pM之hPCSK9-mmH(参见实施例3)与范围从0至约200nM的抗体系列稀释物预混合，接着于室温孵育1小时以允许结合达到平衡。一组该
混合物于pH 7.2的缓冲液中进行预结合，而第二组于pH 5.75的缓冲液中进行预结合。然后将平衡过的样品溶液转移至LDLR EGFA-hFc包被的盘中。1小时孵育后，清洗受体包被的微
量滴定盘，并使用HRP-缀合的抗-myc二级抗体(Novus,#NB600-341)检测与盘结合的
hPCSK9-mmH，并使用TMB HRP底物(BDBiosciences,#555214)生成比色信号。记录450nm之吸光度以反映游离的hPCSK9-mmh浓度，并相对于抗体浓度作图。IC50值定义为导致无抗体存在下的游离PCSK9-mmH信号降低50％的抗体浓度，其使用Prism软件(GraphPad)由数据测定。
基线设定为在无hPCSK9-mmH存在下缓冲液的450nm吸光度。表9B显示二个分析的IC50值以及计算的比值——反映阻断能力的pH依赖性。
混合物于pH 7.2的缓冲液中进行预结合，而第二组于pH 5.75的缓冲液中进行预结合。然后将平衡过的样品溶液转移至LDLR EGFA-hFc包被的盘中。1小时孵育后，清洗受体包被的微
量滴定盘，并使用HRP-缀合的抗-myc二级抗体(Novus,#NB600-341)检测与盘结合的
hPCSK9-mmH，并使用TMB HRP底物(BDBiosciences,#555214)生成比色信号。记录450nm之吸光度以反映游离的hPCSK9-mmh浓度，并相对于抗体浓度作图。IC50值定义为导致无抗体存在下的游离PCSK9-mmH信号降低50％的抗体浓度，其使用Prism软件(GraphPad)由数据测定。
基线设定为在无hPCSK9-mmH存在下缓冲液的450nm吸光度。表9B显示二个分析的IC50值以及计算的比值——反映阻断能力的pH依赖性。
[0200] 表9B：中性和酸性pH下PCSK9阻断性ELISA
[0201]
[0202] 记录为<1.25E-10的IC50数据具有低于本试验的理论下限(假设一个抗体可以结合两个配体结合位点)的计算值。使用括号中实际得到的值产生比值。
[0203] 无结论＝因于不规则的钟型抗体剂量反应曲线而无法计算IC50。
[0204] 如表9B所示，大部分的比对物抗体在酸性pH与在中性pH相比并不具有或具有极小的阻断活性降低(参见，例如比对物2、5、6、7、8及9，在酸性pH比在中性pH具有少于3-倍的阻断活性降低)。比对物3和4在阻断能力上展现中度降低，其中酸性/中性IC50比分别为35.9
和19.2。相反地，二种本发明之示例性组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体VK-L30H和VH-D106H/
VK-L30H，在酸性pH具有急剧降低的PCSK9/LDLR阻断活性，其中酸性/中性IC50比大于约
200。
和19.2。相反地，二种本发明之示例性组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体VK-L30H和VH-D106H/
VK-L30H，在酸性pH具有急剧降低的PCSK9/LDLR阻断活性，其中酸性/中性IC50比大于约
200。
[0205] 本实验的结果证实，本发明之组氨酸变体抗-PCSK9抗体的pH-依赖性结合特性反映了这些抗体在中性和酸性pH能阻断PCSK9和LDLR间相互作用的程度。
[0206] 实施例5.变体抗-PCSK9抗体体外阻断PCSK9-介导的LDL摄取抑制的能力
[0207] 选择的组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体体外增加LDL摄取之能力，使用人肝细胞肝癌细胞系(HepG2,ATCC#HB-8065)测定。将HepG2细胞以2x104个细胞/孔，植入96-孔盘的
DMEM中5％脂蛋白缺乏的血清(LPDS,Millipore,#LP4)中，并于37℃、5％CO2过夜孵育以形
成HepG2单层。将2nM的重组人PCSK9(SEQ ID NO：755，表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签及D374Y突变；"hPCSK9-D374Y-mmH")或50nM的重组猕猴PCSK9(表达为带有C-端myc-myc
六组氨酸标签；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)，与各种浓度的抗体(从50nM至0.098nM系列稀释物)加入LPDS培养基中。过夜孵育后，将在LPDS培养基中的BODIPY-LPL(Invitrogen,
L3483)加到细胞中至0.01mg/mL的最终浓度。于37℃孵育6小时后，通过荧光读板仪
(Molecular Devices Flexstation III)，使用设定在390nm/520nm的激发/发射滤光器，检测BODIPY-LPL的摄取。各测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表10中(IC50＝导致LDL摄取
增加50％的抗体浓度)。
DMEM中5％脂蛋白缺乏的血清(LPDS,Millipore,#LP4)中，并于37℃、5％CO2过夜孵育以形
成HepG2单层。将2nM的重组人PCSK9(SEQ ID NO：755，表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签及D374Y突变；"hPCSK9-D374Y-mmH")或50nM的重组猕猴PCSK9(表达为带有C-端myc-myc
六组氨酸标签；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)，与各种浓度的抗体(从50nM至0.098nM系列稀释物)加入LPDS培养基中。过夜孵育后，将在LPDS培养基中的BODIPY-LPL(Invitrogen,
L3483)加到细胞中至0.01mg/mL的最终浓度。于37℃孵育6小时后，通过荧光读板仪
(Molecular Devices Flexstation III)，使用设定在390nm/520nm的激发/发射滤光器，检测BODIPY-LPL的摄取。各测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表10中(IC50＝导致LDL摄取
增加50％的抗体浓度)。
[0208] 表10：体外抗-PCSK9抗体对PCSK9活性的抑制作用
[0209]
[0210] 如表10所示，此试验中所有测试的组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体皆以低于5nM之IC50值阻断hPCSK9-D374Y-mmH-介导的LDL摄取抑制作用(亦即，提升了LDL摄取)，并以低于
22nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH-介导的LDL摄取抑制作用(亦即，提升了LDL摄取)。
22nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH-介导的LDL摄取抑制作用(亦即，提升了LDL摄取)。
[0211] 使用与上述相同的人肝细胞肝癌细胞系试验方案，但使用重组的野生型人PCSK9(SEQ ID NO：755，带有C-端myc-myc六组氨酸标签表达；"hPCSK9-mmh")，亦测定了本发明抗-PCSK9抗体的一个亚群和比对物抗体(参见表5)在体外增加LDL摄取之能力。将100nM恒
定的hPCSK9-mmH与不同浓度的抗体(从2000nM至0.034nM之系列稀释)加入LPDS培养基。各
测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表11A中(IC50＝导致LDL摄取增加50％之抗体浓度)。
定的hPCSK9-mmH与不同浓度的抗体(从2000nM至0.034nM之系列稀释)加入LPDS培养基。各
测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表11A中(IC50＝导致LDL摄取增加50％之抗体浓度)。
[0212] 表11A：体外抗-PCSK9抗体对PCSK9活性的抑制作用
[0213]
[0214] 如表11A所示，测试的抗-PCSK9抗体中10种以介于26nM至37nM之IC50值抑制hPCSK9-mmh。比对物1仅以18nM之IC50值部分抑制hPCSK9-mmh。
[0215] 使用与上述相同的人肝细胞肝癌细胞系试验，使用重组的野生型人PCSK9(SEQ ID NO：755，表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签；"hPCSK9-mmh")、人PCSK9(SEQ ID NO：755，表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签及D374Y突变；"hPCSK9-D374Y-mmH")或重组的猕猴
PCSK9(表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)，也测定了一个本发明抗-PCSK9抗体和比对物抗体的一个亚群(参见表5)在体外增加LDL摄取之能力。在
LPDS培养基中加入50nM恒定的hPCSK9-mmH、2nM恒定的hPCSK9-D374Y-mmH或50nM恒定的
MfPCSK9-mmH与不同浓度的抗体(对于hPCSK9-mmH或MfPCSK9-mmH阻断，抗体浓度从500nM开
始以1：2系列稀释；对于hPCSK9-D374Y-mmH阻断，抗体浓度从50nM开始以1：2系列稀释)。各测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表11B中(IC50＝导致LDL摄取增加50％之抗体浓度)。
PCSK9(表达为带有C-端myc-myc六组氨酸标签；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)，也测定了一个本发明抗-PCSK9抗体和比对物抗体的一个亚群(参见表5)在体外增加LDL摄取之能力。在
LPDS培养基中加入50nM恒定的hPCSK9-mmH、2nM恒定的hPCSK9-D374Y-mmH或50nM恒定的
MfPCSK9-mmH与不同浓度的抗体(对于hPCSK9-mmH或MfPCSK9-mmH阻断，抗体浓度从500nM开
始以1：2系列稀释；对于hPCSK9-D374Y-mmH阻断，抗体浓度从50nM开始以1：2系列稀释)。各测试的抗-PCSK9抗体之IC50值显示在表11B中(IC50＝导致LDL摄取增加50％之抗体浓度)。
[0216] 表11B：体外抗-PCSK9抗体对PCSK9活性的抑制作用
[0217]配体 hPCSK9-mmH hPCSK9-D374Y-mmH MfPCSK9-mmH
EC50(nM) 66 1.4 45.3
恒定PCSK9 50nM 2nM 50nM
抗体 IC50(nM) IC50(nM) IC50(nM)
316P(v1) 7.8 2.0 10.3
300N(v2) 10.3 2.0 15.7
VK-L30H 9 3.3 26.4
比对物7 8.9 0.97 10.4
比对物8 39.3 无阻断 77.2(部分阻断剂)
比对物9 17.4 10.6(部分阻断剂) 33.9
IgG1同种型对照 无阻断 无阻断 无阻断
EC50(nM) 66 1.4 45.3
恒定PCSK9 50nM 2nM 50nM
抗体 IC50(nM) IC50(nM) IC50(nM)
316P(v1) 7.8 2.0 10.3
300N(v2) 10.3 2.0 15.7
VK-L30H 9 3.3 26.4
比对物7 8.9 0.97 10.4
比对物8 39.3 无阻断 77.2(部分阻断剂)
比对物9 17.4 10.6(部分阻断剂) 33.9
IgG1同种型对照 无阻断 无阻断 无阻断
[0218] 如表11B所示，VK-L30H系以9nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH，而316(v1)和300N(v2)分别以7.8nM和10.3nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH。此试验中所测试的比对物抗体以从8.9nM
至39.3nM nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH。VK-L30H以3.3nM之IC50值阻断hPCSK9-D374Y-mmH，而316(v1)和300N(v2)二者以2nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH。比对物7以0.97nM之IC50值阻
断hPCSK9-D374Y-mmH，而比对物9以10.6nM之IC50值部分阻断hPCSK9-D374Y-mmH，比对物8
未展现任何可测量的hPCSK9-D374Y-mmH阻断作用。VK-L30H以26.4nM之IC50值阻断
MfPCSK9-mmH，而316(v1)和300N(v2)分别以10.3nM和15.7nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH。比对物7和9分别以10.4nM和33.9nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH，而比对物8以77.2nM之IC50值
部分阻断MfPCSK9-mmH。
至39.3nM nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH。VK-L30H以3.3nM之IC50值阻断hPCSK9-D374Y-mmH，而316(v1)和300N(v2)二者以2nM之IC50值阻断hPCSK9-mmH。比对物7以0.97nM之IC50值阻
断hPCSK9-D374Y-mmH，而比对物9以10.6nM之IC50值部分阻断hPCSK9-D374Y-mmH，比对物8
未展现任何可测量的hPCSK9-D374Y-mmH阻断作用。VK-L30H以26.4nM之IC50值阻断
MfPCSK9-mmH，而316(v1)和300N(v2)分别以10.3nM和15.7nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH。比对物7和9分别以10.4nM和33.9nM之IC50值阻断MfPCSK9-mmH，而比对物8以77.2nM之IC50值
部分阻断MfPCSK9-mmH。
[0219] 实施例6.在野生型和PCSK9人源化小鼠中变体抗-PCSK9抗体的药物动力学分析
[0220] 于野生型(WT)小鼠和纯合表达人PCSK9替代小鼠PCSK9的小鼠(人源化PCSK9小鼠)中，比较了三种组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体(VH-D106H、VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H)与其亲本抗体分子(300N)之药物动力学清除率，其中所有的小鼠具有相同的品系背景(75％
C57BL6及25％129Sv)。每种抗体各于5只WT和5只人源化PCSK9小鼠中试验。所有的抗体以
1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前一天采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、
7、10、14、21、30、39、50、60和74天采集血液。将血液中的血清级分分离并使用ELISA免疫试验进行总血清抗体分析。简言之，将1μg/mL的山羊抗-人IgG多克隆抗体(Jackson
ImmunoResearch,#109-005-098)通过4℃过夜孵育而包被在96-孔盘上。隔天将盘以BSA封
闭，然后清洗。然后将血清样本的六个系列稀释物及相应抗体的参照标准的12个系列稀释
物加到盘中，并于室温孵育1小时。清洗移除未结合的抗体后，使用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗-人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)，检测盘捕获的人
抗体。清洗盘，然后以四甲基联苯胺(TMB)比色底物，根据制造商(BDPharmingen)的建议显色。于450nm测量吸光度，使用样本盘中产生的参照标准曲线，计算血清样本中人IgG之浓
度。结果如图1和2A所示，其分别显示在WT和人源化小鼠中测试的四种抗-PCSK9抗体的浓度变化时程。每个队列于实验期间之平均血清抗体浓度(μg/ml±SEM)显示于表12(第14、21和
30天)、表13(第39、50和60天)和表14(第74天)中。
C57BL6及25％129Sv)。每种抗体各于5只WT和5只人源化PCSK9小鼠中试验。所有的抗体以
1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前一天采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、
7、10、14、21、30、39、50、60和74天采集血液。将血液中的血清级分分离并使用ELISA免疫试验进行总血清抗体分析。简言之，将1μg/mL的山羊抗-人IgG多克隆抗体(Jackson
ImmunoResearch,#109-005-098)通过4℃过夜孵育而包被在96-孔盘上。隔天将盘以BSA封
闭，然后清洗。然后将血清样本的六个系列稀释物及相应抗体的参照标准的12个系列稀释
物加到盘中，并于室温孵育1小时。清洗移除未结合的抗体后，使用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗-人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)，检测盘捕获的人
抗体。清洗盘，然后以四甲基联苯胺(TMB)比色底物，根据制造商(BDPharmingen)的建议显色。于450nm测量吸光度，使用样本盘中产生的参照标准曲线，计算血清样本中人IgG之浓
度。结果如图1和2A所示，其分别显示在WT和人源化小鼠中测试的四种抗-PCSK9抗体的浓度变化时程。每个队列于实验期间之平均血清抗体浓度(μg/ml±SEM)显示于表12(第14、21和
30天)、表13(第39、50和60天)和表14(第74天)中。
[0221] 表12：血清抗体浓度(第14、21和30天)
[0222]
[0223] 表13：血清抗体浓度(第39、50和60天)
[0224]
[0225] 表14：血清抗体浓度(第74天)
[0226]
[0227] 如图1所示，在WT小鼠中，四种测试的抗体在约第1-2天达到类似的Cmax，并显示类似的清除率，具有重叠的药物动力学曲线。在人源化PCSK9小鼠中(图2A)，亲本抗体300N，相较于所试验的组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体，显现较快的清除率。于第14天时，人源化PCSK9小鼠中300N之抗体浓度在检测限以下(<0.02μg/ml)，相对地在WT小鼠中为约8μg/ml，说明亲本抗体的人PCSK9-介导的快速清除。在人源化PCSK9小鼠中，组氨酸取代变体抗体
VH-D106H比亲本抗体显现较慢的清除率，其中在人源化PCSK9小鼠中第14天的平均抗体浓
度约0.7μg/ml。于人源化PCSK9小鼠中，VH-D106H之抗体浓度到约第50天降至检测限以下。
在人源化PCSK9小鼠中，相较于VH-D106H或亲本抗体，组氨酸取代变体抗体VK-L30H和VH-
D106H/VK-L30H展现较慢的清除率，其中在第14天的平均血清抗体浓度分别为大约10μg/ml和5μg/ml。VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H之血清抗体水平直到至少第74天仍在可检测范围
内(>0.02μg/ml)。具体地，在人源化PCSK9小鼠中VK-L30H之血清浓度直到第74天仍在0.25μg/ml以上。
VH-D106H比亲本抗体显现较慢的清除率，其中在人源化PCSK9小鼠中第14天的平均抗体浓
度约0.7μg/ml。于人源化PCSK9小鼠中，VH-D106H之抗体浓度到约第50天降至检测限以下。
在人源化PCSK9小鼠中，相较于VH-D106H或亲本抗体，组氨酸取代变体抗体VK-L30H和VH-
D106H/VK-L30H展现较慢的清除率，其中在第14天的平均血清抗体浓度分别为大约10μg/ml和5μg/ml。VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H之血清抗体水平直到至少第74天仍在可检测范围
内(>0.02μg/ml)。具体地，在人源化PCSK9小鼠中VK-L30H之血清浓度直到第74天仍在0.25μg/ml以上。
[0228] 接着，将VH-D106H和VK-L30H之药物动力学清除率与其亲本抗体(300N)以及六种比对物抗-PCSK9抗体做比较(比对物1、2、3、4、5和6如表5所定义)。此组实验于带有75％C57BL6和25％129Sv的品系背景之人源化PCSK9小鼠中进行。每种抗体分别在一组5只小鼠
中进行试验，且所有的抗体以1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、7、10、14、21、30、45和74天采集血液。使用ELISA检测人IgG Fc，分析各样本中的总人抗体。结果绘制为总人抗体水平的时间过程图，如图2B中所示。每个队列随时间之平均血清抗体浓度(μg/ml±SEM)如表15(第14、21和30天)及表16A(第45和74天)
所示。
中进行试验，且所有的抗体以1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、7、10、14、21、30、45和74天采集血液。使用ELISA检测人IgG Fc，分析各样本中的总人抗体。结果绘制为总人抗体水平的时间过程图，如图2B中所示。每个队列随时间之平均血清抗体浓度(μg/ml±SEM)如表15(第14、21和30天)及表16A(第45和74天)
所示。
[0229] 表15：血清抗体浓度(第14、21和30天)
[0230]
[0231] 表16A：血清抗体浓度(第45和74天)
[0232]
[0233] 如图2B所示，所有测试的抗体在约第1-2天达到最大血清浓度(Cmax)，其中六种抗体(300N、VH-D106H、VK-L30H、比对物1、比对物3和比对物4)具有类似的Cmax；其它的三种抗体(比对物2、比对物5和比对物6)具有低大约2-3倍的Cmax。相较于其它试验抗体，抗体
300N、比对物2、比对物5和比对物6具有较快清除率。如表15所示，这四种抗体的抗体浓度在第14天均在检测限以下(<0.02ug/ml)。相反地，VH-D106H抗体、比对物1和比对物4在第14天具有0.5μg/mL至2μg/mL的血清浓度；而VK-L30H抗体和比对物3在第14天具有大约7μg/mL的血清浓度。在第30天，VH-D106H抗体、比对物1、VK-L30H和比对物3仍为可检测的，各组的平均药物血清浓度分别为0.07、0.07、1.04和1.85μg/mL。VK-L30H和比对物3之抗体血清水平直到至少第74天(表16A)仍在可检测范围(>0.02μg/mL)。
300N、比对物2、比对物5和比对物6具有较快清除率。如表15所示，这四种抗体的抗体浓度在第14天均在检测限以下(<0.02ug/ml)。相反地，VH-D106H抗体、比对物1和比对物4在第14天具有0.5μg/mL至2μg/mL的血清浓度；而VK-L30H抗体和比对物3在第14天具有大约7μg/mL的血清浓度。在第30天，VH-D106H抗体、比对物1、VK-L30H和比对物3仍为可检测的，各组的平均药物血清浓度分别为0.07、0.07、1.04和1.85μg/mL。VK-L30H和比对物3之抗体血清水平直到至少第74天(表16A)仍在可检测范围(>0.02μg/mL)。
[0234] 然后，进行了另一研究，比较抗-PCSK9抗体，包括316P(v1)、316P(v2)、300N(v1)、300N(v2)、VK-L30H和三种比对物抗-PCSK9抗体(比对物7、8和9，如表5所定义)之药物动力学清除率。此组实验于带有75％C57BL6和25％129Sv品系背景之人源化PCSK9小鼠中进行。
各抗体分别在一组5只小鼠中进行试验，且所有的抗体以1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、8、10、14、21和30天采集血液。使用ELISA检测人IgG Fc，分析各样本中总人抗体。将结果绘制为总人抗体水平的时间过程图，如图2C中所示。各队列随时间之平均血清抗体浓度显示在表16B中(第14、21和30天)。
各抗体分别在一组5只小鼠中进行试验，且所有的抗体以1mg/kg之剂量经皮下施用。于抗体注射前采集血液(预采血)，并于注射后6h、1、2、3、4、8、10、14、21和30天采集血液。使用ELISA检测人IgG Fc，分析各样本中总人抗体。将结果绘制为总人抗体水平的时间过程图，如图2C中所示。各队列随时间之平均血清抗体浓度显示在表16B中(第14、21和30天)。
[0235] 表16B：血清抗体浓度(第14、21和30天)
[0236]
[0237] 如图2C所示，所有的试验抗体在约第1天达到最大血清浓度(Cmax)，其中七种抗体[316P(v1)、316(v2)、300N(v1)、300N(v2)、比对物7、比对物8和比对物9]具有类似的Cmax；
而VK-L30H具有高大约1.5至2倍的Cmax。相较于其它试验抗体，316P(v1)抗体、316P(v2)、
300N(v2)和比对物7具有较快清除率。如表16B所示，这四种抗体的抗体浓度在第14天在检
测限以下(<0.02ug/ml)。相反地，抗体300N(v1)、比对物8和比对物9在第14天具有范围从
0.4μg/mL至0.7μg/mL之血清浓度；而VK-L30H抗体在第14天具有大约7μg/mL之血清浓度。在第30天，抗体VK-L30H和比对物8仍为可检测的，此二组的平均药物血清浓度分别为0.09和
3.34μg/mL。
而VK-L30H具有高大约1.5至2倍的Cmax。相较于其它试验抗体，316P(v1)抗体、316P(v2)、
300N(v2)和比对物7具有较快清除率。如表16B所示，这四种抗体的抗体浓度在第14天在检
测限以下(<0.02ug/ml)。相反地，抗体300N(v1)、比对物8和比对物9在第14天具有范围从
0.4μg/mL至0.7μg/mL之血清浓度；而VK-L30H抗体在第14天具有大约7μg/mL之血清浓度。在第30天，抗体VK-L30H和比对物8仍为可检测的，此二组的平均药物血清浓度分别为0.09和
3.34μg/mL。
[0238] 本实施例显示，相较于不具有pH-依赖性结合特性或仅具有中间pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体(例如，300N和比对物2、5和6)，带有pH-依赖性结合特性之抗-PCSK9抗体(例如，VH-106H、VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H)具有增进的药物动力学性质(例如，更长时间更高的血清抗体水平)。
[0239] 实施例7.体外变体抗-PCSK9抗体的降胆固醇活性
[0240] 于纯合表达人PCSK9以取代小鼠PCSK9并杂合表达小鼠LDLR的小鼠(Pcsk9hum/hum Ldlr+/-)中，测定体外抗-人PCSK9抗体对血清LDL-C水平的影响。将小鼠于实验前5天预采
血，并以其LDL-C水平为基准分为治疗组，使得组间的平均LDL-C水平相等。然后在研究的第
0天，向小鼠皮下注射10mg/kg剂量的抗-PCSK9抗体或具有无关特异性的同种型对照抗体。
就此研究而言，使用了二种未修饰的亲本抗-PCSK9抗体(316P和300N)和二种组氨酸取代变
体抗-PCSK9抗体(VK-L30H和VH-D106H)。此实验中使用了二个版本的316P，316P(v1)和316P(v2)。316P(v1)具有人IgG1Fc，而316P(v2)具有人IgG4Fc。所有其它的试验抗体具有人
IgG4Fc。(用于此实施例之"300N"抗体与用于文中实施例3之"300N(v2)"抗体相同)。各治疗组使用五只小鼠。
血，并以其LDL-C水平为基准分为治疗组，使得组间的平均LDL-C水平相等。然后在研究的第
0天，向小鼠皮下注射10mg/kg剂量的抗-PCSK9抗体或具有无关特异性的同种型对照抗体。
就此研究而言，使用了二种未修饰的亲本抗-PCSK9抗体(316P和300N)和二种组氨酸取代变
体抗-PCSK9抗体(VK-L30H和VH-D106H)。此实验中使用了二个版本的316P，316P(v1)和316P(v2)。316P(v1)具有人IgG1Fc，而316P(v2)具有人IgG4Fc。所有其它的试验抗体具有人
IgG4Fc。(用于此实施例之"300N"抗体与用于文中实施例3之"300N(v2)"抗体相同)。各治疗组使用五只小鼠。
[0241] 将小鼠于注射后第4、7、14、20、26、33、42、46和52天取血。血清中LDL-C水平使用1800Chemistry System(Siemens)测定。然后就各治疗组就各时间点计算血清
中平均LDL-C，结果以(平均值±SEM)表示并显示在表17。数值表示为平均LDL-C水平(mg/
dL)(±SEM)。表18显示与基线相比LDL-C水平之下降百分比。
中平均LDL-C，结果以(平均值±SEM)表示并显示在表17。数值表示为平均LDL-C水平(mg/
dL)(±SEM)。表18显示与基线相比LDL-C水平之下降百分比。
[0242] 表17：经抗-PCSK9抗体处理的Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠中LDL-C水平(mg/dL)
[0243]
[0244] 表18：与基线[第-5天]相比LDL-C水平的百分比变化
[0245]
[0246] 如表17和18中所示，将单一10mg/kg剂量的组氨酸取代变体抗体(VK-L30H和VH-D106H)施用给Pcsk9hum/hum Ldlr+/-小鼠，在第7天各造成与基线相比大于约45％的LDL-C降低，在第14天造成与基线相比大于约44％的LDL-C降低。再者，经单一剂量的VK-L30H治疗的小鼠显示出与基线相比至少33％的持续LDL-C降低，直到第33天。在单一10mg/kg剂量后，经VK-L30H治疗的小鼠的LDL-C水平在第46天保持低于基线不超过20％。给予VH-D106H的小鼠
如同VK-L30H具有类似的初始LDL下降，但到第33天与基线相比LDL-C水平仅下降约13％。单一剂量的316P(v1)也造成与VK-L30H大约相同的LDL-C自基线的初始下降百分比(在抗体施
用后第7天，与基线相比大约下降49％)，但降LDL-C效果不像组氨酸取代突变体的效果持续时间长。316P(v2)和300N显示最大的短期降LDL-C效果(对于每种抗体，在第7天与基线相比大约下降58％)，但相较于组氨酸取代突变体具有较短的持续效应。
如同VK-L30H具有类似的初始LDL下降，但到第33天与基线相比LDL-C水平仅下降约13％。单一剂量的316P(v1)也造成与VK-L30H大约相同的LDL-C自基线的初始下降百分比(在抗体施
用后第7天，与基线相比大约下降49％)，但降LDL-C效果不像组氨酸取代突变体的效果持续时间长。316P(v2)和300N显示最大的短期降LDL-C效果(对于每种抗体，在第7天与基线相比大约下降58％)，但相较于组氨酸取代突变体具有较短的持续效应。
[0247] 亦使用标准的ELISA分析，测定了各治疗组小鼠中循环的人抗体水平。于4℃以1μg/ml在PBS中的山羊抗-人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)包被盘18小
时。然后将盘于室温(RT)封闭3小时。为产生标准曲线，将各抗体以2-倍系列稀释加入盘中。
来自抗体注射后第4、7、14、20、26、33、42和46天的小鼠血清以1:100，1:200，1:500，1:2000，
1:4000和1:8000稀释度加入盘中，然后于RT孵育2小时。使用山羊抗-人IgG HRP缀合抗体
(Jackson ImmunoResearch,#109-035-098)检测捕获的抗体，并使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(MP Biomedicals,#152346)底物生成比色信号。以2.0M H2SO4终止反应，然后记录450nm的吸光度，用以测量小鼠血清中人抗体的总量。计算测试的治疗组在各时间点的平均抗体水平，结果显示在表19中。数值以平均总血清抗体水平(μg/mL)(±SEM)表示。
时。然后将盘于室温(RT)封闭3小时。为产生标准曲线，将各抗体以2-倍系列稀释加入盘中。
来自抗体注射后第4、7、14、20、26、33、42和46天的小鼠血清以1:100，1:200，1:500，1:2000，
1:4000和1:8000稀释度加入盘中，然后于RT孵育2小时。使用山羊抗-人IgG HRP缀合抗体
(Jackson ImmunoResearch,#109-035-098)检测捕获的抗体，并使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(MP Biomedicals,#152346)底物生成比色信号。以2.0M H2SO4终止反应，然后记录450nm的吸光度，用以测量小鼠血清中人抗体的总量。计算测试的治疗组在各时间点的平均抗体水平，结果显示在表19中。数值以平均总血清抗体水平(μg/mL)(±SEM)表示。
[0248] 表19：Pcsk9hum/hum Ldlr+/-小鼠中人抗体的总血清水平(μg/mL)
[0249]
[0250]
[0251] 亲本抗体316P(v1)、316P(v2)和300N分别到第14、20和26天从循环中清除，在所指的时间点从这些抗体治疗之小鼠的血清样本中检测不到人抗体。相反地，直到至少第55天，在组氨酸取代变体抗体VK-L30H和VH-D106H治疗之小鼠的血清样本中仍检测到人抗体。人抗体水平与各时间点所观察到的降胆固醇程度大致相关。因此，本发明之组氨酸取代变体
抗体比亲本抗体更长时间地留在经治疗动物的循环中，并比亲本抗体持续相应更长的时间
降低血清LDL-C。
抗体比亲本抗体更长时间地留在经治疗动物的循环中，并比亲本抗体持续相应更长的时间
降低血清LDL-C。
[0252] 最后，于各时间点测量各治疗组之小鼠血清中的人PCSK9总量。结果以ng/mL人PCSK9表示，如表20所示。
[0253] 表20：抗-PCSK9抗体治疗的Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠中总人PCSK9水平(ng/mL)
[0254]
[0255]
[0256] 在组氨酸取代变体抗体VK-L30H和VH-D106H治疗之小鼠中，抗体施用后持续至少42天，总PCSK9维持在1500ng/mL以上。相反地，在所有其它的治疗组中，到第20天或更早，总PCSK9水平降至1000ng/mL以下。
[0257] 接着，使用Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠，相对于各种比对物抗-PCSK9抗体(如表5中所定义之比对物1、2、3和4)，评估组氨酸取代变体抗-PCSK9抗体VK-L30H对血清LDL-C的影响。将小鼠于实验前8天预取血，并以其LDL-C量为基准分入治疗组，使各组间的平均LDL-C水平相等。然后在研究的第0天，向小鼠(n＝5/每治疗组)皮下注射10mg/kg剂量的抗-PCSK9抗体或具有无关特异性之同种型(hIgG4)对照抗体。将小鼠于注射后第4、7、14、21、28、42、49、63和77天取血，以 1800ChemistrySystem(Siemens)测定血清中LDL-C量。然后就
各治疗组就各时间点计算血清中平均LDL-C，结果以平均LDL-C量(mg/dL)(±SEM)表示，如
表21所示。表22显示与基线(亦即第-8天)相比LDL-C水平的下降百分比。
各治疗组就各时间点计算血清中平均LDL-C，结果以平均LDL-C量(mg/dL)(±SEM)表示，如
表21所示。表22显示与基线(亦即第-8天)相比LDL-C水平的下降百分比。
[0258] 表21：抗-PCSK9抗体治疗的Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠中LDL-C量(mg/dL)
[0259]
[0260]
[0261] 表22：与基线[第-8天]相比LDL-C水平的百分比变化
[0262]
[0263] 如表21和22所示，将单一10mg/kg剂量的组氨酸取代变体抗体VK-L30H施用给Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠，造成在测量的所有77天中与基线相比大于30％的LDL-C持续下
降，其中在第14天达到与基线相比的最大LDL-C下降，为约52％。相比之下，施用比对物2的小鼠在抗体施用后第7天达到最大的LDL-C下降，为约40％，但在抗体施用后第14天或之后
的任何时间点，降低程度并不明显。单一剂量的比对物1显示延长的LDL-C下降(其中在第14天，与基线相比约37％的最大LDL-C下降)，但从第42天至第77天实验结束，与基线相比，
LDL-C下降之程度仅约9％至24％。比对物3和4没有表现出可测量的降LDL-C效果，但是以
ELISA确认循环中有抗体存在。
降，其中在第14天达到与基线相比的最大LDL-C下降，为约52％。相比之下，施用比对物2的小鼠在抗体施用后第7天达到最大的LDL-C下降，为约40％，但在抗体施用后第14天或之后
的任何时间点，降低程度并不明显。单一剂量的比对物1显示延长的LDL-C下降(其中在第14天，与基线相比约37％的最大LDL-C下降)，但从第42天至第77天实验结束，与基线相比，
LDL-C下降之程度仅约9％至24％。比对物3和4没有表现出可测量的降LDL-C效果，但是以
ELISA确认循环中有抗体存在。
[0264] 使用ELISA法检测总人IgG Fc，测定各治疗组之小鼠中循环的人抗体水平。计算试验的治疗组在第7、14、21、28、35、42、49、63和77天之小鼠血清中的平均抗体水平，结果以平均总血清抗体量(μg/mL)(±SEM)表示，如表23所示。
[0265] 表23：Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠中人抗体的总血清水平(μg/mL)
[0266]
[0267] 比对物2和比对物4分别到第28和77天从循环中清除，在所指的时间点之后从这些抗体治疗的小鼠的血清样本中检测不到人抗体。相反地，在第77天，在组氨酸取代变体抗体VK-L30H以及比对物1和3治疗的小鼠之血清样本中检测到人抗体。在第77天，相较于所有其它治疗组，VK-L30H治疗组具有最高的人抗体可测量水平。
[0268] 最后，于各时间点测量各治疗组小鼠之血清中的人PCSK9总量。结果以平均人PCSK9量(ng/mL)(±SEM)表示，如表24所示。
[0269] 表24：抗-PCSK9抗体治疗的Pcsk9hum/humLdlr+/-小鼠中总人PCSK9量(ng/mL)
[0270]
[0271]
[0272] 在此实验中，在组氨酸取代变体抗体VK-L30H和比对物3治疗的小鼠中，于抗体施用后，总人PCSK9水平维持在2500ng/mL以上达至少77天。相反地，比对物2和比对物4治疗组之总PCSK9水平分别到第21和42天掉到1000ng/mL以下。比对物1治疗组之总PCSK9量从未高
于1000ng/mL。
于1000ng/mL。
[0273] 本发明之范围并不限制于文中所述的具体实施方案。实际上，除了文中所述之外，本领域技术人员由前述说明及附图将明了本发明的各种变化方式。这些变化旨在落入后附权利要求书的范围内。